Cinética da Síntese da Fita Atrasada de DNA In Vitro pelas Proteínas de Replicação do Bacteriófago T7

Resumo

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

Resumo

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

Introdução

A replicação de ADN é uma característica conservada de toda a vida celular. Enquanto a identidade e número de componentes de replicação variam amplamente, os mecanismos gerais são compartilhadas entre a evolução ^1. Aqui, descrevemos, experimentos cinéticos descontínuos à base de gel, utilizando substratos radioativos, visando a compreensão da cinética de síntese de DNA atraso vertente in vitro por componentes do replisome T7. A maquinaria de replicação do bacteriófago T7 é muito simples, consistindo em apenas quatro proteínas (a polimerase de ADN, GP5, e o seu factor de processabilidade, tioredoxina de E. coli, os GP4 primase-helicase bifuncionais, e a proteína de ligação ao ADN de cadeia simples, GP2. 5) ^2. Esta característica torna-se um sistema de modelo atractivo para estudar os mecanismos bioquímicos conservadas envolvidas na replicação do ADN.

Especial ênfase é colocada sobre a formação de primers ribonucle�ido por DNA T7 primase, uma critical passo na iniciação de síntese de ADN. Além disso, pode-se também analisar a utilização desses iniciadores por ADN-polimerase de T7 ou outras proteínas de replicação através da sua inclusão na mistura de reacção. A primase de T7-helicase, GP4, catalisa a formação de iniciadores para a síntese de DNA em sequências de ADN específicos chamados locais de reconhecimento, ou primase PRS, (5'-TCG-3 '). A citosina no PRS é enigmática, é essencial para o reconhecimento do local, mas não é copiado para o produto ^3. O primeiro passo na síntese do iniciador por GP4 envolve a formação do dinucleótido pppAC, que é então estendida a um trímero, e, eventualmente, a iniciadores tetranucleotídeo funcionais pppACCC, pppACCA, ou pppACAC dependendo da sequência no molde ^4. Estes iniciadores podem então ser utilizados por ADN-polimerase de T7 para iniciar a síntese de ADN, que é também um processo assistido por GP4 ^{5, 6.} A este respeito, o primasedomínio estabiliza os tetraribonucleotides extremamente curtos com o modelo, impedindo a sua dissociação, envolve polimerase ADN de uma forma conducente a garantir o primer / modelo no sítio ativo ⁷ polimerase. Estes passos (a síntese de ARN do iniciador, a polimerase de handoff iniciador, e extensão) são repetidos em ciclos múltiplos de replicar a costa de retardamento e tem de ser coordenado com a replicação da costa principal.

Os ensaios descritos aqui são altamente sensíveis e podem ser executadas num período de tempo moderado. No entanto, eles são relativamente de baixo rendimento e um grande cuidado deve ser exercido no uso e descarte de materiais radioativos. Dependendo da velocidade à qual a reacção prossegue, pode-se empregar um instrumento de têmpera rápida para atingir as amostras em escalas de tempo favorável para análise significativa de cursos de tempo da reacção, quer em contínuo ou no estado pré-estável. Recentemente, usamos ensaios descritos aqui para fornecer evidence a importância da introdução do iniciador a partir do domínio de primase de GP4 na iniciação de fragmentos de Okazaki. Além disso, encontramos evidências de um papel regulador para a proteína, gp2.5 ligação do T7 DNA de cadeia simples, na promoção da formação de primer eficiente e utilização ^8.

Protocolo

NOTA: Siga todas as normas institucionais relativas à utilização segura e eliminação de material radioactivo, incluindo, mas não limitado a, o uso de equipamento de protecção individual, como luvas, óculos de segurança, jaleco, e escudos de acrílico adequados.

NOTA: O tampão padrão consiste em 40 mM HEPES-KOH, pH 7,5, glutamato de potássio 50 mM, DTT 5 mM, EDTA 0,1 mM (tampão esta é pré-fabricados, a uma concentração 5x) e 0,3 mM de cada dNTP. Proteínas de replicação de T7 são purificados como descrito ^{8, 9, 10.} ADN de cadeia simples contendo um único sítio de reconhecimento da primase de T7 (5'-GGGTC-3 ', 5'-GTGTC-3', 5'-TGGTC-3 ') podem ser adquiridos a partir de uma variedade de companhias de síntese de ADN (o comprimento o ADNcs pode depender da enzima de escolha, para a primase de T7, um pentâmero é o comprimento mínimo do molde para sintetizar um iniciador de comprimento completo ¹1, como o críptico C é essencial, no entanto, se o iniciador está a ser estendido pela polimerase de, nucleótidos adicionais deve estar presente na extremidade 3 'do molde. As reacções são iniciadas pela adição de uma concentração final de 10 mM de MgCl ₂ e incubou-se a 25 ° C. a amostragem manual funciona bem para pontos de tempo de 5 segundos ou mais. Se pontos de tempo mais curto do que são necessárias, é recomendado o uso de um instrumento de fluxo rápido de retardamento para obter dados precisos.

1. Multiple-turnover Primer Síntese Reaction por amostragem manual

1. Antes de iniciar a experiência, alíquota de 2 mL de tampão de corante de formamida (formamida a 93% (v / v) de formamida, 50 mM de EDTA, 0,01% de cianol de xileno e 0,01% de azul de bromofenol) em 8 tubos de polipropileno de 1,5 mL. Em geral, o número de tubos é igual ao número de pontos de tempo analisados.
2. Prepara-se uma mistura de 20 uL de tampão 1x que consiste, ATP 0,1 mM e CTP, 0,25 mCi / ml de ^[32 P α-] CTP, 0,1 uM SSDMolde de NA, e 0,1 uM GP4 (expresso como concentração hexâmero - 0,6 uM monómero).
3. Incubar a mistura à temperatura ambiente durante 5 min.
4. Retirar 2 ul da mistura utilizando um pipetador e misturar com 2 ul de tampão de formamida de corante num tubo de 1,5 ml, preparado no passo 1.1 para o controlo sem reacção (tempo zero).
5. Adicionar 2 mL de 0,1 M _MgCl2 a mistura reaccional (para uma concentração final de 10 mM).
6. retirar manualmente amostras de 2 mL da misturas reaccionais utilizando um pipetador em intervalos de 10s e misturar-se com corante de formamida predispensed em tubos de 1,5 ml, preparado no passo 1.1.
7. amostras de calor a 95 ° C durante 5 min num bloco de calor.
8. Carregar alíquotas das amostras num gel desnaturante. Os pequenos produtos de iniciadores tetraribonucleotide sintetizados pelo primase de T7 estão bem resolvidas num 0,4 mm de espessura de 25% de acrilamida: bisacrilamida (19: 1), ureia 3 M, 1 x TBE (Tris-borato de 100, 1 mM de EDTA).
9. Coloque toda gel em chromatograpapel phy e cubra com filme plástico. gel seco utilizando um secador de gel.
10. Prepara-se uma série de diluições do restante da mistura de reacção e detectar o mesmo volume carregados sobre o gel para papel de cromatografia, ou seja, Spot 4 uL da diluição se 4 ul de amostra foram carregados.
    NOTA: Este servirá como a curva padrão para determinar a concentração de produtos secundários formados durante a reacção. Por exemplo, diluições de cinco vezes, utilizando tampão TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, EDTA 1 mM) funcionam bem, abrangendo uma gama de 1:25 a 1: 15625 (5 ² -5 ^6), mas as diluições devem ser ajustado, dependendo do nível de actividade.
11. Expor gel seco e padrão usando uma tela phosphorimager. Quantificar a radioactividade na série de diluição e construir uma curva padrão, tal como descrito ^{8, 12}
    NOTA: Inclusão de polimerase de ADN de T7 à mistura reaccional permite EXAmina o uso de iniciadores tetraribonucleotide por esta enzima. Optimamente, a concentração da polimerase deve ser saturando para simplificar a interpretação dos dados. A concentração da polimerase de 0,4 uM ou mais elevadas dá bons resultados. Além disso, o efeito de outras proteínas, tais como proteínas de ligação de cadeia simples de ADN, de cada iniciador de síntese ou em atraso de cadeia de iniciação pode ser examinado desta maneira.

2. Multiple-turnover Reaction Primer Síntese Usando um Instrumento Rapid-têmpera

1. Preparação de misturas reaccionais
   1. Preparar 400 uL de solução A, contendo tampão 1x, 0,2 uM GP4 hexâmero, 0,2 uM molde de ADNcs, dNTP 0,6 mM, 0,2 mM de ATP e CTP (incluindo 0,5 mCi / ml de ^[32 P α-] CTP.
   2. Prepare a 400 ul de solução B, contendo tampão 1x e _MgCl2 20 mM.
2. A operação do instrumento de fluxo rápido-têmpera
   1. Ligue rapinstrumento de fluxo id-têmpera; depois de aparecer o menu principal, digite 7 no teclado do instrumento para mover o motorista seringa para a posição inicial.
   2. posição seringa aberta tampão para "LOAD".
3. Seringas Carregando tampão
   1. Anexar um tampão contendo 10 mL seringa à porta seringa unidade. Alterar posição do botão de seringa para "LOAD".
   2. Usando 10 mL seringas, encher tampão instrumento reservatório A e B com 10 mM de Tris, pH 7,5, EDTA 1 mM e encher a seringa C com solução de paragem (EDTA 250 mM, e SDS a 0,2%). Remover bolhas de ar empurrando êmbolos dentro e para fora.
   3. posições Alterar botão para "FOGO". Digite 2 para ajustar a posição da barra de motorista seringa. Pressione o botão "AJUSTE PARA BAIXO" botão para baixar a seringa até tampão sai do loop de saída: (7-desce continuamente; 8 grande passo para baixo; 9-pequeno passo para baixo). Tipo "ESC" para voltar ao menu principal.
4. tubos de lavagem
   1. Attach linha de saída para vácuo. Alterar botões de amostra para "FLUSH". Fechar tampão de seringa definindo as pegas para a posição horizontal. Ligue vácuo e mergulhar as alças 2 de descarga em _H2O durante 10 s, em seguida, mergulhar em MeOH durante 10 s. lacetes secas por sugar o ar para ~ 15 s, ou até secar.
5. de colocar as amostras
   1. Mudança amostra posição do botão de "Load". Coloque a solução A à seringa de 1 mL. Ligue seringa em uma das portas de carga da amostra. Repita o procedimento para a solução B, e coloque no porto de carga amostra oposto.
6. Recolha de pontos temporais
   1. No menu principal, digite 1 para execução de têmpera-flow. Digite o tempo de reação (s) e pressione "ENTER". O número de loop reação a utilizar será exibida. Mudar para loop de reacção necessário. Repita o procedimento de lavagem no passo 2.2.4.
   2. Vire botões de amostra para "carregar". reação carga mistura em loops até pouco fora do compartimento de mistura central. Coloque todos os botões para "FIRE ". Confirmar que todos os botões estão na posição correcta.
   3. Coloque 1,5 mL tubo na extremidade do circuito de saída. Pressione o botão "GO" para executar a reação. Repita o procedimento de lavagem no passo 2.2.4. Recarregar seringas tampão A e B, até que atingiu o motorista.
   4. Repetir passos 2.2.6.2-2.2.6.3 para cada ponto de tempo desejado. Exceção: Não coloque solução contendo o reagente de partida (ou seja, MgCl _2, neste caso) quando apagar o controle de tempo de ponto-zero.
   5. Quando terminar a recolha de amostras, digite "ESC" para voltar ao menu principal. Pressione o botão "7" para voltar motorista tampão seringa para sua posição inicial.
7. Instrumento de limpeza
   1. Remover seringas mistura de reacção. Vire amostra de carga botão para "LOAD" posição. Sob vácuo, lavar cada circuito de amostra com 10 mL de NaOH 0,2 N, seguido de 10 ml de 0,3 NH ₃ PO ₄ e 10 mL de MeOH.
   2. Vire botões de seringa para a posição "LOAD". Pressione os 3 syringe êmbolos para recuperar de reacção e extingue-se tampões. Lavar seringas com 5 mL de H ₂ O, pelo menos, duas vezes.
   3. Preencha seringas novamente com 5 mL _{de H2O} e vire botões para "fogo" posição. Mudar posições dos botões e ligue vácuo para remover H ₂ O. Lavar como no passo 2.2.4. Desligue instrumento.
      Nota: Os produtos são analisados conforme descrito nas etapas 1.7-1.12. Além disso, a polimerase de ADN de T7 e outras proteínas de replicação pode ser adicionado na mistura de reacção para analisar o seu efeito sobre a síntese de iniciador ou de extensão.

3.-turnover Individual Primer Síntese Reaction

NOTA: Os ensaios de iniciador de síntese / extensão-turnover único são levadas a cabo de modo semelhante às reacções de múltiplas volume de negócios, com algumas diferenças importantes: estes ensaios segue a conversão de ATP marcado radioactivamente no iniciador ou de extensão de produtos, no entanto, a concentração de substratos e proteínas são considerăBly superior. Além disso, a fim de atingir a resolução de milisegundos para permitir a análise da reacção de síntese de iniciadores, deve-se utilizar uma máquina de fluxo rápido-têmpera.

1. Preparação das misturas de reacção.
   1. Preparar 400 uL de solução A, contendo tampão 1x, 3 uM hexâmero GP4, 6 uM molde de ADNcs, dNTPs 0,6 mM, CTP a 1 mM, e 2 nM de [γ- ³² P] ATP. Prepare a 400 ul de solução B, contendo tampão 1x e _MgCl2 20 mM.
2. Operação de fluxo Rapid-têmpera
   1. Realizar reacções tal como descrito na etapa 2.2. Se desejado, adicionar ADN-polimerase T7 ou a proteína de ligação-ADN de cadeia simples de T7 a uma concentração de 15 uM e 20 uM, respectivamente. Neste caso, os produtos de extensão acumulam num regime de tempo que permite a amostragem manual da reacção.

Análise 4. Dados

1. curvas de progresso do produto Fit para menos- não-linearquadrados modelos usando software disponível comercialmente capazes de mínimos quadrados ajustes e / ou integração numérica. Os detalhes da operação irá variar de acordo com o software utilizado, mas abaixo são formas generalizadas de equações utilizadas para ajustamento dos dados.
2. Determinar a velocidade de formação de produto de múltiplas reacções de síntese de rotatividade iniciador ajustando a curva de progresso de uma equação linear. Se houver curvatura significativa, utilizar o método da taxa inicial ^{13, 14,} através do ajuste dos dados a uma função exponencial simples: y = A (e ^{- k t),} onde y é a concentração de produto, A é a amplitude de reacção, k é a constante de velocidade observada, t é o tempo, em segundos. A inclinação da linha tangente em tempo = 0 é a velocidade inicial.
   NOTA: reações de síntese de primer estado Fit pré-constante para uma equação linear ou para a equação de estado pré-estacionário estouro y = A (e ^- _bu ^krst ^t) + taxa _ss t, em que A é a amplitude da reacção, k _ruptura é a constante de velocidade observada para a explosão estado pré-estável, _SS taxa é o estado estacionário _ss Velocidade = k _cat [Enzima]), t é o tempo , em segundos. Fit reações de síntese primer volume de negócios única curva de progresso para uma única função exponencial y = A (e ^{- k t).} No caso de GP4, ajustar os dados por integração numérica ^15, para um modelo com três passos de condensação de NTP, em que cada intermédia está em equilíbrio com a enzima, utilizando software disponível comercialmente.

Resultados

Os resultados mostrados na Figura 1A foram obtidos como descrito no passo 1 do protocolo, isto é, por amostragem manualmente uma reacção de síntese de primer catalisada por GP4 sob condições de turnover múltiplo. Aqui, uma gama de produtos, após electroforese em gel pode ser observado usando CTP marcado com ³² P na posição-α em reacções de síntese do iniciador (Figura 1A). O precursor marcado, CTP, mostr...

Discussão

O factor mais importante na realização destas experiências é a disponibilidade da enzima purificada altamente activa. Durante o nosso trabalho com GP4, por exemplo, verificou-se que o armazenamento da enzima purificada em tampão (fosfato de potássio 20 mM, pH 7,4, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM) contendo 50% de glicerol a -20 ° C, leva a uma redução a actividade específica da preparação ao longo de alguns meses. Portanto, agora flash-freeze pequenas alíquotas de GP4 purificada em Tris-HCl a 25, pH 7,5, NaCl 50 mM, E...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris pre-set crystals pH 7.5	SIGMA	T4128
Tris base	SIGMA	93362
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate	SIGMA	G1501
Magnesium chloride hexahydrate	Mallinckrodt Chemicals	5958-04
1,4-Dithiothreitol	J.T. Baker	F780-02
Sodium Dodecyl Sulfate	MP Biomedicals	811030
(Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate	Mallinckrodt Chemicals	4931-04
[α-32P] CTP	PerkinElmer	BLU508H	radioactive, take protective measures
[γ-32P] ATP	PerkinElmer	BLU502A	radioactive, take protective measures
100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP	Affymetrix	77100	four dNTPs part of set
100 mM ATP and CTP	Epicentre	RN02825	part of NTP set
ssDNA constructs	Integrated DNA Technologies	N/A	custom sequences
methanol	Macron Fine Chemicals	3017-08
formamide	Thermo Scientific	17899
bromophenol blue	SIGMA	B8026
cylene xyanol	SIGMA	X4126
acrylamide	SIGMA	A9099	Toxic
N,N′-Methylenebisacrylamide	SIGMA	M7279	Toxic
Urea	Boston Bioproducts	P-940
Boric acid	Mallinckrodt Chemicals	2549
Rapid Quench-Flow Instrument	Kintek Corp.	RQF-3
Kintek Explorer	Kintek Corp.	N/A
Kaleidagraph	Synergy Software	N/A