جيل من الإنشطار بروتين فلوري في<em&gt; المبيضات</em&gt; الأنواع

Summary

تعديل الجينات بوساطة PCR-يمكن استخدامها لتوليد اندماج بروتين فلوري في أنواع المبيضات، مما يسهل التصور والكميات من خلايا الخميرة والبروتينات. هنا، نقدم استراتيجية لبناء البروتين الانصهار فلوري (Eno1-FP) في المبيضات المرطية.

Abstract

المبيضات، المستعمرون السائد في مساحات والأمعاء والجهاز البولي التناسلي، هي سبب معظم الأمراض الفطرية الغازية في البشر. وبالتالي، هناك حاجة إلى أدوات الجزيئية والجينية لتسهيل دراسة الآليات المرضية الخاصة بهم. تعديل الجينات بوساطة PCR-هو نهج واضحة وسريعة لتوليد البروتينات الموسومة حاتمة لتسهيل الكشف عنها. على وجه الخصوص، البروتين الفلوري (FP) اندماج هي أدوات قوية التي تسمح التصور والكميات من كل من خلايا الخميرة والبروتينات بواسطة المجهر مضان وimmunoblotting، على التوالي. البلازميدات تحتوي FP تسلسل الترميز، جنبا إلى جنب مع الجينات علامة الغذائية التي تسهل التحول من المبيضات، تم إنشاؤها لغرض بناء FP والتعبير في المبيضات. هنا، نقدم استراتيجية لبناء الانصهار FP في المبيضات. البلازميدات التي تحتوي على المقاومة nourseothricinالامتحانات التنافسية الوطنية الجينات التحول علامة (NAT1) جنبا إلى جنب مع تسلسل إما أخضر، أصفر، أو الكرز ضباط الإتصال (GFP، YFP، mCherry) تستخدم جنبا إلى جنب مع الاشعال التي تشمل تسلسل الجينات المحددة في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) لإنشاء كاسيت FP . هذا كاسيت جين معين لديه القدرة على الاندماج في نهاية 3'من مكان الجين المقابل عبر إعادة التركيب مثلي. يتم التحقق من نجاح الانصهار في إطار تسلسل FP في موضع الجينات في المصالح وراثيا، تليها تحليل التعبير انصهار بروتين بواسطة المجهر و / أو الطرق المناعية الكشف. وبالإضافة إلى ذلك، لحالة من البروتينات أعرب للغاية، اندماج ناجحة يمكن فرزهم لفي المقام الأول من خلال تقنيات التصوير مضان.

Introduction

المبيضات والفطريات المتعايشة التي تستعمر مساحات المعوية والجهاز البولي التناسلي من كل البشر. في ظل ظروف من نقص المناعة، مثل التي تحدث مع الولادة المبكرة أو الآثار المثبطة للمناعة من العلاجات لمرض السرطان، فهناك أنواع المبيضات تصبح مسببات الأمراض الانتهازية. من المبيضات، المبيضات البيض هو المستعمر الفطرية الأكثر انتشارا ويتسبب في غالبية الإصابات الفطرية الغازية. الأنواع الأخرى المبيضات مثل C. الجرداء، C. المرطية، C. مداري، وجيم kruseii يسبب أيضا التهابات خطيرة في المرضى الذين يعانون من نقص المناعة، مع بعض واظهار المقاومة الجوهرية ليشيع استخدامها المضادات الحيوية المضادة للفطريات مثل فلوكونازول وأمفوتيريسين B. ومن هنا، يتم مراقبتها العدوى مع بعض من هذه الأنواع أكثر في كثير من الأحيان، وخاصة في المرضى الذين يعالجون قائي مع الأدوية المضادة للفطريات. حتى مع وجود المناسب وفي الوقت المناسبالعلاج المعهد القومي للاتصالات للفطريات، تواصل انتانات المبيضات الغازية لتترافق مع معدلات الاعتلال والوفيات ¹ كبير. ونظرا لأهمية المبيضات في صحة الإنسان، وهناك حاجة إلى أدوات الجزيئية متوفرة التي تسمح للدراسة وتوضيح آليات المرضية الخاصة بهم.

واحد أداة هامة تسمح للباحثين لتصور وتحديد الخلايا الميكروبية والبروتينات التي يتم التعبير هي FP تكنولوجيا الانصهار. تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) تعديل الجينات بوساطة، كما هو موضح في هذه الورقة، يسمح للبناء اندماج بين متواليات FP والبروتين المبيضات الترميز سلسلة من الفائدة في موضع لالجيني. التكامل مستقر للبناء يسهل تحليل تعبير البروتين وكذلك ديناميات البروتين التعريب. البلازميدات تحتوي على تسلسل FP، الأمثل للتعبير في المبيضات البيض والتي يمكن استخدامها في غرام بوساطة PCR-استراتيجية تعديل إيني، وقد تم بناؤها من قبل ^{2، 3، 4، 5.} البلازميدات تحتوي FP التحول "الكاسيت": سلسلة FP ترتبط الجينات علامة الغذائية التي تسهل التحول من C. المبيضة البيضاء وجيم المرطية ^{2، 3، 4، 5، 6، 7.} حاليا البلازميدات المتاحة تحتوي على مجموعة متنوعة من الجينات اختيار الغذائية علامة (URA3، HIS1، ARG4) للتحول من سلالات بعامل نمائي فضلا عن المهيمنة مقاومة المخدرات علامة (NAT1)، مما يسهل التحول من سلالات السريرية التي تفتقر إلى auxotrophies. وبالإضافة إلى ذلك، البلازميدات تحتوي على خيارات لمدة تصل إلى أربع سلاسل FP مختلفة (الأخضر [GFP]، الاصفرث [YFP]، السماوي [CFP]، والكرز [mCherry]) وإما تسلسل إنهاء ADH1 لبناء اندماج بروتين كربوكسي المحطة، أو تسلسل المروج لبناء اندماج البروتين الأمينية النهاية. صممت الاشعال تناظر مع لDNA البلازميد المحيطة كاسيت FP. وبالإضافة إلى ذلك، يحتوي الاشعال أيضا تسلسل 5'تمديد تحمل التماثل إلى الجينات الخميرة التي تهم أن المعلمة، مما يسهل دمج الكاسيت في موضع الجيني عبر إعادة التركيب مثلي (الشكل 1). يتم إنشاء أشرطة FP-جين معين من قبل PCR ثم تتحول إلى خلايا المبيضات جعلت المختصة لامتصاص الحمض النووي عن طريق العلاج مع خلات الليثيوم.

الشكل 1: رسم بياني لكيفية يتم إنشاؤها FP تسلسل اندماج في المبيضات. (A) امب البلازميد الحمض النوويوفاق سلسلة FP والترميز تسلسل nourseothricin المقاومة (NAT1). وتظهر المواقع النسبية للأمام (FWD) وعكس (REV) الاشعال، مع الأجزاء السوداء من الاشعال تشير إلى منطقة تناظر إلى التسلسل البلازميد والأجزاء الأرجواني تدل على المنطقة تماثل الجينات المحددة أو تمديد التمهيدي. يتم تحويل أشرطة (ب) FP إلى المبيضات والاندماج داخل ENO1 موضع الجيني عبر إعادة التركيب مثلي (الخطوط المنقطة). (C) مما أدى FP تسلسل الانصهار في 3'end من ENO1. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

هنا، نقدم مثالا للانصهار بروتين (Eno1-FP) الإنشاءات في المبيضات. نحن نستخدم علامات البلازميدات تحتوي على الجين NAT1 التحول علامة جنبا إلى جنب مع تسلسل ترميز GFP، YFP، أوmCherry (الشكل 2). وتستخدم هذه البلازميدات جنبا إلى جنب مع الاشعال في PCR لتوليد أشرطة الجينات المحددة التي تسهل اندماج ضباط الإتصال إلى نهاية 3'من ENO1، مما أدى إلى التعبير عن Eno1 تنصهر لضباط الإتصال في دورته كربوكسي-محطة.

الشكل 2: خرائط FP البلازميدات التي تحتوي على شريط كاسيت. يشار إلى الأمام (F) وعكس الاشعال (R) المستخدمة لتوليد أشرطة من البلازميدات جنبا إلى جنب مع الموقع النسبي للتناظر لالبلازميدات. تسلسل التمهيدي هي على النحو المبين في الجدول 1. استخدمت F1 و R1 أيضا لتوليد الكاسيت pYFP- NAT1. البلازميد التي تحتوي على كاسيت YFP- NAT1 (pMG2263) مطابق لpMG2120 باستثناء YFP في مكان تسلسل GFP. أحجام الكاسيت: GFP-NAT1، 3.7 KBP. mCherry- NAT1، 3.2 KBP. YFP- NAT1، 3.7 KBP. تم تعديل هذا الرقم من جيرامي نجاد، وآخرون. ⁴ الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Protocol

1. عزل قالب البلازميدات من كولاي

1. تنمو كولاي التي تحتوي على البلازميد قالب بين عشية وضحاها في 10 مرق مل استذابة (LB) + 200 ملغم / لتر الأمبيسلين (AMP) عند 37 درجة مئوية مع الهز.
2. حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 6000 x ج لمدة 2 دقيقة.
3. صب السائل، عزل وتنقية الحمض النووي من كولاي الخلايا عن طريق طريقة موحدة كما هو موضح سابقا في Ausubel وآخرون. ^8.
4. الحمض النووي Resuspend في تريس، EDTA (TE و 10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.0، 1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة 8.0) في تركيز العمل 50-100 نانوغرام / مل.

2. الاشعال التصميم

كتاب تمهيدي	تسلسل التمهيدي
F1	5 " GAGAATTGAAGAAGAGTTGGGAGACAATGCTATCTATGCTGGTAAGGACTTCCACAATGCTCAAACTTTG GGTGGTTCTAAAGGTGAAGAATTATT 3 "
R1	5 'GAGCGTTTGCACCAACAGGCCATCATTTGTGACGAGAGAAGACCTGACGTCATTAGATTGGCACCTTTGC GTAAAACGACGGCCAGTGAATTC 3 "
F2	5 'GAGAATTGAAGAAGAGTTGGGAGACAATGCTATCTATGCTGGTAAGGACTTCCACAATGCTCAAACTTTG GGTGGTGTTTCAAAAGGTGAAGAAGATAAT 3 "
R2	5 'GAGCGTTTGCACCAACAGGCCATCATTTGTGACGAGAGAAGACCTGACGTCATTAGATTGGCACCTTTGC ACTGGATGGCGGCGTTAGTATC 3 "

الجدول 1: تسلسل التمهيدي المستخدمة في هذه الدراسة. النص مائل عريض يشير التماثل إلى ENO1 موضع الجيني، مناطق الخط العادية هي مثلي لDNA البلازميد.

<لى> الاشعال تصميم لتكون مثلي إلى البلازميد تسلسل المطلة على الكاسيت إلى أن تتضخم وكذلك إلى نهاية 3'من الجين المستهدف من الفائدة (على سبيل المثال ENO1) لتسهيل إعادة التركيب في مكان الجيني للجين (الشكل 2 والجدول 1) .
1. تأكد من أن تسلسل التمهيدي إلى الأمام تطابق مشاركة 70 أزواج قاعدة (بي بي) من الجينات في المصالح، 5'- 3 "، ناقص وقف كودون، إلى الحفاظ على إطار الترميز، بالإضافة إلى أول ما يقرب من 30 سنة مضت من التسلسل البلازميد يكون تضخيمها. كملاحظة، وGGTGGTGGTT في كل التمهيدي هو رابط بولي جليكاين مع عدم وجود تناظر FP. وتجدر الإشارة، في ظل عدم وجود رابط، يمكن أن يكون هناك انصهار المباشر من المجالات الوظيفية، والذي يمكن أن يؤدي نظريا إلى misfolding البروتين، العائد المنخفض في إنتاج البروتين، أو النشاط الحيوي ضعف.
2. تأكد من أن تسلسل التمهيدي العكسي هي 70 نقطة أساس فقط المصب من الجينات، 3'- 5، وليس بما في ذلك أي تسلسل الجينات، بالإضافة إلى APPRO الماضيximately 30 سنة مضت من علامة الغذائية أو مقاومة العقاقير المستخدمة في البلازميد.
3. استخدام F1 و R1 لتوليد GFP- NAT1 وYFP- NAT1 أشرطة مع pMG2120 وpMG2263 على التوالي و F2 و R2 لتوليد mCherry- NAT1 مع pMG2343.

3. توليد FP كاسيت بواسطة PCR (يوم 1)

1. إعداد الكواشف لPCR. جعل مزيج الرئيسي (500 الحجم النهائي ميكرولتر) وذلك بإضافة كميات وتركيزات التالية لأنبوب 1.5 مل: 50 ميكرولتر عازلة PCR (500 ملم كلوريد البوتاسيوم، و 100 ملي تريس درجة الحموضة 8.0 في الماء)، deoxynucleotides 20 ميكرولتر (dNTPs، خليط الأسهم من النيوكليوتيدات في 10 ملي لكل منهما)، كلوريد المغنيسيوم 40 ميكرولتر 25 ملي و 20 ميكرولتر طهروا البلازميد (من ~ 50-100 نانوغرام / حل سهم ميكرولتر)، 10 ميكرولتر كل الأمام وعكس التمهيدي (من 10 الحلول الأسهم ملم)، 30 طق ميكرولتر البلمرة (عام، 5000 وحدة / مل)، و 320 المياه ميكرولتر.
   1. قسامة 50 ميكرولتر من مزيج الرئيسي في كل من 10 PCR-compatibلو 0.5 مل أنابيب.
2. وضع أنابيب PCR في thermocycler وتشغيل الخطوات التالية: 1 دورة 5 دقائق في 94 درجة مئوية إلى تفسد dsDNA. 40 دورة بالتسلسل من 45 ثانية في 94 درجة مئوية، و 30 ثانية في 55 درجة مئوية للسماح الاشعال ليصلب على البلازميد الحمض النووي القالب، و 4 دقائق عند 68 درجة مئوية لمدة التمديد للمنتجات الحمض النووي. و1 تمديد دورة النهائية لمدة 15 دقيقة عند 72 درجة مئوية.
   قد تحتاج إلى تعديل على أساس البلمرة طق معين يستخدم مزيج الرئيسي PCR والدراجات المعلمات: ملاحظة.
3. تجمع جميع المنتجات من 10 ردود الفعل PCR في أنبوب 1.5 مل.
   1. الموضوع 5 ميكرولتر من الناتج PCR المجمعة لالكهربائي للهلام الاغاروز للتحقق من حجم amplicon والحصول على تقدير تركيز المنتج على أساس المقارنة إلى سلم الحمض النووي. عموما، استخدام ~ 250 ميكروغرام من الحمض النووي كاسيت في كل مزيج تحول لاحقا.
   2. ترسيب الحمض النووي عن طريق إضافة خلات 50 ميكرولتر 3 M الصوديوم تليها 750 ميكرولتر الايثانول 95٪ على المنتجات واحتضان 30 دقيقة على الأقلعند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
   3. حصاد المنتجات PCR بواسطة الطرد المركزي الأنبوب في 16000 x ج لمدة 10 دقيقة. إزالة بعناية وتجاهل طاف وتجفيف بيليه بين عشية وضحاها. Resuspend والمجففة الحمض النووي كاسيت بيليه في 40 ميكرولتر TE الرقم الهيدروجيني 8.0 وتخزين في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام.

4. تحويل خلايا المبيضات مع FP الحمض النووي كاسيت

1. في يوم 1، واستعادة الخميرة سلالة أن تتحول من الجلسرين 15٪ المجمدة (-80 درجة مئوية) الأسهم عن طريق تسليط الضوء على عدد قليل من بلورات كشط على سكر العنب الخميرة ببتون مع الأدينين (YPAD) أجار واحتضان عند 30 درجة مئوية. بعد انتعاش النمو مستعمرة، تلقيح مستعمرة واحدة في 2 مل السائل المتوسطة YPAD في أنبوب ثقافة الزجاج مع غطاء للتنفس واحتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع الإثارة.
2. في يوم 2، وتمييع 300 ميكرولتر من ثقافة خميرة بين عشية وضحاها إلى 50 مل YPAD جديدة (لOD النهائي ₆₀₀ من ~ 0.2) في 125 مل دورق مخروطي مع وضع حد أقصى للتنفس. هزة في 30 ° Cل~ 3 ساعات (إلى OD النهائي ₆₀₀ ~ 0،6-0،8).
   1. صب الثقافة بين عشية وضحاها في أنبوب مخروطي 50 مل وبيليه الخلايا من خلال الدوران لمدة 5 دقائق في 500 x ج 1 في أعلى الجدول الطرد المركزي.
   2. تخلصي وتجاهل بشكل صحيح طاف. resuspend الكرية خلية في 5 مل من الماء. إعادة بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 5 دقائق في 1500 x ج في أعلى الجدول الطرد المركزي.
   3. تخلصي وتجاهل بشكل صحيح طاف. Resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر TELiAc (TE خلات ليثيوم: 10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.0، 1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة 8.0، 0.1 M الليثيوم خلات)، في حين نقل إلى أنبوب 1.5 مل. أنبوب الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 3000 x ج في microcentrifuge.
   4. Resuspend الخلايا في 250 ميكرولتر TELiAc. يجب أن يكون الحجم الكلي بما في ذلك بيليه ~ 300 ميكرولتر.
3. ل(أنبوب مختلفة microfuge من في 4.2.4) نظيف، إضافة 5 ميكرولتر الحمض النووي الناقل (10 ملغ / مل) و 150 ميكرولتر من خلايا المبيضات التحضير (من 4.2.4). هذا هو السيطرة السلبية لرransformation.
   1. لأنبوب الثاني microfuge نظيفة، إضافة 5 ميكرولتر من الحمض النووي الناقل التشويه والتحريف (التي سبق غليه في 90 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ويتم تبريده الى 4 درجات مئوية)، كل ميكرولتر 40 من الناتج PCR استعداد (من 3.3.1) و 150 ميكرولتر من خلايا المبيضات التحضير (من 4.2.4).
   2. احتضان يمزج التحول اثنين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   3. إلى كل أنبوب مزيج التحول، إضافة 700 ميكرولتر مزيج لوحة (10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.0، 1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة 8.0، 0.1 M خلات الليثيوم في 50٪ البولي ايثيلين جلايكول 3350). وعكس أنابيب خلط واحتضان لهم بين عشية وضحاها في RT.
4. في يوم 3، واحتضان التحول يمزج في 42 درجة مئوية لمدة 1 ساعة (الصدمة الحرارية).
   1. أجهزة الطرد المركزي في التحول يخلط لمدة 30 ثانية في 16000 x ج في microcentrifuge. إزالة والتخلص بشكل صحيح طاف. resuspend كل من الكريات الخلايا في 150 ميكرولتر المياه من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا، وذلك لعدم تلف الخلايا.
   2. لتحولات التحريرilizing الجينات علامة بعامل نمائي (على سبيل المثال URA3)، لوحة كل خليط كامل من قبل pipetting الحلول على أجار وسائل الإعلام الانتقائي المناسب (على سبيل المثال يوريدين تفتقر) وانتشرت الخليط بالتساوي باستخدام الخرز الزجاجي معقمة.
   3. لتحولات الاستفادة من nourseothricin الجينات المقاومة علامة (NAT1)، كما هو موضح هنا، تحول لوحة يخلط أولا على أجار YPAD غير انتقائي واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 6-12 ساعة. يتم تطبيق هذه المساعدات خطوة في الانتعاش الخلية، وبعد الصدمة الحرارية، قبل nourseothricin الإجهاد.
   4. بعد انتعاش النمو جزئي، لوحة نسخة طبق الأصل من خلايا المبيضات على YPAD تحتوي على 400 ميكروغرام / مل nourseothricin. لتحولات استخدام الجينات علامة الغذائية (مثل URA3)، ليست هناك حاجة هذه الخطوة الطلاء المتوسطة والخلايا يمكن مطلي مباشرة على وسائل الاعلام خميرة انتقائي (على سبيل المثال YPAD تفتقر يوريدين) كما هو موضح في 4.4.2.
      ملاحظة: إذا كان التحول ناجحا، العقيدonies يجب أن تظهر ضمن 1-3 أيام (يحتمل أن تصل إلى خمسة أيام من ثمرة للاختيار على أجار التي تحتوي على nourseothricin). يجب أن تظهر أي مستعمرات على لوحات مع انتشار يمزج التحول تحتوي على الحمض النووي الناقل وحده (المراقبة السلبية).
5. لبعامل نمائي وnourseothricin اختيار علامة، خط transformants المفترضة كما المستعمرات واحد لوحات أجار وسائل الإعلام الانتقائي الطازجة واحتضان عند 30 درجة مئوية إلى نقل خلايا الخميرة التي يمكن فرزهم عن البناء الناجح للاندماج FP.
6. transformants الشاشة للاندماج الصحيح للكاسيت علامات (انظر ممثل النتائج لمثال تفصيلي). إذا يتم التعبير عن الجينات في المصالح في كميات كافية، قد تحدث كله مستعمرة مضان بحيث بات من الممكن الكشف عن integrants المرشحة المحتملة باستخدام نظام التصوير لوحة مع القدرة الكشف عن مضان.
   1. تحقق integrants المفترضة من قبل PCR باستخدام بادئات مثلي لتسلسل outsid(ه) من منطقة التكامل لتأكيد الاندماج إلى الجين المستهدف.
   2. وبالإضافة إلى ذلك، والنظر في تحليل لطخة غربية لتحديد التعبير وحجم البروتين الانصهار، وكذلك عن طريق الفحص المجهري مضان من الخلايا واحد للتأكيد البصري للتوطين البروتين، إذا كان معروفا.

النتائج

على سبيل المثال، استخدمنا بروتوكول المذكورة أعلاه لبناء GFP وmCherry اندماج لEno1 في C. سلالة المرطية المختبر. وقد restreaked كل المحولة المفترض في البداية للنمو. في هذا المثال، منذ انصهار بروتين الناتج وأعربت غاية (إينولاز) وضباط الإتصال مشرقة، كنا ق?...

Discussion

بناء حاتمة الموسومة تسلسل في المبيضات باستخدام استراتيجية تعديل الجينات بوساطة PCR-المذكورة أعلاه يمكن تلخيصها على النحو عملية من ثلاث خطوات. أولا، يتم إجراء كاسيت من قبل PCR الذي يشفر كل من التسلسل المطلوب لتحقيق التكامل والمناطق مثلي إلى موضع الإدراج في الجينوم...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100W mercury lamp	CHIU Technical Corporation	M-100T
95% Ethanol	Any	NA
Adenine	Any	NA
Ampicillin	Any	NA
Carrier DNA	Ambion	AM9680	Sheared Salmon Sperm DNA 10 mg/ml
CCD Camera	Photometrics	CoolSNAP HQ
Conical Tube	Corning	430828	50ml
Culture Tube Rotator	New Brunswick	2013923	TC-8, or Any Culture Tube Rotator
Deoxynucleotides (dNTP) PCR Grade	Any	NA
Eppendorf Tubes	Eppendorf	022363719, 022363212	0.5ml, 1.5ml
Erlenmeyer Flask	Fisher Scientific	7250089	125ml
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)	Any	NA
Freezer (-80 °C )	Thermo Electron Corporation	ULT-1386-9-V	Revco Ultima II
GFP, YFP and Texas Red Filter Sets	Chroma Technology Corporation	49002, 86004v2, 49008
Glass culture tubes	Fisher Scientific	1496126	75mm
HRP goat anti-mouse antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-2005
HRP goat anti-rabbit antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-2301
Incubator (30 °C )	Any	NA
Lithium Acetate	Any	NA
Lysogeny Broth (LB) Media	Any	NA
Magnesium Chloride	Any	NA
Microcentrifuge	Eppendorf	5415 D
Microscope	Nikon	E600	Nikon Eclipse E600
Microscope Image Analysis Software	Universal Imaging Corporation	6.3r7	MetaMorph Software Series 6.3r7
Mouse anti-GFP antibody	Roche	11814460001
Nourseothricin	Fisher Scientific	50997939
PCR Thermocycler	Applied Biosystems	9700	GeneAmp PCR System
PCR tubes	BioExpress, GeneMate	T-3035-1	0.2ml
Polyethylene Glycol 3350	Any	NA
Potassium Chloride	Any	NA
Rabbit anti-mCherry antibody	BioVision	5993-100
Refrigerator (4°C)	Any	NA
Sodium Acetate	Any	NA
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1500
Table Top Centrifuge	Labnet	Z 400	Hermle Z 400
Taq DNA Polymerase	Any	NA
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)	Any	NA
Vortex Mixer	Scientific Industries	SI-0236	Vortex Genie 2
Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) Media	Any	NA