Кинетика синтеза Отставание-нити ДНК<em&gt; In Vitro</em&gt; С помощью бактериофага Т7 белков репликации

Резюме

We describe sensitive, gel-based discontinuous assays to examine the kinetics of lagging-strand initiation using the replication proteins of bacteriophage T7.

Аннотация

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 replisome is one of the simplest replication systems known, composed of only four proteins, which is an attractive feature for biochemical experiments. Special emphasis is placed on the synthesis of ribonucleotide primers by the T7 primase-helicase, which are used by DNA polymerase to initiate DNA synthesis. Because the mechanisms of DNA replication are conserved across evolution, these protocols should be applicable, or useful as a conceptual springboard, to investigators using other model systems. The protocols described here are highly sensitive and an experienced investigator can perform these experiments and obtain data for analysis in about a day. The only specialized piece of equipment required is a rapid-quench flow instrument, but this piece of equipment is relatively common and available from various commercial sources. The major drawbacks of these assays, however, include the use of radioactivity and the relative low throughput.

Введение

Репликация ДНК является сохраняющимся особенностью всех клеточной жизни. В то время как идентичность и количество компонентов репликации варьироваться в широких пределах, общие механизмы являются общими для эволюции ^1. Здесь мы опишем гель на основе, разрывные кинетических экспериментов, с использованием радиоактивных субстратов, направленных на понимание кинетики отстающей нити синтеза ДНК в пробирке компонентами Т7 replisome. Механизм репликации бактериофага Т7 является очень простой, состоящий только из четырех белков (ДНК - полимеразы, GP5, а его коэффициент процессивности, E.coli тиоредоксин, бифункциональные праймаза-хеликаза GP4 и связывания одноцепочечной ДНК белка, GP2. 5) ^2. Эта особенность делает его привлекательным модель системы для изучения биохимических консервативных механизмов, участвующих в репликации ДНК.

Особый акцент делается на формирование рибонуклеотид праймеров Т7 ДНК праймаза, а Criticaл шаг в инициации синтеза ДНК. Кроме того, можно также рассмотреть использование этих праймеров ДНК-полимеразы Т7 или другие белки репликации путем включения их в реакционной смеси. Т7 праймаза-хеликаза, gp4, катализирует образование праймеров для синтеза ДНК в специфических последовательностей ДНК, называемых праймаза сайты узнавания, или ССБ (5'-GTC-3 '). Цитозин в ССБ маскировочная, важно для распознавания сайта, но не копируется в продукт ^3. Первым шагом в синтезе праймера GP4 предполагает формирование динуклеотиде pppAC, который затем распространяется на тример, и в конечном итоге к функциональным тетрануклеотидных праймеров pppACCC, pppACCA или pppACAC в зависимости от последовательности в шаблоне ^4. Эти праймеры могут быть использованы с помощью ДНК - полимеразы Т7 для инициации синтеза ДНК, который также является процессом gp4 при содействии ^{5, 6.} В связи с этим, праймазадомен стабилизирует чрезвычайно короткие tetraribonucleotides с шаблоном, предотвращая их диссоциации, входит в зацепление ДНК - полимеразы в форме , способствующей обеспечению праймера / шаблон в полимераза активного сайта ^7. Эти шаги (синтез РНК праймера, праймера для передачи обслуживания полимеразы и расширения) повторяются в нескольких циклах, чтобы повторить отстающей нити и должны быть согласованы с репликацией ведущей нити.

Анализы, описанные здесь, обладают высокой чувствительностью и могут быть выполнены в умеренном сроки. Тем не менее, они являются относительно низкими пропускной способности и большое внимание должно быть осуществлено в использовании и утилизации радиоактивных материалов. В зависимости от скорости, при которой реакция протекает, можно было бы возможность использовать более быстрого резкого охлаждения инструмента для достижения пробы на временных масштабах, поддающихся для содержательного анализа времени реакции курсов в любом неуклонный или предварительно установившемся состоянии. В последнее время мы использовали анализы описанные здесь, чтобы обеспечить evidencе важности высвобождения праймера из праймаза домена GP4 в инициации Окадзаки фрагментов. Кроме того, мы нашли доказательства регуляторной роли Т7 одноцепочечной ДНК - связывающего белка, gp2.5, в содействии эффективному формированию и использованию ⁸ праймера.

протокол

Примечание: Соблюдайте все институциональные правила, касающиеся безопасного использования и утилизации радиоактивных материалов, в том числе, но не ограничиваясь этим, использование средств индивидуальной защиты, такие как перчатки, защитные очки, лабораторный халат, а также соответствующие акриловые щиты.

Примечание: Стандартный буфер состоит из 40 мМ HEPES-KOH, рН 7,5, 50 мМ глутамата калия, 5 мМ ДТТ, 0,1 мМ ЭДТА (этот буфер предварительно сделанный в концентрации 5х) и 0,3 мМ каждого из дНТФ. Белки репликации Т7 очищены , как описано ^{8, 9, 10.} Одноцепочечной ДНК, содержащий единственный Т7 распознавания праймаза сайт (5'-GGGTC-3 ', 5'-GTGTC-3', 5'-TGGTC-3 ') могут быть приобретены из различных синтеза ДНК компаний (длина оцДНК может зависеть от фермента выбора, для T7 праймаза, пентамер минимальная длина шаблона для синтеза полной длины праймера ¹1, так как зашифрованное С имеет важное значение, однако, если праймер должен быть расширен с помощью полимеразы, дополнительные нуклеотиды должны присутствовать на 3' - конце шаблона. Реакции инициировали добавлением конечной концентрации 10 мМ MgCl ₂ и инкубировали при 25 ° С. Ручной отбор проб хорошо подходит для временных точек 5 секунд или больше. Если моменты времени короче, которые необходимы, рекомендуется использовать инструмент потока быстрого резкого охлаждения для получения точных данных.

1. множественным оборот Праймер реакции синтеза путем ручного отбора проб

1. Перед началом эксперимента, аликвоту 2 мкл буфера формамиде красителя (93% (об / об) формамида, 50 мМ ЭДТА, 0,01% cyanol ксилол и 0,01% голубой бромфениловый) в 8 мл 1,5 полипропиленовые пробирки. В общем, количество трубок равно числу временных точках анализируемых.
2. Готовят 20 мкл смеси в буфер , состоящий 1x, 0,1 мМ АТФ и CTP, 0,25 мКи / мл [α- ³² P] CTP, 0,1 мкМ ССДшаблон Н.А., и 0,1 мкМ gp4 (выраженное в виде концентрации гексамерной - 0,6 мкМ мономера).
3. Выдержите смесь при комнатной температуре в течение 5 мин.
4. Удалить 2 мкл смеси с использованием пипетки и смешивают с 2 мкл буфера формамид красителя в 1,5 мл трубки, полученного на стадии 1.1 для без контроля реакции (время ноль).
5. Добавляют 2 мкл 0,1 М MgCl ₂ в реакционной смеси (до конечной концентрации 10 мМ).
6. Вручную вывести 2 мкл образцов реакционных смесей с использованием пипетки на 10 с интервалами и смешивают с формамиде красителем predispensed в 1,5 мл пробирки, приготовленным на стадии 1.1.
7. Образцы тепла при 95 ° С в течение 5 мин в тепловом блоке.
8. Загрузите аликвот образцов на денатурирующем геле. Мелкие продукты праймера tetraribonucleotide синтезированные Т7 праймаза разрешаются наилучшим образом на 0,4 мм толщиной 25% акриламид: бис-акриламид (19: 1), 3 М мочевины, 1x КЭ (100 мМ Трис-борат, 1 мМ ЭДТА).
9. Поместите весь гель на хроматогPHY бумаги и накрыть полиэтиленовой пленкой. Сухой гель с использованием гель-осушитель.
10. Готовят серии разведений на оставшуюся часть реакционной смеси и определить тот же объем загруженного на гель на хроматографическую бумагу, то есть, SPOT 4 мкл разведения , если были загружены 4 мкл образца.
    Примечание: Это будет служить в качестве стандартной кривой для определения концентрации продуктов , образующихся в ходе реакции. Например, пятикратных разведений с использованием буфера ТЕ (10 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА) хорошо работают, охватывающих диапазон 1:25 до 1: 15625 (5 ² -5 ^6), но их разбавленные можно регулировать в зависимости от уровня активности.
11. Expose сухой гель и стандарт, используя экран Phosphorimager. Количественно радиоактивность в серии разведений и построить калибровочную кривую , как описано ^{8, 12}
    Примечание: Включение ДНК - полимеразы Т7 в реакционной смеси позволяет Exaмое использование tetraribonucleotide праймеров этим ферментом. Оптимально, концентрация полимераза должна быть насыщающей для упрощения интерпретации данных. Концентрация полимераза 0,4 мкМ или выше дает хорошие результаты. Кроме того, эффект от других белков, таких как одноцепочечных ДНК-связывающие белки, либо на праймером синтеза или отстающей нити инициации можно рассматривать таким образом.

2. множественным оборот Праймер реакции синтеза с помощью экспресс-закалке инструмента

1. Приготовление реакционных смесей
   1. Подготовьте 400 мкл раствора А, содержащий 1х буфер, 0,2 мкМ gp4 гексамерный, 0,2 мкМ оцДНК шаблон, 0,6 мМ дНТФ, 0,2 мМ АТФ и СТР ( в том числе 0,5 мКи / мл [альфа- ³² Р] CTP.
   2. Подготовьте 400 мкл раствора Б, содержащий 1x буфера и 20 мМ MgCl _2.
2. Эксплуатация прибора потока быстрого резкого охлаждения
   1. Включите рэпинструмент потока ID-закалка; после того, как появится главное меню, тип 7 ​​на приборной клавиатуре для перемещения водителя шприца в исходное положение.
   2. Открыть буфер позиции шприц "ГРУЗ".
3. Загрузка буфера шприцы
   1. Приложить 10 мл шприц, содержащий буфер к порту привода шприца. Изменение шприца положение ручки, чтобы "ГРУЗ".
   2. Используя 10 мл шприцы, заполнить инструмент буферного резервуара А и В с 10 мМ Трис, рН 7,5, 1 мМ ЭДТА и заполнить шприц C с раствором быстрого охлаждения (250 мМ ЭДТА и 0,2% ДСН). Удалите пузырьки воздуха, нажав плунжеры и выход.
   3. Изменение положения ручки к "FIRE". Тип 2 для регулировки положения панели водителя шприц. Нажмите "ADJUST DOWN" кнопку, чтобы опустить шприц, пока буфер не выходит из цикла выхода: (7-идет вниз непрерывно; 8-большой шаг вниз; 9-маленький шаг вниз). Введите "ESC" для возврата в главное меню.
4. Мытье трубки
   1. AttACH выхода линии вакуума. Изменение образца ручек "FLUSH". Закрыть буфер шприц, установив ручки в горизонтальное положение. Включите вакуум и опустите петли 2 заподлицо в H ₂ O в течение 10 секунд, а затем окунуть в MeOH в течение 10 с. Сухие петли путем всасывания воздуха в течение ~ 15 секунд, или до полного высыхания.
5. Загрузка образцов
   1. Изменить образец положение ручки "ГРУЗ". Поместите раствор А в шприц емкостью 1 мл. Вставьте шприц в один из портов образца нагрузки. Повторите эти действия для раствора Б, и поместите в противоположном порту образца нагрузки.
6. Сборник временных точках
   1. В главном меню введите 1 для запуска быстрого охлаждения потока. Введите время реакции (ы) и нажмите "ENTER". Номер цикла реакции на использование будет отображаться. Переход к требуемой реакции петли. Повторите процедуру промывки на этапе 2.2.4.
   2. Включите образцы ручек "Load". Реакция Нагрузка смешивается в циклах выборки пока только за пределами центральной смесительной камере. Включите все ручки, чтобы "FIRE ". Убедитесь, что все ручки находятся в правильном положении.
   3. Поместите 1,5 мл трубки на конце цикла выхода. Нажмите кнопку "GO", чтобы запустить реакцию. Повторите процедуру промывки на этапе 2.2.4. Обновить буфер шприцы А и В, пока они не попали в водителя.
   4. Повторите шаги 2.2.6.2-2.2.6.3 для каждой нужной точке времени. Исключение: Не загружать раствор , содержащий стартовый реагент (т.е., MgCl ₂ в данном случае) , когда гашение контроль нулевого момента времени.
   5. По окончании сбора образцов, введите "ESC" для возврата в главное меню. Нажмите "7" для возврата драйвера буфера шприца в исходное положение.
7. Инструмент очистки
   1. Удалить реакционные шприцы смеси. Поверните ручку загрузки образца в положение "LOAD". Под вакуумом, промойте каждую петлю образца с 10 мл 0,2 N NaOH, а затем 10 мл 0,3 NH ₃ PO ₄ и 10 мл метанола.
   2. Поверните шприц ручки в положение "LOAD". Надавите на всех 3 СыраИнге плунжеры для получения реакции и утолить буферов. Вымойте шприцы 5 мл H ₂ O , по крайней мере в два раза.
   3. Заполните шприцы снова с 5 мл H ₂ O и поверните ручки в положение "FIRE". Изменение позиции ручки и включите вакуум для удаления H ₂ O. Flush как на этапе 2.2.4. Выключите прибор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Продукты анализируют , как описано в пунктах 1.7-1.12. Кроме того, ДНК-полимеразы Т7 и другие белки репликации могут быть добавлены в реакционную смесь, чтобы проанализировать их влияние на синтез праймера или расширения.

3. Single-оборот Праймер реакции синтеза

Примечание: Single-оборот праймера синтез / расширения анализы проводят аналогично множественным оборота реакций, с помощью нескольких основных отличий: эти анализы следуют преобразование меченного АТФ в грунтовке или продуктов удлинения, однако концентрация субстратов и белки являются consideraБлай выше. Кроме того, для достижения точностью до миллисекунд проведения анализа реакции синтеза праймер, необходимо использовать машину потока быстрого резкого охлаждения.

1. Приготовление реакционных смесей.
   1. Подготовить 400 мкл раствора А, содержащий 1x буфер, 3 мкМ gp4 гексамер, 6 мкМ оцДНК шаблон, 0,6 мМ дНТФ, 1 мМ CTP и 2 нМ [γ- ³² P] ATP. Подготовьте 400 мкл раствора Б, содержащий 1x буфера и 20 мМ MgCl _2.
2. Операция потока Rapid-закалка
   1. Проведение реакций, как описано в шаге 2.2. При желании добавить ДНК-полимеразы Т7 или Т7 одноцепочечной ДНК-связывающий белок в концентрации 15 мкМ и 20 мкМ, соответственно. В этом случае расширение продукты накапливаются в режиме времени, который позволяет для ручного отбора пробы реакции.

Анализ 4. Данные

1. Fit кривые прогресса продукт нелинейными наименьшихМодели квадратов с использованием коммерчески доступного программного обеспечения, способных наименьших квадратов припадки и / или численного интегрирования. Подробности операции будут изменяться в зависимости от программного обеспечения, используемого, но ниже, являются генерализованные формы уравнений, используемых для подгонки данных.
2. Определить скорость образования продукта множественных реакций синтеза праймера оборот путем подгонки кривых прогрессировать к линейному уравнению. Если существует значительная кривизна, используют метод начальной скорости ^{13, 14} путем подгонки данных к одной-экспоненциальной функции: у = А (е ^{- к т),} где Y представляет собой концентрацию продукта, амплитуда реакции, к- константа наблюдаемая скорость, т время, в секундах. Наклон касательной линии в момент времени = 0 начальная скорость.
   Примечание: Установить предварительно установившегося синтез состояния праймера реакции на линейное уравнение или к предварительно установившегося состояния лопнуть уравнения у = А (е ^{- к} _BUпервый ^т) + скорость _сс т, где А амплитуда реакции, к _{серийной съемки} наблюдаемая константа скорости до стационарного состояния всплеска, _сс скорость является Стационарная скорость _сс = к _кот [Фермент]), т время , в считанные секунды. Fit одного оборота реакции синтеза праймера кривые на одной-экспоненциальной функции у = прогресс (е ^{- к т).} В случае GP4, соответствует данным численным интегрированием ^15, в модели с тремя шагами конденсации NTP, где каждый промежуточный находится в равновесии с ферментом, с использованием коммерчески доступного программного обеспечения.

Результаты

Результаты , показанные на рисунке 1А , были получены , как описано в шаге 1 протокола, т.е. вручную путем выборки реакции синтеза праймера , катализируемый GP4 в условиях множественного оборота. Здесь целый ряд продуктов , после того, как гель - элект?...

Обсуждение

Самым важным фактором при проведении этих экспериментов является наличие высокой активности очищенного фермента. В ходе работы с GP4, например, мы обнаружили, что хранение очищенного фермента в буфере (20 мМ фосфата калия, рН 7,4, 0,1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ), содержащей 50% глицерина при температуре о...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris pre-set crystals pH 7.5	SIGMA	T4128
Tris base	SIGMA	93362
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate	SIGMA	G1501
Magnesium chloride hexahydrate	Mallinckrodt Chemicals	5958-04
1,4-Dithiothreitol	J.T. Baker	F780-02
Sodium Dodecyl Sulfate	MP Biomedicals	811030
(Ethylenedinitrilo) Tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate	Mallinckrodt Chemicals	4931-04
[α-32P] CTP	PerkinElmer	BLU508H	radioactive, take protective measures
[γ-32P] ATP	PerkinElmer	BLU502A	radioactive, take protective measures
100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP	Affymetrix	77100	four dNTPs part of set
100 mM ATP and CTP	Epicentre	RN02825	part of NTP set
ssDNA constructs	Integrated DNA Technologies	N/A	custom sequences
methanol	Macron Fine Chemicals	3017-08
formamide	Thermo Scientific	17899
bromophenol blue	SIGMA	B8026
cylene xyanol	SIGMA	X4126
acrylamide	SIGMA	A9099	Toxic
N,N′-Methylenebisacrylamide	SIGMA	M7279	Toxic
Urea	Boston Bioproducts	P-940
Boric acid	Mallinckrodt Chemicals	2549
Rapid Quench-Flow Instrument	Kintek Corp.	RQF-3
Kintek Explorer	Kintek Corp.	N/A
Kaleidagraph	Synergy Software	N/A