遅行本鎖DNA合成の動態<em&gt;インビトロ</em&gt;バクテリオファージT7複製タンパク質によって

要約

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

要約

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

概要

DNAの複製は、すべての細胞の生命の保存機能です。アイデンティティおよびレプリケーション・コンポーネントの数は広く変化するが、一般的なメカニズムが進化¹間で共有されています。ここで、我々は、T7レプリソームのコンポーネントによってインビトロでラギング鎖DNA合成の動態を理解することを目的とした放射性基質を使用して、ゲルに基づく、不連続動態実験を記載します。バクテリオファージT7の複製機構は、4つのタンパク質（DNAポリメラーゼ、GP5、そのプロセッシング因子、 大腸菌チオレドキシン、二官能性プライマーゼ、ヘリカーゼGP4、及び一本鎖DNA結合タンパク質、GP2からなる非常に簡単です。 ^5）2。この機能は、DNA複製に関与する保存された生化学的機構を研究するための魅力的なモデルシステムになります。

特別重点は、プライマーゼT7 DNA、criticaによりリボヌクレオチドプライマーの形成に配置されていますDNA合成の開始におけるL段階。また、一つは、反応混合物に含めることにより、T7 DNAポリメラーゼ、または他の複製タンパク質によって、これらのプライマーの使用を調べることができます。 T7プライマーゼ、ヘリカーゼ、GP4は、プライマーゼ認識部位、またはPRS（5'-GTC-3 '）と呼ばれる特定のDNA配列においてDNA合成のためのプライマーの形成を触媒します。 PRS中のシトシンは、サイトの認識のために不可欠であり、不可解ですが、それが製品³にコピーされていません。 GP4によるプライマー合成の最初のステップは、その後トリマーに、そして最終的にpppACCC、pppACCA、またはpppACACは、テンプレート⁴の配列に依存し、機能テトラヌクレオチドプライマーに拡張されたジヌクレオチドpppAC、の形成を含みます。これらのプライマーは、その後もGP4支援プロセス^5,6でDNA合成を開始するために、T7 DNAポリメラーゼによって使用することができます。この点において、プライマーゼドメインは、それらの解離を防止する、テンプレートを使用して非常に短いtetraribonucleotidesを安定させるポリメラーゼ活性部位⁷にプライマー/鋳型の確保に資する方法でDNAポリメラーゼに係合します。これらの手順（RNAプライマー合成、ポリメラーゼへのプライマーのハンドオフ、および拡張子）はラギング鎖を複製するために複数のサイクルで繰り返され、リーディング鎖の複製と調整する必要があります。

ここに記載のアッセイは、高感度であり、適度な時間内に行うことができます。しかし、それらは比較的低いスループットと細心の注意が放射性物質の使用・廃棄に注意が必要です。で反応が進行する速度に応じて、1は、定常または前定常状態のいずれかで反応時間のコースの意味の分析のために適した時間スケールでサンプルを達成するために迅速な急冷装置を採用することがあります。最近、我々はevidencを提供するために、ここに記載のアッセイを使用しました岡崎フラグメントの開始におけるGP4のプライマーゼドメインからのプライマーのリリースの重要性の電子。さらに、当社は、効率的なプライマーの形成と利用^8を促進する上で、タンパク質、gp2.5を結合T7一本鎖DNAのための調節的役割の証拠を発見しました。

プロトコル

注：このような手袋、安全メガネ、白衣、および適切なアクリルの盾として、を含むがこれらに限定されない、個人用保護具の使用を放射性物質の安全な使用、廃棄に関するすべての機関の規制に従ってください。

注：標準緩衝液は、40mMのHEPES-KOH、pHは7.5、50 mMのグルタミン酸カリウム、5mMのDTT、0.1mMのEDTA（このバッファは5倍の濃度で予備製）との各dNTP 0.3 mMの構成されています。 ^{8、9、10に}記載されるようにT7複製タンパク質が精製されます。単一T7プライマーゼ認識部位（5'-GGGTC-3 '、5'-GTGTC-3'、5'-TGGTC-3 '）を含む一本鎖DNAは、DNA合成会社の様々な（長さから購入することができます一本鎖DNAは、T7プライマーゼのために、選択した酵素に依存し得る、ペンタマーは、全長プライマーを合成するための最小テンプレートの長さである¹潜在Cが必須であるように、プライマーは、ポリメラーゼによって伸長される場合に1が、しかし、追加のヌクレオチドが鋳型の3 '末端に存在しなければなりません。反応を10mMのMgCl ₂の最終濃度の添加によって開始し、25℃でインキュベートします。マニュアルサンプルは、5秒以上の時間点に適しています。それよりも短い時間ポイントが必要な場合には、正確なデータを得るために、急速クエンチフロー機器を使用することが推奨されます。

マニュアルサンプリング1.マルチターンオーバープライマー合成反応

1. 実験を開始する前に、ホルムアミド色素緩衝液のアリコート2μL（93％（v / v）のホルムアミド、50mMのEDTA、0.01％キシレンシアノール、および0.01％ブロモフェノールブルー）8 1.5 mLのポリプロピレンチューブに。一般に、管の数は、分析時点の数に等しいです。
2. バッファー（1x）からなる20μLの混合物、0.1 mMのATPとCTP、0.25 mCiの/ mLの^[α-32 P] CTP、0.1μMSSDを準備（六量濃度として表現 - 0.6μMモノマー）NAテンプレート、および0.1μMGP4。
3. 5分間、室温で混合物をインキュベートします。
4. ピペットを用いて混合物の2μLを削除し、無反応制御（時間ゼロ）のためのステップ1.1で調製した1.5 mLチューブに2μLのホルムアミド色素バッファーと混合。
5. （10mMの最終濃度）を反応混合物に0.1 MのMgCl ₂の2μLを追加します。
6. 手動で10秒間隔でピペットを用いて反応混合物の2μLのサンプルを撤回し、ステップ1.1で調製した1.5 mLチューブに予め分配ホルムアミド染料と混合します。
7. ヒートブロックで5分間95℃で熱サンプル。
8. 変性ゲル上にサンプルのアリコートをロードします。ビスアクリルアミド（19：1）、3 M尿素、1×TBE（100mMトリス - ホウ酸、1mMのEDTA）T7プライマーゼによって合成された小さなtetraribonucleotideプライマー製品は、0.4ミリメートルの厚さの25％アクリルアミドでうまく解決されます。
9. chromatograにゲル全体を置きますプラスチック製のラップでPHY紙とカバー。ゲル乾燥機を使用して乾燥ゲル。
10. サンプルの4μLをロードした場合、反応混合物の残りの希釈系列を準備し、クロマトグラフィー紙上にゲル上にロードされた同じボリュームを発見、 すなわち 、希釈のスポット4μL。
    注：これは、反応の間に形成された生成物の濃度を決定するための標準曲線となります。 （5 ² -5 ^6）15,625が、希釈物べきたとえば、TE緩衝液（10mMトリス-HCl、pH8.0の、1mMのEDTA）を用いて5倍希釈を1に1:25の範囲にわたる、うまく機能します活動のレベルに応じて調整します。
11. ホスホイメージャ画面を使用して乾燥ゲルと標準を公開します。希釈系列で放射能を定量化し^、8が記載されているように、標準曲線を作成^、12
    注：反応混合物のT7 DNAポリメラーゼを含めることは、一つのEXAすることができこの酵素による鉱山tetraribonucleotideプライマーの使用を。最適には、ポリメラーゼ濃度は、データの解釈を簡素化するために飽和されるべきです。 0.4μM以上のポリメラーゼ濃度は、良好な結果を与えます。さらに、そのような一本鎖DNA結合タンパク質などの他のタンパク質の効果は、プライマー合成またはラギング鎖開始のいずれかで、このようにして調べることができます。

ラピッドクエンチ機器の使用2.マルチターンオーバープライマー合成反応

1. 反応混合物の調製
   1. 0.5 mCiの/ mLの^[α-32 P] CTPを含むバッファー（1x）、0.2μMGP4六、0.2μMssDNA鋳型、0.6 mMのdNTPを、0.2 mMのATPとCTPを（含む、A液の400μLを準備します。
   2. バッファー（1x）および20mMのMgCl _2を含む、溶液Bの400μLを準備します。
2. 急速クエンチフロー機器の操作
   1. ラップをオンにしますID-クエンチフロー機器;メインメニューが表示された後、楽器キーボードのタイプ7はホームポジションにシリンジポンプを移動します。
   2. 「LOAD」にオープンバッファシリンジ位置。
3. ローディングバッファーシリンジ
   1. ドライブシリンジポートにバッファを含む10 mLシリンジを取り付けます。 「LOAD」にシリンジノブの位置を変更します。
   2. 10 mLのシリンジを用いて、10 mMトリス、pHは7.5、1 mMのEDTAを用いて器具バッファリザーバA及びBを充填し、クエンチ液（250mMのEDTA、および0.2％SDS）を用いて注射器Cを満たします。 inとoutプランジャーを押すことにより気泡を除去。
   3. 「FIRE」にノブの位置を変更します。シリンジポンプバーの位置を調整するタイプ2。プレスバッファが出口ループから出てくるまで、注射器を下げるためにボタンを「DOWN ADJUST」：（継続的にダウン7は-進み、8-大きなステップダウン; 9-小さなステップダウン）。メインメニューに戻るには「ESC」と入力します。
4. ウォッシュチューブ
   1. ATT真空へのACHの出口ライン。サンプルのノブに「FLUSH」に変更します。水平位置にノブを設定して閉じるバッファ用シリンジ。真空をオンにして、10秒間のH ₂ Oで2フラッシュループを浸し、その後10秒間MeOHに浸し。 〜15秒間、または乾燥するまで空気を吸引することにより、ドライループ。
5. 読み込んサンプル
   1. サンプルノブの位置は、「LOAD」に変更します。 1 mLのシリンジに溶液Aを配置します。サンプルロードポートのいずれかに注射器を差し込みます。溶液Bのために繰り返し、反対側のサンプルのロードポートに配置します。
6. 時点のコレクション
   1. メインメニューで、クエンチフロー実行のタイプ1。反応時間（秒）を入力し、Enterキーを押し、「ENTER」。使用する反応ループ回数が表示されます。必要な反応ループに切り替えます。ステップ2.2.4で洗浄手順を繰り返します。
   2. 「LOAD」にサンプルのノブを回します。負荷反応は、ちょうど中央混合室の外側まで、サンプルループをミックス。 FIR」にすべてのノブを回してE "は。すべてのツマミが正しい位置にあることを確認します。
   3. 出口ループの最後に1.5 mLのチューブを置きます。押して反応を実行するために「GO」。ステップ2.2.4で洗浄手順を繰り返します。彼らはドライバーを打つまで、バッファの注射器のAとBをリロードします。
   4. 所望の各時点での手順を繰り返し2.2.6.2-2.2.6.3。例外：開始試薬ゼロ時点のコントロールを急冷（ すなわち 、この場合のMgCl _2）を含む溶液をロードしないでください。
   5. サンプルを収集が終了したら、メインメニューに戻るには「ESC」を入力します。押して「7」は、そのホームポジションにバッファシリンジポンプを返します。
7. インストゥルメントのクリーンアップ
   1. 反応混合物の注射器を取り外します。 「LOAD」の位置にサンプルローディングノブを回します。真空下、10 mLの0.3 NH ₃ PO ₄および10mLのMeOH、続いて10 mLの0.2 N NaOHで各サンプルループを、洗います。
   2. 「LOAD」の位置に注射器のつまみを回します。すべての3 SYRを押し下げますインゲプランジャは、反応やクエンチバッファーを取得します。ウォッシュは、少なくとも2倍の5mLのH ₂ Oで注射器。
   3. 5mLのH ₂ Oで再びシリンジを記入し、「FIRE」の位置にノブを回します。ノブの位置を変更し、ステップ2.2.4のようにフラッシュのH ₂ Oを除去するために、真空をオンにします。楽器の電源をオフにします。
      注：手順1.7から1.12に記載されているように製品を分析しています。また、T7 DNAポリメラーゼおよび他の複製タンパク質は、プライマー合成または伸長に対する効果を分析するために反応混合物に添加することができます。

3.シングルターンオーバープライマー合成反応

注：シングルターンオーバープライマー合成/伸長アッセイは、いくつかの主要な違いは、複数のターンオーバー反応と同様に実施されています。これらのアッセイは、プライマーまたは拡張製品に放射性標識されたATPの変換に従う、しかし基質の濃度およびタンパク質はconsideraありますBLY高いです。また、プライマー合成反応の分析を可能にするために、ミリ秒の分解能を達成するために、一方が急速クエンチフロー・マシンを利用しなければなりません。

1. 反応混合物を調製します。
   1. 1×緩衝液を含む、A液の400μLを準備し、3μMGP4量体、6μMssDNA鋳型、0.6 mMのdNTPを、1 mMのCTP、および2 nMの^[γ-32 P] ATP。バッファー（1x）および20mMのMgCl _2を含む、溶液Bの400μLを準備します。
2. 急速クエンチフロー操作
   1. ステップ2.2で説明したように反応を行います。必要であれば、それぞれ、15μMおよび20μMの濃度で、T7 DNAポリメラーゼまたはT7一本鎖DNA結合タンパク質を追加します。この場合には、伸長生成物は、反応の手動サンプリングを可能にする時間体制で蓄積します。

4.データ解析

1. 非線形least-にフィット製品プログレス曲線最小二乗フィットおよび/または数値積分することのできる市販のソフトウェアを使用して正方形モデル。動作の詳細は、使用するソフトウェアによって変化しますが、以下のデータをフィッティングするために使用される方程式の一般形であるだろう。
2. 線形方程式にカーブを進行するために適合させることによって、複数の代謝回転プライマー合成反応の生成物形​​成の速度を決定します。かなりの曲率がある場合、単一指数関数にデータを当てはめることにより初速度法^13、14を使用^する ：Y = A（E ^{- Tを K）y}は、生成物濃度であり、Aは、反応の振幅であり、kは観察された速度定数、tは時間（秒）です。時間= 0における接線の傾きは、初速度です。
   注： ^{- k個} _府線形方程式にまたは前定常状態バースト方程式y = A（Eへ前定常状態のプライマー合成反応をフィットAは反応振幅で第1の^T）+レート_{SS t}は、k個の _{バーストは、}前定常状態のバーストのために観察された速度定数であり、レート_ssは定常状態速度_SS = _の k _cat [酵素]）であり、tは時間であります、 すぐに。シングルターンオーバープライマーの合成反応は、シングル指数関数y = A（ ^{- トンを K} E）に進行曲線フィット。 GP4の場合には、市販のソフトウェアを使用して、各中間体は、酵素と平衡状態に。3つのNTP縮合段階でモデルに、数値積分¹⁵によってデータをフィット。

結果

手動多代謝回転条件下GP4によって触媒されるプライマーの合成反応をサンプリングすることによって、 すなわち 、プロトコルのステップ1に記載したように、図1Aに示した結果が得られました。ここで、ゲル電気泳動後の製品の範囲は、プライマー合成反応（ 図1A）内のα位の³² Pで標識されたCTPを用いて観察するこ...

ディスカッション

これらの実験を行う際に最も重要な要因は、高活性精製された酵素の利用です。 GP4との作業中に、例えば、我々は、-20℃で50％グリセロールを含むそのバッファ中の精製酵素の貯蔵（20 mMリン酸カリウム、pH7.4中、0.1mMのEDTA、1mMのDTT）に見出さはの減少をもたらします数ヶ月にわたる準備の具体的な活動。したがって、我々は今、精製25mMトリス - 塩酸、pH7.5の、50mMのNaCl、0.1mMのEDTA、1mMのTCEPで...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris pre-set crystals pH 7.5	SIGMA	T4128
Tris base	SIGMA	93362
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate	SIGMA	G1501
Magnesium chloride hexahydrate	Mallinckrodt Chemicals	5958-04
1,4-Dithiothreitol	J.T. Baker	F780-02
Sodium Dodecyl Sulfate	MP Biomedicals	811030
(Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate	Mallinckrodt Chemicals	4931-04
[α-32P] CTP	PerkinElmer	BLU508H	radioactive, take protective measures
[γ-32P] ATP	PerkinElmer	BLU502A	radioactive, take protective measures
100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP	Affymetrix	77100	four dNTPs part of set
100 mM ATP and CTP	Epicentre	RN02825	part of NTP set
ssDNA constructs	Integrated DNA Technologies	N/A	custom sequences
methanol	Macron Fine Chemicals	3017-08
formamide	Thermo Scientific	17899
bromophenol blue	SIGMA	B8026
cylene xyanol	SIGMA	X4126
acrylamide	SIGMA	A9099	Toxic
N,N′-Methylenebisacrylamide	SIGMA	M7279	Toxic
Urea	Boston Bioproducts	P-940
Boric acid	Mallinckrodt Chemicals	2549
Rapid Quench-Flow Instrument	Kintek Corp.	RQF-3
Kintek Explorer	Kintek Corp.	N/A
Kaleidagraph	Synergy Software	N/A