Cinética de la síntesis de ADN de hebra Quedando<em&gt; In Vitro</em&gt; Por el bacteriófago T7 proteínas de replicación

Resumen

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

Resumen

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

Introducción

La replicación del ADN es una característica conservada de toda la vida celular. Mientras que la identidad y el número de componentes de replicación varían ampliamente, los mecanismos generales se comparten a través de la evolución ^1. A continuación, describimos, experimentos cinéticos discontinuos a base de gel, utilizando sustratos radiactivos, dirigidas a la comprensión de la cinética de la síntesis de ADN de hebra retrasada in vitro por los componentes de la replisome T7. La maquinaria de replicación del bacteriófago T7 es muy simple, que consiste en sólo cuatro proteínas (la ADN polimerasa, GP5, y su factor de procesividad, E. coli tiorredoxina, los gp4 bifuncionales primase-helicasa, y la proteína de unión de ADN de una sola hebra, GP2. 5) ^2. Esta característica lo convierte en un sistema modelo atractivo para estudiar los mecanismos bioquímicos conservados implicados en la replicación del ADN.

Se hace especial hincapié en la formación de cebadores de ribonucleótidos por T7 ADN primasa, una critical paso en la iniciación de la síntesis de ADN. Además, también se puede examinar el uso de estos cebadores por ADN polimerasa de T7 o de otras proteínas de replicación mediante su inclusión en la mezcla de reacción. La T7 primasa-helicasa, GP4, cataliza la formación de cebadores para la síntesis de ADN en secuencias específicas de ADN denominadas sitios de reconocimiento primase, o PRS, (5'-GTC-3 '). La citosina en el PRS es críptica, es esencial para el reconocimiento del sitio, pero no se copia en el producto ^3. El primer paso en la síntesis de cebador mediante gp4 implica la formación del dinucleótido pppAC, que luego se extiende a un trímero, y eventualmente a cebadores tetranucleotide funcionales pppACCC, pppACCA, o pppACAC dependiendo de la secuencia en la plantilla ^4. Estos cebadores pueden usarse entonces por ADN polimerasa de T7 para iniciar la síntesis de ADN, que es también un proceso gp4 asistida ^{5, 6.} En este sentido, la primasadominio estabiliza los tetraribonucleotides extremadamente cortos con la plantilla, lo que impide su disociación, se dedica ADN polimerasa de una manera conducente a asegurar el cebador / plantilla en el sitio activo de la polimerasa ^7. Estos pasos (síntesis de ARN del cebador, de traspaso cebador para la polimerasa, y de extensión) se repiten en múltiples ciclos para replicar el filamento de revestimiento y deben coordinarse con la replicación de la hebra que lleva.

Los ensayos descritos aquí son altamente sensibles y pueden realizarse en un marco de tiempo moderado. Sin embargo, son relativamente de bajo rendimiento y gran cuidado debe ejercerse en el uso y desecho de materiales radiactivos. Dependiendo de la velocidad a la que transcurre la reacción, se puede emplear un instrumento de rápido enfriamiento para alcanzar muestras a escalas de tiempo susceptibles de un análisis significativo de los cursos de tiempo de reacción, ya sea en la constante o el estado pre-estacionario. Recientemente, hemos utilizado ensayos descritos aquí para proporcionar evidence de la importancia de la liberación de imprimación desde el dominio de primasa de GP4 en la iniciación de los fragmentos de Okazaki. Además, se encontró evidencia de un papel regulador de la proteína T7, gp2.5 de unión al ADN de una sola cadena, en la promoción de la formación y la utilización eficiente de imprimación ^8.

Protocolo

NOTA: Siga todas las normativas institucionales con respecto al uso seguro y la eliminación de los materiales radiactivos, incluyendo pero no limitado a, el uso de equipo de protección personal, como guantes, gafas de seguridad, ropa de laboratorio, y escudos de acrílico adecuados.

NOTA: El tampón estándar consta de 40 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM de glutamato de potasio, DTT 5 mM, EDTA 0,1 mM (este tampón se pre-hizo a una concentración 5x) y 0,3 mM de cada dNTP. Proteínas de replicación de T7 se purifican como se describe ^{8, 9, 10.} ADN de una sola hebra que contiene un único sitio de reconocimiento de T7 primasa (5'-GGGTC-3 ', 5'-GTGTC-3', 5'-TGGTC-3 ') se pueden adquirir en una variedad de empresas de síntesis de ADN (la longitud de el ssDNA puede depender de la enzima de elección, para primasa T7, un pentámero es la longitud mínima molde para sintetizar un cebador de longitud completa ¹1, ya que la críptica C es esencial, sin embargo, si el cebador se va a extender por la polimerasa, nucleótidos adicionales deben estar presentes en el extremo 3 'de la plantilla. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de una concentración final de 10 mM MgCl ₂ y se incubaron a 25 ° C. El muestreo manual funciona bien para los puntos de tiempo de 5 segundos o más. Si se requieren puntos de tiempo más cortos que eso, se recomienda utilizar un instrumento de flujo rápido de enfriamiento rápido para obtener datos precisos.

1.-rotación múltiple Primer Síntesis de reacción por muestreo manual

1. Antes de iniciar el experimento, alícuota de 2 l de tampón de colorante formamida (93% (v / v) de formamida, EDTA 50 mM, 0,01% xileno cianol y 0,01% de azul de bromofenol) en 8 tubos de polipropileno de 1,5 mL. En general, el número de tubos es igual al número de puntos de tiempo analizados.
2. Preparar una mezcla que consiste en 20 l de tampón 1x, 0,1 mM de ATP y CTP, 0,25 mCi / ml [α- ³² P] CTP, 0,1 M SSDplantilla NA, y 0,1 M gp4 (expresado como concentración hexámero - 0,6 M de monómero).
3. Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 5 min.
4. Retire 2 l de la mezcla usando una pipeta y se mezcla con 2 l de tampón de colorante formamida en un tubo de 1,5 ml preparada en la etapa 1.1 para el control ninguna reacción (tiempo cero).
5. Añadir 2 l de 0,1 M MgCl ₂ a la mezcla de reacción (a una concentración final de 10 mM).
6. Extraiga con las muestras 2 l de las mezclas de reacción utilizando una pipeta en intervalos de 10 s y se mezcla con el tinte de formamida predispensed en tubos de 1,5 ml preparada en el paso 1.1.
7. muestras de calor a 95 ° C durante 5 minutos en un bloque de calor.
8. Cargar alícuotas de las muestras en un gel desnaturalizante. Los pequeños productos de cebadores tetraribonucleotide sintetizados por la primasa T7 se resuelven bien en un 0,4 mm de espesor 25% de acrilamida: bisacrilamida (19: 1), 3 M de urea, 1x TBE (100 mM Tris-borato, EDTA 1 mM).
9. Coloque gel de todo el chromatograPHY papel y la cubierta con una envoltura de plástico. gel seco utilizando un secador de gel.
10. Preparar una serie de diluciones del resto de la mezcla de reacción y detectar el mismo volumen cargado en el gel en papel de cromatografía, es decir, detectar 4 l de la dilución si se cargaron 4 l de muestra.
    NOTA: Esto servirá como la curva estándar para determinar la concentración de los productos formados durante la reacción. Por ejemplo, cinco veces diluciones usando tampón TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, EDTA 1 mM) funcionan bien, abarca una gama de 1:25 a 1: 15.625 (5 ² -5 ^6), pero las diluciones deben ser ajustado en función del nivel de actividad.
11. Exponer gel seco y estándar utilizando una pantalla PhosphorImager. Cuantificar la radiactividad en la serie de dilución y construir una curva estándar como se describe ^{8, 12}
    NOTA: La inclusión de T7 DNA polimerasa a la mezcla de reacción permite que uno EXAmina el uso de cebadores tetraribonucleotide por esta enzima. De manera óptima, la concentración de la polimerasa debe ser saturando para simplificar la interpretación de los datos. Una concentración de la polimerasa de 0,4 M o superiores da buenos resultados. Además, el efecto de otras proteínas, tales como proteínas de unión al ADN de una sola hebra, ya sea en la síntesis de cebador o retraso-strand iniciación se puede examinar de esta manera.

2. Múltiple-rotación Primer Síntesis de reacción usando un instrumento rápido enfriamiento rápido

1. Preparación de mezclas de reacción
   1. Preparar 400 l de solución A, que contiene tampón 1x, 0,2 mM hexámero GP4, 0,2 M plantilla ssDNA, dNTPs 0,6 mM, 0,2 mM ATP y CTP (incluyendo 0,5 mCi / ml [α- ³² P] CTP.
   2. Preparar 400 l de solución B, que contiene tampón 1x y MgCl 20 mM _2.
2. El funcionamiento del instrumento de flujo rápido enfriamiento rápido
   1. Encienda el rapIdentificación del instrumento de flujo enfriamiento rápido; después de que aparezca el menú principal, tipo 7 en el teclado del instrumento para mover el controlador de la jeringa a la posición inicial.
   2. posición de la jeringa tampón abierta a "CARGA".
3. Jeringas de carga de amortiguamiento
   1. Adjuntar un tampón que contiene 10 ml de la jeringa al puerto de jeringa unidad. Cambiar la posición de la perilla de la jeringa para "CARGA".
   2. El uso de jeringas de 10 ml, llenar tampón instrumento depósito A y B con Tris 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM y llenar la jeringa C con una solución de enfriamiento rápido (EDTA 250 mM, y 0,2% SDS). Eliminar las burbujas de aire empujando los émbolos de entrada y salida.
   3. Cambie la posición de la perilla para "disparar". Tipo 2 para ajustar la posición de la barra de conductor jeringa. Pulse "DISMINUIR" botón para bajar la jeringa hasta tampón sale del bucle de salida: (7-baja de forma continua; 8 a gran paso hacia abajo; 9-pequeño paso hacia abajo). Tipo "ESC" para volver al menú principal.
4. tubos de lavado
   1. attlínea de salida ada a vacío. Cambiar mandos de la muestra a "flush". Cerrar tampón jeringa mediante el establecimiento de los mandos a la posición horizontal. A su vez en el vacío y moja los bucles 2 ras en _H2O durante 10 s, luego sumerja en MeOH durante 10 s. bucles secos por succión de aire para ~ 15 s, o hasta que se seque.
5. carga de muestras
   1. posición de la perilla del cambio de la muestra de "CARGA". Coloque la solución A en 1 ml de la jeringa. Enchufe jeringa en uno de los puertos de carga de la muestra. Repita el procedimiento para la solución B, y el lugar en el puerto de carga de la muestra opuesta.
6. Colección de puntos temporales
   1. En el menú principal, tipo 1 para la corrida de flujo de enfriamiento. Introduzca el tiempo (s) de reacción y de prensa, "ENTER". El número de bucle de reacción a utilizar será mostrado. Cambiar al circuito de reacción requerida. Repita el procedimiento de lavado en el paso 2.2.4.
   2. Vueltas a los botones de muestra "cargar". Cargar reacción se mezcla en los bucles de muestra hasta justo fuera del compartimiento central de mezcla. Gire todas las perillas de "FIRE ". Confirmar que todos los mandos estén en la posición correcta.
   3. Colocar tubo de 1,5 ml en el extremo del lazo de la salida. Pulse el botón "GO" para realizar la reacción. Repita el procedimiento de lavado en el paso 2.2.4. Actualizar jeringas tampón A y B hasta que lleguen al conductor.
   4. Repita los pasos 2.2.6.2-2.2.6.3 para cada punto de tiempo deseado. Excepción: No cargue solución que contiene el reactivo de partida (es decir, MgCl ₂ en este caso) cuando apagar el control de tiempo de punto cero.
   5. Cuando haya terminado la recogida de muestras, introduzca "ESC" para volver al menú principal. Pulse la tecla "7" para volver conductor jeringa búfer a su posición inicial.
7. Instrumento de limpieza
   1. Retire las jeringas mezcla de reacción. Girar el botón de carga de la muestra a la posición "LOAD". Bajo vacío, lavar cada bucle de muestra con 10 ml de NaOH N 0,2, seguido de 10 ml 0,3 NH ₃ PO ₄ y 10 ml de MeOH.
   2. Gire las perillas de jeringa a la posición "LOAD". Presione hacia abajo en los 3 SYRémbolos inge para recuperar reacción y enfriamiento rápido tampones. Lavar jeringas con 5 ml de _H2O al menos dos veces.
   3. Llenar jeringas de nuevo con 5 ml de _H2O y girar las perillas a la posición de "disparo". Cambiar las posiciones de perilla y encienda el vacío para eliminar _el H ₂ O. rasante como en el paso 2.2.4. Apaga instrumento.
      NOTA: Los productos se analizaron como se describe en los pasos 1.7-1.12. Además, ADN polimerasa de T7 y otras proteínas de replicación se pueden añadir en la mezcla de reacción para analizar su efecto sobre la síntesis del cebador o la extensión.

3.-rotación con cebador único Síntesis de Reacción

NOTA: Single-rotación de los ensayos de imprimación síntesis / extensión se llevan a cabo de manera similar a las reacciones de múltiples volumen de negocios, con algunas diferencias importantes: estos ensayos siguen la conversión de ATP radiomarcado en cebadores o de extensión productos, sin embargo la concentración de sustratos y proteínas son consideraBly superior. Además, con el fin de alcanzar una resolución de milisegundos para permitir el análisis de la reacción de síntesis del cebador, se debe utilizar una máquina de flujo rápido enfriamiento rápido.

1. Preparación de mezclas de reacción.
   1. Preparar 400 l de la solución A, que contiene tampón 1x, 3 M hexámero GP4, 6 M ssDNA plantilla, dNTPs 0,6 mM, CTP, 1 y 2 nM de [γ- ^32P] ATP. Preparar 400 l de solución B, que contiene tampón 1x y MgCl 20 mM _2.
2. Operación de flujo rápido enfriamiento rápido
   1. Llevar a cabo reacciones como se describe en el paso 2.2. Si se desea, añadir ADN polimerasa de T7 o proteína de unión de T7 sola-ADN de cadena a una concentración de 15 mM y 20 mM, respectivamente. En este caso, los productos de extensión se acumulan en un régimen de tiempo que permite la toma de muestras manual de la reacción.

Análisis 4. Datos

1. Fit curvas de progreso de producto a lo menos- no linealcuadrados modelos que utilizan el software disponible en el mercado capaces de mínimos cuadrados ajustes y / o integración numérica. Los detalles de la operación variará con el software empleado, pero a continuación son formas generalizadas de ecuaciones utilizadas para el montaje de los datos.
2. Determinar la tasa de formación de producto de múltiples reacciones de síntesis de imprimación rotación mediante el ajuste de las curvas de progresar a una ecuación lineal. Si hay curvatura significativa, utilice el método de la tasa inicial de ^{13, 14} ajustando los datos a una función de un solo exponencial: y = A (e ^{- k t),} donde y es la concentración de producto, A es la amplitud de reacción, k se la constante de velocidad observada, t es el tiempo, en segundos. La pendiente de la recta tangente en el tiempo = 0 es la velocidad inicial.
   NOTA: Ajuste pre-estacionario reacciones de síntesis de imprimación estado a una ecuación lineal o de la ecuación de estado pre-estacionario estallar y = a (e ^{- k} _buprimer ^t) + tasa _ss t, donde A es la amplitud de reacción, k _ráfaga es la constante de velocidad observada para la ráfaga estado pre-estacionario, _ss tasa es la _ss tasa = k _gato de estado estacionario [Enzima]), t es el tiempo , en segundos. Encajan solo volumen de negocios reacciones de síntesis de imprimación curvas a una sola función exponencial y = A progresan (e ^{- k t).} En el caso de GP4, ajustar los datos por integración numérica ^15, a un modelo con tres etapas de condensación NTP, donde cada intermedio se encuentra en equilibrio con la enzima, el uso de software disponible en el mercado.

Resultados

Los resultados mostrados en la Figura 1A se obtuvieron como se describe en el paso 1 del protocolo, es decir, mediante el muestreo de forma manual una reacción de síntesis del cebador catalizada por la GP4 en condiciones de múltiples volumen de negocios. Aquí, una gama de productos después de la electroforesis en gel se puede observar mediante el uso de CTP marcada con ³² P en la α-posición en reacciones de síntesis de cebador...

Discusión

El factor más importante en la realización de estos experimentos es la disponibilidad de enzima purificada de gran actividad. Durante nuestro trabajo con GP4, por ejemplo, se encontró que el almacenamiento de la enzima purificada en tampón (20 mM de fosfato de potasio, pH 7,4, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM) que contiene 50% de glicerol a -20 ° C conduce a una reducción en la actividad específica del preparado durante unos meses. Por lo tanto, ahora flash congelación pequeñas alícuotas de gp4 purificada en 25 mM Tris-H...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris pre-set crystals pH 7.5	SIGMA	T4128
Tris base	SIGMA	93362
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate	SIGMA	G1501
Magnesium chloride hexahydrate	Mallinckrodt Chemicals	5958-04
1,4-Dithiothreitol	J.T. Baker	F780-02
Sodium Dodecyl Sulfate	MP Biomedicals	811030
(Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate	Mallinckrodt Chemicals	4931-04
[α-32P] CTP	PerkinElmer	BLU508H	radioactive, take protective measures
[γ-32P] ATP	PerkinElmer	BLU502A	radioactive, take protective measures
100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP	Affymetrix	77100	four dNTPs part of set
100 mM ATP and CTP	Epicentre	RN02825	part of NTP set
ssDNA constructs	Integrated DNA Technologies	N/A	custom sequences
methanol	Macron Fine Chemicals	3017-08
formamide	Thermo Scientific	17899
bromophenol blue	SIGMA	B8026
cylene xyanol	SIGMA	X4126
acrylamide	SIGMA	A9099	Toxic
N,N′-Methylenebisacrylamide	SIGMA	M7279	Toxic
Urea	Boston Bioproducts	P-940
Boric acid	Mallinckrodt Chemicals	2549
Rapid Quench-Flow Instrument	Kintek Corp.	RQF-3
Kintek Explorer	Kintek Corp.	N/A
Kaleidagraph	Synergy Software	N/A