Kinetik der Verzögerungs-DNA-Synthese<em&gt; In Vitro</em&gt; Von den Bakteriophagen T7 Replikationsproteine

Zusammenfassung

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

Zusammenfassung

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

Einleitung

Die Replikation der DNA ist ein konserviertes Merkmal aller zellulären Lebens. Während die Identität und Anzahl der Replikationskomponenten in weiten Grenzen variieren, werden die allgemeinen Mechanismen für die Evolution ¹ geteilt. Hier beschreiben wir Gelbasis, diskontinuierliche kinetischen Experimenten, radioaktiven Substraten, dem Ziel, das Verständnis der Kinetik der nacheilenden Strang - DNA - Synthese in vitro durch Komponenten des T7 replisome. Die Replikationsmaschinerie des Bakteriophagen T7 ist sehr einfach, die aus nur vier Proteine (die DNA - Polymerase, GP5 und dessen Prozessivitätsfaktor, E. coli - Thioredoxin, die bifunktionellen Primase-Helikase gp4 und die einzelsträngige DNA - Bindungsprotein, GP2. 5) ^2. Diese Funktion macht es ein attraktives Modellsystem die konservierten biochemischen Mechanismen der DNA-Replikation beteiligt zu studieren.

Ein besonderer Schwerpunkt liegt auf der Bildung von Ribonukleotid Primer durch T7-DNA-Primase platziert, ein critical Schritt bei der Initiation der DNA-Synthese. Darüber hinaus kann man auch die Verwendung dieser Primer durch T7-DNA-Polymerase oder andere Replikationsproteine ​​zu untersuchen, indem sie in der Reaktionsmischung einschließlich. Die T7-Primase-Helikase, gp4, katalysiert die Bildung von Primer für DNA-Synthese an spezifische DNA-Sequenzen Primase-Erkennungsstellen oder PRS genannt, (5'-GTC-3 '). Das Cytosin in der PRS ist kryptisch, es für die Anerkennung der Website von wesentlicher Bedeutung ist, aber es wird nicht in das Produkt ³ kopiert. Der erste Schritt bei der Primersynthese durch gp4 beinhaltet die Bildung des Dinucleotid pppAC, die dann zu einem Trimer verlängert wird, und schließlich zu funktionellen Tetranukleotid Primern pppACCC, pppACCA oder pppACAC Abhängigkeit von der Sequenz in der Template - ^4. Diese Primer können dann von T7 DNA - Polymerase verwendet werden , um DNA - Synthese zu initiieren, das auch ein gp4 unterstütztes Verfahren ^{5, 6.} In dieser Hinsicht ist die PrimaseDomäne stabilisiert die extrem kurze tetraribonucleotides mit der Vorlage ihrer Dissoziation zu verhindern, greift DNA - Polymerase tatsächlich in einer Weise , um die Primer / Matrize in der Polymerase - aktiven Stelle ⁷ sichern. Diese Schritte (RNA-Primer-Synthese, Primer-Handoff-Polymerase und Verlängerung) werden in mehreren Zyklen wiederholt, um die nacheilende Strang zu replizieren und mit der Replikation des führenden Stranges koordiniert werden.

Die Assays hier beschrieben sind, sind sehr empfindlich und kann in einem moderaten Zeitrahmen durchgeführt werden. Sie sind jedoch mit relativ niedrigem Durchsatz und großer Sorgfalt muss bei der Nutzung und Entsorgung von radioaktiven Materialien ausgeübt werden. In Abhängigkeit von der Geschwindigkeit, mit der die Reaktion abläuft, könnte man ein schnelles Abschrecken Instrument einsetzen, um Proben auf Zeitskalen zugänglich für aussagekräftige Analyse der Kurse Reaktionszeit erreichen entweder die stationäre oder die Pre-stabilen Zustand. Vor kurzem haben wir verwendeten Assays hier beschriebenen evidenc zur Verfügung zu stellene die Bedeutung der Primer Freisetzung aus der Primase-Domäne von gp4 in der Einleitung von Okazaki-Fragmenten. Zusätzlich fanden wir Beweise für eine regulatorische Rolle für die T7 einzelsträngige DNA - Bindungsprotein, gp2.5, bei der Förderung der effizienten Primer Bildung und Nutzung ^8.

Protokoll

HINWEIS: Befolgen Sie alle institutionellen Bestimmungen für die sichere Verwendung und Entsorgung von radioaktivem Material, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Verwendung persönlicher Schutzausrüstung wie Handschuhe, Schutzbrille, Kittel und entsprechende Acryl Schilde.

HINWEIS: Der Standardpuffer besteht aus 40 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM Kaliumglutamat, 5 mM DTT, 0,1 mM EDTA (dieser Puffer wird bei einer 5-fach Konzentration vorgefertigten) und 0,3 mM jedes dNTP. T7 - Replikationsproteine werden gereinigt , wie beschrieben ^{8, 9, 10.} Einzelsträngige DNA eine einzelne T7 Primase-Erkennungsstelle (5'-GGGTC-3 ', 5'-GTGTC-3', 5'-TGGTC-3 ') enthält, kann aus einer Vielzahl von DNA-Synthese Unternehmen erworben werden (die Länge die ssDNA auf das Enzym der Wahl abhängen, für T7 - Primase, ein Pentamer der minimale Schablonenlänge für ein Volllängen - Primers zu synthetisieren ¹1, wie die kryptische C wesentlich ist jedoch, wenn der Primer durch die Polymerase verlängert werden soll, müssen zusätzliche Nucleotide am 3' - Ende der Matrize vorhanden sein. Reaktionen werden durch die Zugabe einer Endkonzentration von 10 mM MgCl ₂ und inkubiert bei 25 ° C eingeleitet. Manuelle Probenahme funktioniert gut für die Zeitpunkte von 5 Sekunden oder länger. Wenn Zeitpunkten kürzer ist als die erforderlich sind, wird empfohlen, ein rapid-quench Strömungs Instrument zu verwenden, um genaue Daten zu erhalten.

1. Multiple-Umsatz Primer Synthesereaktion durch manuelle Probenahme

1. Vor dem Start des Experiments Aliquot 2 ul Formamid-Farbstoff-Puffer (93% (v / v) Formamid, 50 mM EDTA, 0,01% Xylolcyanol und 0,01% Bromphenol blau) in 8 1,5 ml Polypropylenröhrchen. Im Allgemeinen ist die Anzahl der Rohre gleich der Anzahl von Zeitpunkten analysiert.
2. Bereiten Sie eine 20 & mgr; l Mischung aus 1x Puffer, 0,1 mM ATP und CTP, 0,25 mCi / ml [α- ³² P] CTP, 0,1 uM ssDNA Vorlage, und 0,1 uM gp4 (als Hexamer Konzentration ausgedrückt - 0,6 & mgr; M-Monomer).
3. Inkubieren der Mischung bei Raumtemperatur für 5 min.
4. Entfernen 2 & mgr; l der Mischung ein Pipettiergerät und mischen sich mit 2 ul Formamid-Farbstoff Puffer in einem 1,5 ml-Röhrchen in Schritt unter Verwendung von 1,1 für die keine Reaktionskontrolle (Zeit Null).
5. Fügen Sie 2 ul 0,1 M MgCl ₂ auf die Reaktionsmischung (auf eine Endkonzentration von 10 mM).
6. zurückziehen manuell 2 & mgr; l-Proben der Reaktionsmischungen eine Pipette in 10 s Intervallen und mischen sich mit Formamid Farbstoff vordosiert in 1,5 ml-Röhrchen, hergestellt in Schritt 1.1 verwendet.
7. Wärme Proben bei 95 ° C für 5 min in einem Heizblock.
8. Laden Aliquots der Proben auf einem denaturierenden Gel. Die kleinen tetraribonucleotide Primer Produkte von der T7-Primase synthetisiert sind auf einer 0,4 mm dicken 25% Acrylamid gelöst: Bisacrylamid (19: 1), 3 M Harnstoff, 1x TBE (100 mM Tris-Borat, 1 mM EDTA).
9. Legen gesamte Gel auf chromatograPHY Papier und Abdeckung mit Plastikfolie. Trockenes Gel mit einem Gel-Trockner.
10. Bereiten Sie eine Verdünnungsreihe der Rest des Reaktionsgemisches und Spot das gleiche Volumen auf dem Gel auf Chromatographie Papier eingelegt, das heißt, vor Ort 4 ul der Verdünnung , wenn 4 ul der Probe geladen wurden.
    ANMERKUNG: Diese als Standardkurve dient der Konzentration der Produkte während der Reaktion gebildet zu bestimmen. Zum Beispiel fünffache Verdünnungen TE Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) funktionieren gut, eine Reihe von 01.25 Spanning bis 1: 15.625 (5 ² -5 ^6), aber die Verdünnungen sollten in Abhängigkeit von dem Aktivitätsniveau eingestellt werden.
11. Expose trockenes Gel und Standard mit einem Phosporimager Bildschirm. Quantifizierung der Radioaktivität in der Verdünnungsreihe und konstruieren als eine Standardkurve ^{8 beschrieben, 12}
    HINWEIS: Inclusion von T7 DNA - Polymerase zu der Reaktionsmischung ermöglicht es , zu EXAMine die Verwendung von tetraribonucleotide Primer durch dieses Enzym. Optimalerweise sollte die Polymerase-Konzentration werden Sättigen der Interpretation der Daten zu vereinfachen. Eine Polymerase-Konzentration von 0,4 & mgr; M oder höher gute Ergebnisse. Zusätzlich kann die Wirkung von anderen Proteinen, wie beispielsweise Einzelstrang-DNA-bindende Proteine, entweder auf der Primersynthese oder nacheilend Stranginitiations kann auf diese Weise untersucht werden.

2. Multiple-Umsatz Primer Synthesereaktion einem Rapid-Quench Einsatz des Instruments

1. Herstellung von Reaktionsgemischen
   1. Bereiten 400 ul Lösung A, enthaltend 1x Puffer, 0,2 & mgr; M gp4 Hexamer, 0,2 uM ssDNA Vorlage, 0,6 mM dNTPs, 0,2 mM ATP und CTP (einschließlich 0,5 mCi / ml [α- ³² P] CTP.
   2. Bereiten 400 ul Lösung B, enthaltend 1x Puffer und 20 mM MgCl _2.
2. Der Betrieb von S-Quench Fluss Instrument
   1. Schalten Sie Rapid-Quench-Flow Instruments; nachdem das Hauptmenü angezeigt wird, geben 7 auf dem Instrument Tastatur, um die Spritze Fahrer in die Ausgangsposition zu bewegen.
   2. Offene Pufferspritzenposition auf "LOAD".
3. Ladepuffer Spritzen
   1. Bringen Sie einen 10-ml-Spritze mit dem Antriebs Spritze Port mit Puffer. Ändern Spritze Knopfposition auf "LOAD".
   2. Unter Verwendung von 10 ml Spritzen, füllen Instrument Pufferbehälter A und B mit 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA und Spritze C mit Quench-Lösung (250 mM EDTA und 0,2% SDS) zu füllen. Entfernen Sie Luftblasen durch Drücken Kolben, die in die und aus.
   3. Ändern Knopfpositionen auf "FIRE". Typ-2-Position der Spritze Fahrer bar einzustellen. Drücken Sie "EINSTELLUNG VERRINGERN", um die Spritze zu senken, bis Puffer aus der Austrittsschleife kommt: (7-geht kontinuierlich; 8-großen Schritt nach unten; 9-kleiner Schritt nach unten). Geben Sie "ESC", um in das Hauptmenü zurückzukehren.
4. Wash Schlauch
   1. AttACH Ausfahrt Linie Vakuum. Ändern Probe Knöpfe auf "flush". Schließen Puffer Spritze durch die Knöpfe in die horizontale Position. Schalten Sie Vakuum und tauchen Sie die 2 bündig Schleifen in H ₂ O für 10 s, dann tauchen in MeOH für 10 s. Trockenschleifen von Luft für ~ 15 s saugen, oder bis es trocken ist.
5. Laden Proben
   1. Ändern Probe Knopfposition auf "LOAD". Legen Sie die Lösung A in 1-ml-Spritze. Stecken Spritze in einem der Probenladestationen. Wiederholen Sie dies für die Lösung B, und legen Sie in die entgegengesetzte Probenladeöffnung.
6. Sammlung von Zeitpunkten
   1. Auf dem Hauptmenü, geben Sie 1 für Quench-Flow-Lauf. Geben Sie Reaktionszeit (s) ein und drücken Sie "ENTER". Die Reaktionsschleife Nummer verwendet wird angezeigt. Wechseln Sie auf die gewünschte Reaktionsschleife. Wiederholen Waschvorgang in Schritt 2.2.4.
   2. Drehen Probe Knöpfe auf "LOAD". Last Reaktion mischt in Probenschleifen bis kurz außerhalb des zentralen Mischraum. Drehen Sie alle Regler auf "FIRE ". Bestätigen Sie, dass alle Knöpfe in der richtigen Position sind.
   3. Legen Sie 1,5 ml-Röhrchen auf Ende der Ausfahrt Schleife. Drücken Sie auf "GO" um die Reaktion auszuführen. Wiederholen Waschvorgang in Schritt 2.2.4. Nachladepuffer Spritzen A und B, bis sie den Fahrer getroffen.
   4. Wiederholen Sie die Schritte 2.2.6.2-2.2.6.3 für jeden gewünschten Zeitpunkt. Ausnahme: Legen Sie keine Lösung , um die Start - Reagenz (dh MgCl ₂ in diesem Fall) , wenn das Abschrecken des Null - Zeit-Punkt - Regelung enthält.
   5. Wenn die Proben fertig zu sammeln, geben Sie "ESC" zum Hauptmenü zurückzukehren. Drücken Sie "7" Puffer Spritze Fahrer in seine Ausgangsposition zurückzukehren.
7. Instrument clean-up
   1. Entfernen Reaktionsgemisch Spritzen. Drehen Probenladeknopf auf "LOAD" Position. Im Vakuum waschen jede Probenschleife mit 10 ml 0,2 N NaOH, gefolgt von 10 ml 0,3 NH ₃ PO ₄ und 10 ml MeOH.
   2. Drehen Sie Spritze Knöpfe auf "LOAD" Position. Drücken Sie auf allen 3 syringe Plunger Reaktion und Quench-Puffer abzurufen. Waschen Sie die Spritzen mit 5 ml H ₂ O mindestens zweimal.
   3. Füllen Sie Spritzen erneut mit 5 ml H ₂ O und drehen Knöpfe auf "FIRE" Position. Ändern Sie Knopfpositionen und schalten Sie Vakuum zu H ₂ O Flush , wie in Schritt 2.2.4 entfernen. Schalten Sie das Gerät ab.
      HINWEIS: Die Produkte werden in Schritten von 1,7 bis 1,12 , wie beschrieben analysiert. Zusätzlich Polymerase T7 DNA und andere Replikationsproteine ​​können in der Reaktionsmischung hinzugefügt werden, deren Wirkung auf der Primersynthese oder Erweiterung zu analysieren.

3. Single-Umsatz Primer Synthesereaktion

HINWEIS: Single-Umsatz Primersynthese / Extension - Assays sind in ähnlicher Weise zu Mehrumsatz Reaktionen durchgeführt, mit einigen großen Unterschiede: diese Tests folgen die Umwandlung von radiomarkiertem ATP in Primer oder Verlängerungsprodukte, aber die Konzentration von Substraten und Proteinen sind consideraBly höher. Darüber hinaus, um Millisekundenauflösung zu ermöglichen Analyse der Primer-Synthesereaktion zu erreichen, muss man eine schnelle Abschrecken Strömungsmaschine zu nutzen.

1. Herstellung der Reaktionsgemische.
   1. Bereiten Sie 400 ul der Lösung A, bestehend aus 1x Puffer, 3 uM gp4 Hexamer, 6 uM ssDNA - Vorlage, 0,6 mM dNTPs, 1 mM CTP und 2 nM [γ- ³² P] ATP. Bereiten 400 ul Lösung B, enthaltend 1x Puffer und 20 mM MgCl _2.
2. Schneller-Quench Flow - Betrieb
   1. Führen Sie Reaktionen wie in Schritt 2.2 beschrieben. Falls gewünscht, fügen T7 DNA-Polymerase oder T7 einzelsträngige DNA-Bindungsprotein in einer Konzentration von 15 uM und 20 uM, respectively. In diesem Fall sammeln sich die Verlängerungsprodukte zu einem Zeitpunkt Regime, das für die manuelle Probennahme der Reaktions ermöglicht.

4. Datenanalyse

1. Fit Produkt Verlaufskurven auf nicht-lineare LeastQuadrate Modelle im Handel erhältliche Software, die der kleinsten Quadrate passt und / oder numerische Integration verwendet wird. Die Einzelheiten der Operation wird mit der Software verwendet wird, variieren, aber unterhalb sind verallgemeinerte Formen der Gleichungen verwendet, um die Daten passen.
2. Bestimmen die Rate der Produktbildung mehrerer Umsatz Primer Synthesereaktionen von Anpassungskurven in eine lineare Gleichung für den Fortschritt. Bei wesentlichen Krümmung ist, verwenden Sie die Anfangsgeschwindigkeit Methode ^{13, 14} durch die Daten in eine Single-Exponentialfunktion passend: y = A (e ^{- k t),} wobei y die Produktkonzentration ist, A die Reaktions Amplitude, k die beobachtete Geschwindigkeitskonstante, t die Zeit in Sekunden. Die Steigung der Tangente zum Zeitpunkt = 0 ist die Anfangsgeschwindigkeit.
   HINWEIS: Fit pre-steady state Primer Synthesereaktionen auf eine lineare Gleichung oder dem Ober steady state Burst Gleichung y = A (e ^{- k} _burst ^t) + Rate _ss t, wobei A die Reaktions Amplitude, k _Burst ist die beobachtete Geschwindigkeitskonstante für die Pre-Steady - State - Burst - Rate _ss ist die Steady-State - Rate _ss = k _cat [Enzym]), t die Zeit , in Sekunden. Fit Einzel Umsatz Primer Synthesereaktionen Verlaufskurven auf einer Single-Exponentialfunktion y = A (e ^{- k t).} Im Falle von gp4, passen die Daten durch numerische Integration ¹⁵ zu einem Modell mit drei NTP Kondensationsschritten, wobei jeder Zwischen in Gleichgewicht mit dem Enzym ist, im Handel erhältliche Software.

Ergebnisse

Die Ergebnisse in Figur 1A gezeigt sind, wurden wie in Schritt 1 des Protokolls beschrieben erhalten, dh durch eine manuell Primer - Synthesereaktion durch gp4 unter mehreren Bedingungen Umsatz katalysierten Abtasten. Hier kann eine Reihe von Produkten nach der Gelelektrophorese unter Verwendung von CTP mit ³² P an der α-Position in Primer - Synthesereaktionen (Abbildung 1A) markiert beobachtet werden. Die markierte ...

Diskussion

Der wichtigste Faktor, diese Experimente in der Durchführung ist die Verfügbarkeit von hoch aktiven gereinigten Enzyms. Während unserer Arbeit mit gp4 zum Beispiel haben wir festgestellt, dass die Lagerung des gereinigten Enzyms in Puffer (20 mM Kaliumphosphat, pH 7,4, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT), enthaltend 50% Glycerin bei -20 ° C führt zu einer Reduktion in die spezifische Aktivität des Präparats über einige Monate. Daher wir nun Flash-freeze kleinen Aliquots von gereinigtem gp4 in 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM Na...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris pre-set crystals pH 7.5	SIGMA	T4128
Tris base	SIGMA	93362
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate	SIGMA	G1501
Magnesium chloride hexahydrate	Mallinckrodt Chemicals	5958-04
1,4-Dithiothreitol	J.T. Baker	F780-02
Sodium Dodecyl Sulfate	MP Biomedicals	811030
(Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate	Mallinckrodt Chemicals	4931-04
[α-32P] CTP	PerkinElmer	BLU508H	radioactive, take protective measures
[γ-32P] ATP	PerkinElmer	BLU502A	radioactive, take protective measures
100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP	Affymetrix	77100	four dNTPs part of set
100 mM ATP and CTP	Epicentre	RN02825	part of NTP set
ssDNA constructs	Integrated DNA Technologies	N/A	custom sequences
methanol	Macron Fine Chemicals	3017-08
formamide	Thermo Scientific	17899
bromophenol blue	SIGMA	B8026
cylene xyanol	SIGMA	X4126
acrylamide	SIGMA	A9099	Toxic
N,N′-Methylenebisacrylamide	SIGMA	M7279	Toxic
Urea	Boston Bioproducts	P-940
Boric acid	Mallinckrodt Chemicals	2549
Rapid Quench-Flow Instrument	Kintek Corp.	RQF-3
Kintek Explorer	Kintek Corp.	N/A
Kaleidagraph	Synergy Software	N/A