A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
نحن تصف طريقة واضحة لعزل الصفائح الدموية غسلها من الدم البشري تليها القياسات تراكم الصفائح الدموية التي يسببها ناهض بواسطة قياس العكر. وكمثال على ذلك نطبق هذه الطريقة لدراسة استجابة تجمع الصفائح الدموية البشرية لالكولاجين بعد مرحلة ما قبل الحضانة مع قناة المانع Pannexin1 الزرقاء الرائعة FCF.
قياس العكر هي تقنية المختبرات التي يتم تطبيقها لقياس تجمع الصفائح الدموية مع وقف التنفيذ في أي البلازما (الصفائح الدموية الغنية البلازما، PRP) أو في المخزن (الصفائح الدموية غسلها)، عن طريق استخدام واحد أو مزيج من منبهات. استخدام الصفائح الدموية غسلها فصلها عن البيئة البلازما الخاصة بهم وعدم وجود مضادات التخثر يسمح لدراسة خصائص الصفائح الدموية الجوهرية. بين لوحة كبيرة من منبهات، وحمض الأراكيدونيك (AA)، أدينوسين ثنائي الفوسفات (ADP)، الثرومبين والكولاجين هي الأكثر استخداما. وكميا الاستجابة التجميع عن طريق قياس الكثافة البصرية النسبية (OD) مع مرور الوقت من تعليق الصفائح الدموية مع التحريك المستمر. الصفائح الدموية في تعليق متجانسة تحد من مرور الضوء بعد إضافة ناهض، وتغير شكل الصفائح الدموية يحدث تنتج زيادة مؤقتة صغيرة في OD. وبعد هذه الخطوة التنشيط الأولية، تشكل جلطات الصفيحات تدريجيا، مما يسمح بمرور الضوء من خلال التعليق كشرط الدقةانخفاض الموج من OD. وأعرب عن عملية التجميع في نهاية المطاف كنسبة مئوية، بالمقارنة مع OD البلازما فقيرة الصفائح الدموية أو العازلة. معايرة دقيقة هي بالتالي أساسية في بداية كل تجربة. تم تعيين المعايرة إلى 0٪ عن طريق قياس OD من تعليق غير حفز الصفائح الدموية بينما قياس OD من المتوسط تعليق لا تحتوي على الصفائح الدموية يمثل قيمة 100٪: كقاعدة عامة. هو تصور تراكم الصفائح الدموية عموما منحنى التجميع في الوقت الحقيقي. قياس العكر هي واحدة من التقنيات المخبرية الأكثر استخداما للتحقيق في وظيفة الصفائح الدموية ويعتبر معيار الذهب التاريخية واستخدامها لتطوير وكلاء الصيدلانية جديد يهدف إلى منع تراكم الصفائح الدموية. هنا، نحن تصف بروتوكولات مفصلة ل1) إعداد الإنسان غسلها الصفائح الدموية و2) تحليل قياس العكارة التجميع التي يسببها الكولاجين البشرية غسلها الصفائح الدموية سابقة التجهيز مع صبغة الطعام الزرقاء الرائعة FCF التي كانت مؤخرا الاتساعtified كما المانع من Pannexin1 (Panx1) القنوات.
الصفائح الدموية هي العناصر الحاسمة من الدم والرئيسي الوظائف جنبا إلى جنب مع تخثر العوامل هي لوقف النزيف بعد إصابة الأوعية الدموية. الصفائح الدموية هي صغيرة شظايا (2-3 ميكرون) عديم النواة المشتقة من الخلايا السوية العرطلة من نخاع العظام 1. الصفائح الدموية تدور في حالة غير تنشيط خلالها تظهر كما هياكل على شكل العدسة. على انقطاع البطانة، الصفائح الدموية تتجمع إلى موقع الإصابة الأوعية الدموية إلى سد الثقب، وهي عملية تسمى الإرقاء الأولي. في البداية، الصفائح الدموية تلتصق جزيئات شبه البطانية، مثل الكولاجين وعامل فون ويلبراند، التي يتعرض لها نتيجة الخطوة إصابة التصاق 2. ثم تقوم بتغيير شكل وتفرز الكيميائية خطوة رسل التنشيط. وأخيرا، اتصالهم مع بعضهم البعض من خلال سد مستقبلات خطوة التجميع. ويتبع الإرقاء الأولي من خلال عملية الثانوية التي تنطوي على تفعيل شلال التخثر مع ترسب الليفين، والتي الاستقرارق الجلطة الأولية 2.
أحداث الدماغية الحادة مثل احتشاء عضلة القلب 3 غالبا ما تنجم عن الجلطة الدموية التي تشكل بسبب تعطل المادي (تمزق) لوحة تصلب الشرايين. العقاقير الحالية المضادة للصفائح هي حجر الزاوية في علاج هذا المرض على نطاق واسع ولكن فائدتها السريرية محدودة بسبب خطر متزايد للنزيف. أكثر الأدوية الموصوفة للمرضى القلب والأوعية الدموية، والأسبرين ومكافحة P2Y12 المركبات، تستهدف الثرموبوكسان A2 ومسارات ADP 4 على التوالي، والتي هي الممرات الرئيسية المؤدية إلى نشاط الصفائح الدموية. ومع ذلك، والبحوث المبتكرة نحو أهداف جديدة من شأنها تحقيق التوازن الأمثل آثار جرعات ومخاطر haemorragic لا يزال ضروريا.
من 1960s 5 إلى اليوم، وقد لعبت قياس التكدس قياس العكارة دورا حاسما في مجال البحوث، وتعزيز معرفتنا التفاعل الصفائح الدموية وأناN رصد قوة من الكواشف مكافحة الجلطات لدى البشر. تم تطبيق قياس العكر في البداية إلى PRP المستخرج من عينات الدم. في الواقع، وجمع الدم أجريت في أنابيب تحتوي على سترات تتيح إنتاج سريع وكبير من PRP دون أي تأثير على سلامة الصفائح الدموية وظيفة. ومع ذلك، فإن الاستقرار على المدى القصير (حوالي 3 ساعات) من PRP وما تبقى من الانزيمات بلازمية، مثل الثرومبين، وتركيز الكالسيوم منخفض مصاحب لمحات تجميع يحتمل مصطنع هم من إزعاج كبير لاستخدام PRP. وكانت خطوة هامة إلى الأمام في تطوير طريقة لعزل الصفائح الدموية مع الطرد المركزي الإضافية وغسل الخطوات من 6. باختصار، يتم عزل PRP من الدم الكامل التي تم جمعها على حمض سترات الدكستروز (ACD) ويتم عزل الصفائح الدموية بعد خطوات الطرد المركزي المسلسل قبل أن يتم معلق في وجود مخزن مؤقت-ايزو الاسموزي الفوسفات (عازلة تايرود) التي تحتوي على الجلوكوز، وألبومين المصل البشري وثنائي التكافؤ جبالجمع (الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+). لتجنب التغيرات في الصفائح الدموية التفاعل، يتم الاحتفاظ درجة الحموضة العازلة تايرود بعناية في 7،35-7،4. وعلاوة على ذلك، يتم منع تفعيل غير مرغوب فيه من الصفائح الدموية عن طريق إضافة بروستاسيكلين (PGI 2) قبل بعض الخطوات الطرد المركزي. وأخيرا، إضافة آبيراز يمنع الصفائح الدموية غسلها من أن تصبح مقاومة ضد عمل ATP / ADP. تعليق الصفائح الدموية مما أدى يفتقر إلى عوامل تخثر ويتم زيادة استقرار الصفائح الدموية من قبل ما لا يقل عن اثنين أضعاف بالمقارنة مع الحلول الحزب الثورى. وبالإضافة إلى ذلك، فإن حقيقة أن الصفائح الدموية هي مذكرات الخاملة ولكن سليمة استنساخ القياسات قياس العكارة ويوفر القدرة على دراسة عمل منبهات أو مضادات تجمع الصفائح الدموية بطريقة مثلى.
باستخدام هذه الطريقة، لقد أظهرنا في دراسة حديثة أن تحول دون تشكيل قنوات Panx1 بنهج الجيني (خروج المغلوب الفئران) أو خفض النشاط قناة Panx1 التي كتبها الدوائيةنهج خفض الناجم عن تراكم الصفائح الدموية الكولاجين 7. Panx1 تشكل قنوات ATP الإفراج، والتي أعرب بتواجد مطلق في العديد من أنواع الخلايا بما في ذلك الصفائح الدموية البشرية 7 و 8. في الواقع، أثبتنا من خلال قياس العكر على الإنسان غسل الصفائح الدموية أن حضن مسبق 7 دقيقة مع لجنة من حاصرات أكثر أو أقل محددة الكيميائية (البروبينسيد، المفلوكين و 10 الببتيدات Panx1) قبل إضافة العديد من منبهات، مستعمل على وجه التحديد التي يسببها الكولاجين تراكم الصفائح الدموية في حين ردود الصفيحات إلى AA وADP لم تتأثر. أثبتنا أن الإفراج ATP من خلال قنوات Panx1 يتدخل على وجه التحديد في مسار GPVI الإشارات التي تؤدي إلى تجميع الناجم عن الكولاجين. ومن المثير للاهتمام، متعددة مركبات وافقت ادارة الاغذية والعقاقير مع تطبيقات في أمراض أخرى (البروبينسيد، المفلوكين) تؤثر على نشاط قنوات Panx1 في الصفائح الدموية. من جهة، هذا تفتح آفاقا علاجية جديدة لتحديدively تعديل تفاعلية الصفيحات. من ناحية أخرى، ينبغي للمرء أن ينظر الآثار الثانوية المحتملة لهذه المركبات. وفي هذا السياق، الطعام صبغ آمن الزرقاء الرائعة FCF يستخدم في الحلوى متعددة ومشروبات الطاقة وصفت بأنها مثبطات انتقائية من Panx1 9. نحن هنا وصف بروتوكول لعزل الصفائح الدموية البشرية غسلها والقياسات قياس العكارة من تراكم الصفائح الدموية تكييفها للتحقيق في تأثير الرائعة الصبغة الزرقاء FCF كمضاد للتراكم الصفائح الدموية.
تم تجنيد خمسة متطوعين أصحاء لا علاقة لأخذ عينات الدم للصفائح العزل وتجميع الاختبارات. تم الحصول على الموافقة المسبقة الخطية وتمت الموافقة على البروتوكول من قبل لجنة الأخلاق المركزية للمستشفيات جامعة جنيف. جميع المتطوعين شهادة لتكون صحية ولم تتخذ أي أدوية التدخل الصفائح الدموية خلال 10 أيام على الأقل تسبق التجارب.
1. إعداد العازلة لجمع الدم الإنسان وغسلها عزل صفائح الدم
مجموعة 2. الدم
3. إعداد الإنسان غسلها الصفائح الدموية
4. قياس التكدس
برنامج مقياس التكدس تنتج تلقائيا منحنيات تجميع ويعطي القيم لتجميع القصوى في النسبة المئوية. يمكن نسخ القيم إلى برامج تحليل البيانات من أجل إجراء تحليل إحصائي وتصور القيم تجميع القصوى في شكل رسوم بيانية. اختياريا، كل نقطة على حدة من المنحنيات تجميع ...
هناك اهتمام كبير في إيجاد أدوية جديدة قادرة على تحوير وظيفة الصفائح الدموية من أجل منع تجلط الدم دون زيادة خطر النزيف. لهذا الغرض، في المختبر الاختبارات المعملية التي يمكن أن يعتمد عليه وبتكاثر مراقبة ردود تجميع الصفائح الدموية في الإنسان ضرورية للغاية. قياس ال...
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية (310030_162579 / 1 إلى بريندا ريناتا كواك و320030_144150 إلى بيير فونتانا)، وكذلك من خلال منحة من مؤسسة القلب السويسري.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
citric acid monohydrate (C6H8O7*H2O) | Roth | 5949-29-1 | danger of eye damage/irritation |
trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7*2H2O) | Sigma-Aldrich | S1804 | - |
D(+)-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | - |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | - |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | - |
Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | - |
Sodium dihydrogenophosphate monohydrate (NaH2PO4*H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | - |
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | - |
Calcium chloride hexahydrate (CaCl2*6H2O) | Sigma-Aldrich | 442909 | danger of eye damage/irritation |
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (Hepes) | ThermoFisher Scientific | 15630 | - |
human serum albumin | CSL Behring | 00257/374 | - |
hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Corrosive and irritative for the respiratory system. Can cause severe skin and eye damages. |
Eppendorf 5810 R | Fisher Scientific | - | - |
heparin | Drosspharm AG/SA | 20810 | |
prostacyclin I2 (PGI2) | Cayman | 18220 | - |
apyrase from potatoes | Sigma-Aldrich | A6535 | - |
fibrinogen (Haemocomplettan) | CSL Behring | HS 73466011 | - |
thrombo-aggragometer SD-Medical | SD-Innovation | TA8V | - |
Brilliant blue FCF (Erioglaucine disodium salt) | Sigma-Aldrich | 80717 | Harmful to aquatic life with long lasting effects (Avoid release to the environnement) |
collagen | Horm, Nycomed | - | |
arachidonic acid | Bio/Data corporation | C/N 101297 | - |
cell counter Sysmex KX-21N | Sysmex Digitana | - | - |
HEPES | Gibco | 15630-056 | - |
glass cuvettes | SD-Innovation | THCV1000 | - |
magnetic stirrers | SD-Innovation | THA100 | - |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved