Cinétique de Lagging brin Synthèse de l&#39;ADN<em&gt; In vitro</em&gt; Par les protéines de réplication bactériophage T7

Résumé

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

Résumé

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

Introduction

La réplication de l'ADN est une caractéristique conservée de toute la vie cellulaire. Si l'identité et le nombre de composants de réplication varient largement, les mécanismes généraux sont partagés entre l' évolution ^1. Ici, nous décrivons, des expériences cinétiques discontinues à base de gel, en utilisant des substrats radioactifs, visant à comprendre la cinétique de la synthèse d'ADN calorifugeage brin in vitro par des composants du replisome T7. La machinerie de réplication du bactériophage T7 est très simple, ne comporte que quatre protéines (l'ADN polymérase, GP5 et son facteur de processivité, E. coli , la thiorédoxine, le GP4 de primase-hélicase bifonctionnels, et la protéine de liaison à l' ADN simple brin, GP2. 5) ^2. Cette caractéristique en fait un système modèle attractif pour étudier les mécanismes biochimiques conservés impliqués dans la réplication de l'ADN.

L'accent est mis sur la formation d'amorces ribonucléotide par T7 DNA primase, un critical étape dans l'initiation de la synthèse d'ADN. En outre, on peut également étudier l'utilisation de ces amorces par l'ADN polymerase T7 ou d'autres protéines de réplication en les incluant dans le mélange réactionnel. T7-primase de l'hélicase, GP4, catalyse la formation d'amorces pour la synthèse d'ADN au niveau des séquences d'ADN spécifiques appelés sites de reconnaissance primase, ou PRS (5'-CG-3 '). La cytosine dans la SRP est cryptique, il est essentiel pour la reconnaissance du site, mais il n'a pas été copié dans le produit ^3. La première étape dans la synthèse de l' amorce par GP4 implique la formation du dinucléotide pppAC, qui est ensuite étendue à un trimère, et éventuellement des amorces tétranucléotidiques fonctionnels pppACCC, pppACCA ou pppACAC en fonction de la séquence dans le gabarit ^4. Ces amorces peuvent ensuite être utilisées par l' ADN polymerase T7 pour initier la synthèse de l' ADN, qui est également un procédé assisté par ^{GP4-5, 6.} A cet égard, la primasedomaine stabilise les tetraribonucleotides extrêmement courts avec le modèle, ce qui empêche leur dissociation, engage l' ADN polymérase d'une manière favorable à la fixation de la amorce / matrice dans la polymérase du site actif ^7. Ces étapes (synthèse de l'ARN primaire, transfert intercellulaire primaire à la polymérase, et extension) sont répétées dans plusieurs cycles de reproduire le brin tardif et doivent être coordonnées avec la réplication du brin leader.

Les dosages décrits ici sont très sensibles et peuvent être effectuées dans un laps de temps raisonnable. Cependant, ils sont relativement bas-débit et un grand soin doit être exercé dans l'utilisation et l'élimination des matières radioactives. En fonction de la vitesse à laquelle le produit de réaction, on pourrait employer un instrument rapide trempe pour atteindre des échantillons à des échelles de temps qui se prêtent à l'analyse significative des cours de temps de réaction soit dans la constante ou l'état pré-stable. Récemment, nous avons utilisé essais décrits ici pour fournir evidence de l'importance de l'amorce la libération du domaine primase de GP4 dans l'initiation des fragments d'Okazaki. De plus, nous avons trouvé la preuve d'un rôle régulateur pour les protéines, de gp2.5 liant le T7 ADN simple brin, dans la promotion de la formation de l' amorce et l' utilisation efficaces ^8.

Protocole

REMARQUE: Suivez tous les règlements institutionnels concernant l'utilisation et l'élimination des matières radioactives, y compris mais sans s'y limiter, l'utilisation des équipements de protection individuelle, comme des gants, des lunettes de sécurité, blouse de laboratoire, et des boucliers acryliques appropriés.

NOTE: Le tampon standard est constitué de 40 mM de HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM de glutamate de potassium, 5 mM de DTT, 0,1 mM d'EDTA (ce tampon est préalablement effectué à une concentration de 5x) et 0,3 mM de chaque dNTP. Protéines de replication de T7 sont purifiés comme décrit ^{8, 9, 10.} ADN simple brin contenant une T7 unique de reconnaissance primase place (5 'GGGTC-3', 5'-GTGTC-3 ', 5'-TGGTC-3') peut être acheté parmi une variété de sociétés de synthèse d'ADN (la longueur de l'ADNsb peut dépendre de l'enzyme de choix pour la T7 primase, un pentamère est la longueur de gabarit minimal pour synthétiser une amorce de pleine longueur ¹1, comme le cryptique C est essentiel, cependant, si l'amorce doit être prolongée par polymérase, des nucléotides supplémentaires doivent être présents à l' extrémité 3 'de la matrice. Les réactions sont initiées par l'addition d'une concentration finale de 10 mM MgCl ₂ et incubées à 25 ° C. échantillonnage manuel fonctionne bien pour les points de temps de 5 secondes ou plus. Si points de temps plus courts que sont nécessaires, il est recommandé d'utiliser un instrument d'écoulement rapide trempe pour obtenir des données précises.

1. Multiple-CA Primer Synthèse Reaction par échantillonnage manuel

1. Avant de commencer l'expérience, aliquoter 2 ul de tampon de colorant formamide (93% (v / v) de formamide, 50 mM d'EDTA, 0,01% de xylene cyanol et 0,01% de bleu de bromophénol) dans 8 tubes de 1,5 ml en polypropylene. En général, le nombre de tubes est égal au nombre de points temporels analysés.
2. Préparer un mélange de 20 ul constitué tampon 1x, 0,1 mM d' ATP et CTP, 0,25 mCi / mL [α- ³² P] CTP, 0,1 uM ssdNA modèle, et 0,1 uM GP4 (exprimée en concentration de hexamère - monomère 0,6 uM).
3. Incuber le mélange à température ambiante pendant 5 min.
4. Retirer 2 pl du mélange à l'aide d'une pipette et mélanger avec 2 pi de tampon de colorant formamide dans un tube de 1,5 ml préparé à l'étape 1.1 pour le pas de contrôle de réaction (temps zéro).
5. Ajouter 2 ul de 0,1 M de MgCl ₂ au mélange réactionnel (à une concentration finale de 10 mM).
6. retirer manuellement 2 pi des échantillons des mélanges réactionnels à l'aide d'une pipette à intervalles de 10 secondes et mélanger avec un colorant formamide predispensed dans des tubes de 1,5 mL préparés à l'étape 1.1.
7. Des échantillons de chaleur à 95 ° C pendant 5 minutes dans un bloc chauffant.
8. Charger des aliquotes des échantillons sur un gel dénaturant. Les petits produits d'amorce de tetraribonucleotide synthétisés par la primase T7 sont bien réglées sur une épaisseur de 0,4 mm 25% d'acrylamide: bisacrylamide (19: 1), 3 M d'urée, 1 x TBE (Tris-borate 100, 1 mM d'EDTA).
9. Placez tout le gel sur la chromapapier phie et la couverture d'une pellicule plastique. gel sec en utilisant un séchoir à gel.
10. Préparer une série de dilutions du reste du mélange réactionnel et détecter le même volume chargé sur le gel sur du papier de Chromatographie, à savoir repèrer 4 ul de la dilution si 4 pi d'échantillon ont été chargés.
    NOTE: Cela servira de la courbe standard pour déterminer la concentration des produits formés lors de la réaction. Par exemple, des dilutions de cinq fois à l' aide du tampon TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, EDTA 1 mM) fonctionnent bien, couvrant une gamme de 1:25 à 1: 15.625 (5 ² -5 ^6), mais les dilutions devraient être ajustée en fonction du niveau d'activité.
11. Exposer gel sec et standard en utilisant un écran de phosphorimager. Quantifier la radioactivité dans la série de dilution et de construire une courbe standard tel que décrit ^{8, 12}
    NOTE: L' inclusion de l' ADN polymerase T7 au mélange de réaction permet de Examine de l'utilisation d'amorces tetraribonucleotide par cette enzyme. De manière optimale, la concentration de la polymerase doit être saturante pour simplifier l'interprétation des données. Une concentration de la polymérase de 0,4 uM ou plus donne de bons résultats. En outre, l'effet d'autres protéines, telles que des protéines de liaison simple brin d'ADN, de part et d'amorce de synthèse ou en retard brin d'initiation peut être examiné de cette façon.

2. Multiple-chiffre d'affaires Primer Synthèse Reaction l'aide d'un instrument rapide trempe

1. Préparation des mélanges réactionnels
   1. Préparer 400 pi de solution A, contenant un tampon 1x, 0,2 uM GP4 hexamère, 0,2 uM ADNss modèle, mM dNTP 0,6, 0,2 mM ATP et CTP (y compris 0,5 mCi / mL [α- ³² P] CTP.
   2. Préparer 400 pi de solution B, contenant 1 x tampon et 20 mM de MgCl _2.
2. Le fonctionnement de l' instrument d'écoulement rapide trempe
   1. Allumez le rapinstrument d'écoulement id-trempe; après que le menu principal apparaît, le type 7 sur le clavier de l'instrument pour déplacer le conducteur de la seringue à sa position d'origine.
   2. tampon Position ouverte de la seringue pour "LOAD".
3. Seringues tampon de chargement
   1. Fixer une seringue de 10 ml contenant du tampon à l'orifice de la seringue de commande. Changer la position du bouton de la seringue pour "LOAD".
   2. En utilisant des seringues de 10 ml, remplir le réservoir tampon de l'appareil A et B avec 10 mM de Tris, pH 7,5, EDTA 1 mM et remplir la seringue C avec une solution de trempe (250 mM d'EDTA et 0,2% de SDS). Retirer les bulles d'air en poussant des plongeurs et sortir.
   3. Changez la position de bouton pour "FIRE". Tapez 2 pour ajuster la position de la barre de pilote de seringue. Appuyez sur le bouton "DIMINUER" pour abaisser la seringue jusqu'à ce tampon sort la boucle de sortie: (7 descend en continu; 8-grand pas vers le bas; 9-petit pas vers le bas). Tapez "ESC" pour revenir au menu principal.
4. Laver les tubes
   1. attach ligne de sortie à vide. Changer les boutons échantillons à "FLUSH". Fermer le tampon seringue en réglant les potentiomètres à la position horizontale. Allumez le vide et tremper les boucles 2 affleurants en H ₂ O pendant 10 s, puis tremper dans MeOH pendant 10 s. boucles sèches par aspiration d'air pour ~ 15 s, ou jusqu'à ce que sec.
5. Échantillons de chargement
   1. Changer l'échantillon position du bouton à "LOAD". Placer la solution A dans 1 ml seringue. Brancher une seringue dans l'un des orifices de charge de l'échantillon. Répétez l'opération pour la solution B, et placer dans un face port de chargement de l'échantillon.
6. La collecte de points de temps
   1. Sur le menu principal, tapez 1 pour la course trempe-débit. Entrez le temps (s) de réaction et appuyez sur "ENTRER". Le numéro de boucle de réaction à utiliser sera affiché. Passer en boucle de réaction nécessaire. procédure de lavage Répétez l'étape 2.2.4.
   2. Tournez les boutons échantillons à "LOAD". réaction de charge se mélange dans des boucles d'échantillons jusqu'à ce que juste à l'extérieur du compartiment de mélange central. Tournez tous les boutons à "FIRE ". Assurez-vous que tous les boutons sont dans la bonne position.
   3. Placer le tube de 1,5 ml sur l'extrémité de la boucle de sortie. Appuyez sur "GO" pour lancer la réaction. procédure de lavage Répétez l'étape 2.2.4. Recharger seringues tampons A et B jusqu'à ce qu'ils atteignent le pilote.
   4. Répétez les étapes 2.2.6.2-2.2.6.3 pour chaque point de temps désiré. Exception: Ne chargez pas la solution contenant le réactif de départ (ie, MgCl ₂ dans ce cas) lorsque la trempe de la commande à zéro point de temps.
   5. Lorsque vous avez terminé la collecte des échantillons, entrez "ESC" pour revenir au menu principal. Appuyez sur "7" pour revenir de seringue tampon à sa position d'origine.
7. Instrument de nettoyage
   1. Retirer les seringues du mélange réactionnel. Tournez le chargement des échantillons bouton à la position "LOAD". Sous vide, lavez chaque boucle d'échantillon avec 0,2 mL NaOH 10 N, puis 10 ml 0,3 NH ₃ PO ₄ et 10 ml de MeOH.
   2. Tournez les boutons de la seringue pour la position "LOAD". Appuyez sur tous les 3 syrpoinçons inge pour récupérer réaction et trempe des tampons. Laver seringues au moins deux fois avec 5 ml H ₂ O.
   3. Remplir les seringues à nouveau avec 5 ml H ₂ O et tourner les boutons en position "FIRE". Changer les positions de bouton et tourner le vide pour éliminer H ₂ O. Flush comme à l' étape 2.2.4. Eteignez instrument.
      REMARQUE: Les produits sont analysés comme décrit dans les étapes 1.7-1.12. En outre, l'ADN polymerase T7 et d'autres protéines de replication peuvent être ajoutés dans le mélange réactionnel pour analyser leur effet sur la synthèse ou l'extension d'amorce.

3. Single-CA Primer Synthèse Reaction

NOTE: simple rotation des essais primaire synthèse / extension sont effectuées de manière similaire à des réactions multiples chiffre d' affaires, avec quelques différences majeures: ces essais suivent la conversion de radiomarqué ATP dans l' amorce ou d' extension des produits, mais la concentration de substrats et de protéines sont considerablée supérieur. En outre, afin d'atteindre la milliseconde pour permettre une analyse de la réaction de synthèse de l'amorce, on doit utiliser une machine à écoulement rapide trempe.

1. Préparation des mélanges réactionnels.
   1. Préparer 400 pi de solution A, contenant un tampon 1x, 3 uM hexamère GP4, 6 uM ADNss modèle, 0,6 mM de dNTP, 1 mM CTP, et 2 nM [γ- ³² P] ATP. Préparer 400 pi de solution B, contenant 1 x tampon et 20 mM de MgCl _2.
2. Le fonctionnement d'écoulement rapide trempe
   1. Effectuer des réactions comme décrit dans l'étape 2.2. Si on le désire, ajouter une ADN polymerase T7 ou une protéine de liaison à l'ADN simple brin T7 à une concentration de 15 uM et 20 uM, respectivement. Dans ce cas, les produits d'extension à l'accumulation d'un régime de temps qui permet le prélèvement manuel de la réaction.

Analyse 4. Données

1. courbes de progression du produit Fit à MOINS AVANCES non linéairemodèles carrés en utilisant des logiciels disponibles dans le commerce capables de moindres carrés unique et / ou intégration numérique. Les détails de l'opération varient avec le logiciel utilisé, mais au-dessous sont des formes généralisées d'équations utilisées pour le montage des données.
2. Déterminer le taux de formation du produit de plusieurs réactions de synthèse d'amorce rotation par ajustement des courbes de progression d'une équation linéaire. S'il y a une courbure importante, l' utilisation de la méthode de la vitesse initiale ^{13, 14} en ajustant les données à une fonction mono-exponentielle: y = A (e ^{- k t),} où y est la concentration du produit, A est l'amplitude de la réaction, k est la constante de vitesse observée, t est le temps, en secondes. La pente de la ligne tangente au temps = 0 est le taux initial.
   NOTE: Les réactions Fit pré-stables synthèse état d'amorce à une équation linéaire ou à l'équation d'état pré-stable éclater y = A (e ^{- k} _bupremière ^t) + taux _ss t, où A est l'amplitude de la réaction, k _rafale est la constante de vitesse observée pour l'éclatement de pré-état stationnaire, _ss taux est l'état stationnaire _ss taux = k _cat [Enzyme]), t est le temps , en secondes. Fit une seule rotation des réactions de synthèse de l' amorce progressent courbes à une seule fonction exponentielle y = A (e ^{- k t).} Dans le cas de GP4, ajuster les données par intégration numérique ^15, à un modèle avec trois NTP étapes de condensation, où chaque intermédiaire est en équilibre avec l'enzyme, en utilisant un logiciel disponible dans le commerce.

Résultats

Les résultats présentés dans la figure 1A ont été obtenus comme décrit à l' étape 1 du protocole, à savoir, en échantillonnant manuellement une réaction de synthèse de l' amorce catalysée par GP4 dans des conditions multiples chiffre d' affaires. Ici, une gamme de produits après électrophorèse en gel peut être observée en utilisant le CTP marqué avec ^32P à l'α-positionnement dans les réactions de ...

Discussion

Le facteur le plus important dans la réalisation de ces expériences est la disponibilité d'enzyme purifiée très active. Au cours de notre travail avec GP4, par exemple, nous avons constaté que le stockage de l'enzyme purifiée dans un tampon (20 mM de phosphate de potassium, pH 7,4, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM) contenant 50% de glycerol à -20 ° C conduit à une diminution l'activité spécifique de la préparation pendant quelques mois. Par conséquent, nous maintenant flash freeze petites aliquotes de GP4...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris pre-set crystals pH 7.5	SIGMA	T4128
Tris base	SIGMA	93362
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate	SIGMA	G1501
Magnesium chloride hexahydrate	Mallinckrodt Chemicals	5958-04
1,4-Dithiothreitol	J.T. Baker	F780-02
Sodium Dodecyl Sulfate	MP Biomedicals	811030
(Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate	Mallinckrodt Chemicals	4931-04
[α-32P] CTP	PerkinElmer	BLU508H	radioactive, take protective measures
[γ-32P] ATP	PerkinElmer	BLU502A	radioactive, take protective measures
100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP	Affymetrix	77100	four dNTPs part of set
100 mM ATP and CTP	Epicentre	RN02825	part of NTP set
ssDNA constructs	Integrated DNA Technologies	N/A	custom sequences
methanol	Macron Fine Chemicals	3017-08
formamide	Thermo Scientific	17899
bromophenol blue	SIGMA	B8026
cylene xyanol	SIGMA	X4126
acrylamide	SIGMA	A9099	Toxic
N,N′-Methylenebisacrylamide	SIGMA	M7279	Toxic
Urea	Boston Bioproducts	P-940
Boric acid	Mallinckrodt Chemicals	2549
Rapid Quench-Flow Instrument	Kintek Corp.	RQF-3
Kintek Explorer	Kintek Corp.	N/A
Kaleidagraph	Synergy Software	N/A