Поколение флуоресцентных слитых белков в<em&gt; Кандида</em&gt; Виды

Резюме

ПЦР-опосредованный модификация гена может быть использован для создания флуоресцентного белка слитые в видов Candida, что облегчает визуализацию и количественное определение дрожжевых клеток и белков. Здесь мы представляем стратегию построения флуоресцентного белка слияния (Eno1-FP) в Candida parapsilosis.

Аннотация

Видов Candida, распространенных колонизаторами кишечника и мочеполового трактов, являются причиной большинства инвазивных грибковых инфекций у людей. Таким образом, молекулярные и генетические инструменты необходимы, чтобы облегчить изучение механизмов их патогенеза. ПЦР-опосредованный модификация гена является простой и быстрый подход к генерации эпитоп-меченных белков для облегчения их обнаружения. В частности, флуоресцентный белок (FP) расплавы являются мощными инструментами, которые позволяют визуализировать и количественно оценивать обоих дрожжевых клеток и белков с помощью флуоресцентной микроскопии и иммуноблотинга, соответственно. Плазмиды , содержащие кодирующие последовательности FP, наряду с питательными маркерные гены , которые облегчают превращение видов Candida, были получены с целью строительства FP и экспрессии в кандида. Здесь мы представляем стратегию построения фьюжн FP в видах Candida. Плазмиды, содержащие nourseothricin resistaсть гена трансформации маркера (NAT1) наряду с последовательностями либо зеленым, желтым или вишневого FPs (GFP, YFP, mCherry) используются наряду с использованием праймеров , которые включают в себя последовательность генов специфических в полимеразной цепной реакции (ПЦР) , чтобы создать кассету FP , Этот ген-специфический кассета имеет возможность интеграции в 3'-конце соответствующего локуса гена посредством гомологичной рекомбинации. Успешное в рамке считывания слияние последовательности FP в локус гена интереса проверяется генетически, с последующим анализом экспрессии слитого белка с помощью микроскопа и / или методов иммуно-обнаружения. Кроме того, для случая с высоким уровнем экспрессии белков, успешные слитые конструкции могут быть подвергнуты скринингу на в основном с помощью методов флуоресцентной томографии.

Введение

Виды Candida являются синантропных грибы , которые колонизируют кишечника и мочеполового трактов всех людей. В условиях иммунодефицитом, таких как , которые происходят с преждевременными родами или иммуносупрессивные эффекты от лечения рака, виды Candida может стать условно - патогенные возбудители. Из видов Candida, Candida Albicans является наиболее распространенным грибковым колонизатор и вызывает большинство инвазивных грибковых инфекций. Другие виды Candida , такие как C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis и C. kruseii также вызывают серьезные инфекции у пациентов с ослабленным иммунитетом, с некоторым проявляющего внутреннее сопротивление к часто используемым противогрибковые антибиотики , такие как флуконазол и амфотерицин В. Следовательно, инфекции с некоторыми из этих видов наблюдаются чаще, особенно у пациентов, проходящих лечение профилактически с противогрибковыми средствами. Даже при надлежащей и своевременной аNTI-грибковое лечение, инвазивные инфекции Candida по- прежнему связаны со значительной заболеваемостью и смертностью ^1. Из - за важности видов Candida в состоянии здоровья людей, существует потребность в легко доступных молекулярных инструментов , которые позволяют исследование и выяснение механизмов их патогенеза.

Одним из важных инструментов, который позволяет исследователям визуализировать и количественно микробных клеток и белков, которые они выражают это технология слияния FP. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) -опосредованного модификацию гена, как описано в данной работе, позволяет строить слитых конструкций , между ПС последовательностей и белок Кандида интерес последовательность кодирования на его геномного локуса. Стабильной интеграции конструкции облегчает анализ экспрессии белка, а также динамику локализации белков. Плазмиды , содержащие FP последовательности, оптимизированные для экспрессии в Candida Albicans и которые могут быть использованы в ПЦР-опосредованный гСтратегия модификации ена, которые были ранее построены ^{2, 3, 4, 5.} Плазмиды содержат FP трансформация "кассеты": последовательность FP , связанный с питательной маркерного гена , который облегчает преобразование C. Albicans и С. parapsilosis ^{2, 3, 4, 5, 6, 7.} Существующие в настоящее время Плазмиды содержат множество выбираемых питательных генов - маркеров (URA3, HIS1, arg4) для трансформации ауксотрофных штаммов, а также доминирующий устойчивости к лекарственному средству маркер (NAT1), что облегчает преобразование клинических штаммов , не имеющих auxotrophies. Кроме того, плазмиды содержат варианты до четырех различных последовательностей FP (зеленый [GFP], YelloW [YFP], циан [КФП], и вишня [mCherry]) и либо последовательность терминации ADH1 для построения карбоксиконец слитых белков, или последовательность промотора для построения аминоконца слитых белков. Праймеры конструируют с гомологией к плазмидной ДНК, окружающей кассету FP. Кроме того, праймеры также содержат 5'-удлинительные последовательности , несущие гомологию с геном дрожжей , представляющие интерес для быть помеченным, что облегчает интеграцию кассеты в геномную локус посредством гомологичной рекомбинации (рисунок 1). Гено-специфические FP кассеты генерируются с помощью ПЦР , а затем трансформировали в клетки Candida , сделанные компетентными для поглощения ДНК путем обработки ацетатом лития.

Рисунок 1: Схема , как слитые последовательности FP генерируются видов Candida. (А) плазмидной ДНК ВКЛЮЧАЕТэс последовательность FP и последовательности, кодирующей nourseothricin сопротивления (NAT1). Относительное расположение вперед (FWD) и обратном (REV) праймеров показаны с черными частями праймеров, обозначающих область гомологии с последовательностью плазмиды и фиолетовых участков, обозначающих геноспецифических область гомологии или удлинение праймера. (В) FP кассеты превращаются в Кандида и интегрировать в ENO1 геномного локуса посредством гомологичной рекомбинации (пунктирные линии). (C) результирующую последовательность слитого FP на 3'-ENO1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Здесь мы приведем пример слитого белка (Eno1-FP) конструкций у видов Candida. Мы используем мечения плазмид , содержащих ген NAT1 преобразование маркера вместе с последовательностями , кодирующими GFP, YFP, илиmCherry (Рисунок 2). Эти плазмиды используются вместе с праймеров в ПЦР для генерации геноспецифических кассет , которые облегчают слияние РЗУ к 3'-концу ENO1, что приводит к экспрессии слитого с Eno1 FPs на его карбокси-конце.

Рисунок 2: Карты FP кассет , содержащих плазмид. Вперед (F) и обратный праймеры (R), которые используются для создания кассеты из плазмид показаны вместе с относительным расположением их гомологии с плазмидами. Последовательности праймеров, которые перечислены в таблице 1. F1 и R1 были также использованы для создания кассеты pYFP- NAT1. Плазмида , содержащая кассету YFP- NAT1 (pMG2263) идентичен pMG2120 за исключением YFP вместо последовательности GFP. Размеры кассеты: GFP-NAT1, 3,7 KBP; mCherry- NAT1, 3,2 т.п.н.; YFP- NAT1, 3.7 т.п.н.. Эта цифра была изменена из герами-Нежада и др. ⁴ Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

протокол

1. Изолировать Шаблон Плазмиды из E.coli

1. Grow E.coli , содержащий плазмиду шаблон в течение ночи в 10 мл лизогении бульона (LB) + 200 мг / л ампициллина (АМФ) при 37 ° C при встряхивании.
2. Урожай клеток путем центрифугирования при 6000 мкг в течение 2 мин.
3. Декантируют жидкость, выделения и очистки ДНК из E.coli клеток стандартным способом , как описано ранее в Ausubel с соавт. ^8.
4. ДНК Ресуспендируют в Трис-ЭДТА (ТЭ 10 мМ Трис, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0) при рабочей концентрации 50-100 нг / мл.

2. Дизайн Грунтовки

грунтовка	Праймер Последовательность
F1	5 ' GAGAATTGAAGAAGAGTTGGGAGACAATGCTATCTATGCTGGTAAGGACTTCCACAATGCTCAAACTTTG GGTGGTTCTAAAGGTGAAGAATTATT 3 '
R1	5 'GAGCGTTTGCACCAACAGGCCATCATTTGTGACGAGAGAAGACCTGACGTCATTAGATTGGCACCTTTGC GTAAAACGACGGCCAGTGAATTC 3 '
F2	5 'GAGAATTGAAGAAGAGTTGGGAGACAATGCTATCTATGCTGGTAAGGACTTCCACAATGCTCAAACTTTG GGTGGTGTTTCAAAAGGTGAAGAAGATAAT 3 '
R2	5 'GAGCGTTTGCACCAACAGGCCATCATTTGTGACGAGAGAAGACCTGACGTCATTAGATTGGCACCTTTGC ACTGGATGGCGGCGTTAGTATC 3 '

Таблица 1: Последовательности праймеров , используемые в данном исследовании. Жирный Курсив текст указывает гомологии к ENO1 геномного локуса, нормальных областей шрифта гомологичны плазмидной ДНК.

<литий> Дизайн праймеров гомологичными плазмиде последовательности , граничащие кассеты, подлежащей амплификации , а также к 3'-концу гена - мишени , представляющего интерес (например , ENO1) для облегчения рекомбинации в геномную локусе гена (рис 2 и таблица 1) ,
1. Убедитесь, что последовательности прямого праймера соответствуют последние 70 пар оснований (п.о.), из представляющего интерес гена, 5'- 3 ', минус стоп-кодон, для поддержания кадра кодирования, плюс первый приблизительно 30 пар оснований последовательности плазмиды быть усиливается. В записке, в GGTGGTGGTT каждого праймера представляет собой поли-глицина линкер, без FP гомологии. Следует отметить, что при отсутствии линкера, может быть прямым сплавлением функциональных доменов, которые теоретически могут привести к белковой неправильного сворачивания, низким выходом продукции белка, или ослабленным биоактивности.
2. Убедитесь в том, что обратные последовательности праймеров 70 п.н. непосредственно ниже гена, 3'- 5 ', не включая любую последовательность гена, плюс последний APPROximately 30 п.н. питательного или устойчивости к лекарственному средству маркера, используемого в плазмиде.
3. Используйте F1 и R1 для создания GFP- NAT1 и YFP- NAT1 кассеты с pMG2120 и pMG2263, соответственно и F2 и R2 для создания mCherry- NAT1 с pMG2343.

3. Сформировать FP Кассеты с помощью ПЦР (1 день)

1. Подготовка реагентов для ПЦР. Делают основной смеси (500 мкл конечный объем) путем добавления следующих объемы и концентрации в 1,5 мл трубки: 50 мкл ПЦР-буфера (500 мМ хлорида калия, 100 мМ Трис, рН 8,0, в воде), 20 мкл дезоксинуклеотидов (дНТФ; запас смеси нуклеотидов в 10 мМ каждого), 40 мкл 25 мМ хлорида магния, 20 мкл плазмиды очищали (от ~ 50-100 нг / мкл исходного раствора), 10 мкл каждого вперед и обратного праймера (от 10 мМ растворов), 30 мкл Taq полимеразы (родовое, 5000 единиц / мл), и 320 мкл воды.
   1. Аликвоты 50 мкл основной смеси в каждую из 10 ПЦР-compatibле 0,5 мл пробирки.
2. Поместите ПЦР-пробирки в амплификатор и выполните следующие действия: 1 цикл 5 мин при 94 ° С для денатурации дц; 40 циклов последовательно 45 сек при 94 ° С, 30 сек при 55 ° С, чтобы позволить праймеры отжечь с матричной ДНК плазмиды, и 4 мин при 68 ° С для расширения продуктов ДНК; и 1 окончательное удлинение цикла 15 мин при 72 ° С.
   Примечание: Мастер микс ПЦР и велосипедные параметры могут должны быть изменены на основе конкретного Taq полимеразы.
3. Бассейн все продукты из 10 реакций ПЦР в 1,5 мл трубки.
   1. Предметные 5 мкл продукта ПЦР объединенном электрофорезу в агарозном геле, чтобы проверить размер ампликона и получить оценку концентрации продукта, основанный на сравнении с лестницей ДНК. Как правило, используют ~ 250 мкг кассетной ДНК в каждой последующей смеси трансформации.
   2. Осадить ДНК добавлением ацетата 50 мкл 3 М натрия, а затем 750 мкл 95% этанола к продуктам и инкубировать по меньшей мере, 30 минпри -20 ° С
   3. Урожай продуктов ПЦР при центрифугировании трубки при 16000 х г в течение 10 мин. Осторожно снимите и выбросьте супернатант и высушить осадок в течение ночи. Ресуспендируют высушенного кассетной ДНК гранул в 40 мкл ТЕ рН 8,0 и не хранить при комнатной температуре до момента использования.

4. Преобразовать Кандида клетки с ДНК FP кассетах

1. На 1-й день, восстановить штамм дрожжей трансформироваться из 15% глицерина в замороженном состоянии (-80 ° C) запас штриховой разводкой несколько Царапины кристаллов на дрожжевой пептон декстроза с аденин (YPAD) агар и инкубировать при температуре 30 ° C. После восстановления роста колоний, прививают одну колонию в 2 мл жидкой среды YPAD в стеклянной трубке с культуральную воздухопроницаемой крышкой и инкубировать в течение ночи при 30 ° С при перемешивании.
2. На 2 -й день, развести 300 мкл ночной культуры дрожжей в 50 мл свежего YPAD (до конечной OD ₆₀₀ из ~ 0,2) в 125 мл колбу Эрленмейера с воздухопроницаемой крышкой. Встряска при 30 ° Cв течение ~ 3 ч (до конечной OD ₆₀₀ ~ 0,6-0,8).
   1. Налейте Ночную культуру в коническую пробирку емкостью 50 мл, и в пробирке осадка клеток путем прядения в течение 5 мин при 1 500 мкг в настольную центрифугу.
   2. Слить и должным образом отбросить супернатант. Ресуспендируют осадок клеток в 5 мл воды. Повторное осаждения клеток центрифугированием снова в течение 5 мин при 1500 х г в настольную центрифугу.
   3. Слить и должным образом отбросить супернатант. Ресуспендируют клеток в 500 мкл ТЕ (TELiAc ацетат лития: 10 мМ Трис, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0, 0,1 М ацетата лития) при переходе к 1,5 мл трубки. Отцентрифугировать пробирку в течение 2 мин при 3000 х г в микроцентрифуге.
   4. Ресуспендируют клеток в 250 мкл TELiAc. Общий объем в том числе окатышей должна быть ~ 300 мкл.
3. В чистую (другую , чем пробирке в разделе 4.2.4), добавьте по 5 мкл ДНК - носитель (10 мг / мл) и 150 мкл приготовленных клеток Candida (из 4.2.4). Это отрицательный контроль за тransformation.
   1. Для второй чистой пробирке, добавляют 5 мкл денатурированной ДНК-носителя (который кипячения при температуре 90 ° С в течение 10 мин и охлаждают до 4 & deg; С), все 40 мкл полученного продукта ПЦР (из раздела 3.3.1) и 150 мкл подготовленных клеток Candida (от 4.2.4).
   2. Инкубируйте две преобразованные смеси в течение 30 мин при комнатной температуре.
   3. В каждую пробирку смеси трансформации, добавьте 700 мкл PLATE смеси (10 мМ Трис, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0, 0,1 М ацетата лития в 50% полиэтиленгликоль 3350). Обратить трубы, чтобы смешать и инкубировать их в течение ночи при комнатной температуре.
4. На 3-й день, инкубировать превращение смеси при 42 ° С в течение 1 ч (теплового шока).
   1. Центрифуга превращение смеси в течение 30 сек при 16000 мкг в микроцентрифуге. Удалить и надлежащим образом отбросить супернатант. Ресуспендируют каждый из гранул клеток в 150 мкл воды, осторожно пипеткой вверх и вниз таким образом, чтобы не повредить клетки.
   2. Для преобразований утilizing ауксотрофные маркерных генов (например , URA3), плиты каждый всю смесь с помощью пипетки решения на соответствующий селективной среде агара (например , отсутствие уридин) и распределите смесь равномерно , используя стерильные стеклянные шарики.
   3. Для преобразований , использующих nourseothricin ген устойчивости к маркере (NAT1), как описано здесь, преобразование пластина смешивает сначала на неселективного YPAD агар и инкубируют при температуре 30 ° C в течение 6-12 ч. Этот шаг способствует восстановлению клеток, пост теплового шока, перед nourseothricin стресс применяется.
   4. После частичного восстановления роста, реплики пластины клетки кандиды на YPAD , содержащий 400 мкг / мл nourseothricin. Для преобразований , использующих пищевые гены - маркеры (например , URA3), этот промежуточный этап покрытие не требуется , и клетки могут быть непосредственно высевали на селективные среды дрожжей (например , YPAD не хватает уридина) , как описано в разделе 4.4.2.
      Примечание: Если преобразование прошло успешно, Colonies должен появиться в течение от одного до трех дней (потенциально до пяти дней вырост для селекции на nourseothricin содержащих агар). Колонии не должны появляться на пластинах распространяются с трансформацией смесями, содержащими ДНК-носитель в одиночку (отрицательный контроль).
5. Для ауксотрофной и nourseothricin маркера селекции, Штриховатост предполагаемыми трансформантов в виде отдельных колоний на свежий чашках с агаром селективную среду и инкубировали при 30 ° С для распространения дрожжевых клеток, которые могут быть подвергнуты скринингу для успешного строительства ПС слитых конструкций.
6. Трансформанты экрана для правильной интеграции мечения кассеты (см Представитель результаты подробного примера). Если интерес ген экспрессируется в достаточном количестве, вся колония флуоресценция может происходить таким образом, что можно обнаружить потенциальные интегрантов-кандидатов с использованием системы формирования изображения Тарелка с возможностью детектирования флуоресценции.
   1. Проверьте предположительные интегрантов с помощью ПЦР с использованием праймеров, гомологичных последовательностей outsidе области интегрирования для подтверждения слияние с геном-мишенью.
   2. Кроме того, рассмотрим вестерн-блот анализ, чтобы определить экспрессию и размер гибридного белка, а также с помощью флуоресцентной микроскопии одиночных клеток для визуального подтверждения локализации белка, если оно известно.

Результаты

В качестве примера, мы использовали протокол , описанный выше для построения GFP и mCherry слитые к Eno1 в С. parapsilosis лабораторного штамма. Каждый предполагаемый трансформант был первоначально пересевали штрихом для роста. В этом примере, поскольку полученный гибридный б...

Обсуждение

Конструирование эпитопа помечено последовательностей в видов Candida с использованием ПЦР-опосредованный стратегии генной модификации , описанной выше , может быть охарактеризован как трехступенчатый процесс. Во-первых, кассета выполнена с помощью ПЦР, который кодирует и последова...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
100W mercury lamp	CHIU Technical Corporation	M-100T
95% Ethanol	Any	NA
Adenine	Any	NA
Ampicillin	Any	NA
Carrier DNA	Ambion	AM9680	Sheared Salmon Sperm DNA 10 mg/ml
CCD Camera	Photometrics	CoolSNAP HQ
Conical Tube	Corning	430828	50ml
Culture Tube Rotator	New Brunswick	2013923	TC-8, or Any Culture Tube Rotator
Deoxynucleotides (dNTP) PCR Grade	Any	NA
Eppendorf Tubes	Eppendorf	022363719, 022363212	0.5ml, 1.5ml
Erlenmeyer Flask	Fisher Scientific	7250089	125ml
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)	Any	NA
Freezer (-80 °C )	Thermo Electron Corporation	ULT-1386-9-V	Revco Ultima II
GFP, YFP and Texas Red Filter Sets	Chroma Technology Corporation	49002, 86004v2, 49008
Glass culture tubes	Fisher Scientific	1496126	75mm
HRP goat anti-mouse antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-2005
HRP goat anti-rabbit antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-2301
Incubator (30 °C )	Any	NA
Lithium Acetate	Any	NA
Lysogeny Broth (LB) Media	Any	NA
Magnesium Chloride	Any	NA
Microcentrifuge	Eppendorf	5415 D
Microscope	Nikon	E600	Nikon Eclipse E600
Microscope Image Analysis Software	Universal Imaging Corporation	6.3r7	MetaMorph Software Series 6.3r7
Mouse anti-GFP antibody	Roche	11814460001
Nourseothricin	Fisher Scientific	50997939
PCR Thermocycler	Applied Biosystems	9700	GeneAmp PCR System
PCR tubes	BioExpress, GeneMate	T-3035-1	0.2ml
Polyethylene Glycol 3350	Any	NA
Potassium Chloride	Any	NA
Rabbit anti-mCherry antibody	BioVision	5993-100
Refrigerator (4°C)	Any	NA
Sodium Acetate	Any	NA
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1500
Table Top Centrifuge	Labnet	Z 400	Hermle Z 400
Taq DNA Polymerase	Any	NA
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)	Any	NA
Vortex Mixer	Scientific Industries	SI-0236	Vortex Genie 2
Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) Media	Any	NA