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요약

우리는 탁도 의해 작용제 - 유도 된 혈소판 응집을 측정 하였다 인간 혈액으로부터 세척 혈소판 분리하는 간단한 방법을 설명한다. 예를 들어 우리는 Pannexin1 채널 억제제 브릴리언트 블루 FCF와 미리 인큐베이션 한 후 콜라겐 인간 혈소판 응집 반응을 연구하는데이 방법을 적용한다.

초록

탁도는 하나의 사용 또는 작용제의 조합에 의해 (세척 혈소판) 중 플라즈마 (혈소판 풍부 혈장, PRP) 또는 완충액 혈소판의 응집을 측정하는 데 적용되는 실험 기술이다. 혈장 환경에서 항응고제의 부재하에 분리 세척 혈소판의 사용은 고유 혈소판 성질을 연구 할 수 있습니다. 작용제, 아라키돈 산 (AA), 아데노신 디 포스페이트 (ADP)의 대형 패널 중 트롬빈 콜라겐이 가장 자주 사용된다. 응집 반응은 연속적인 교반 하에서 혈소판 현탁액의 시간에 따른 상대적 광학 밀도 (OD)를 측정함으로써 정량한다. 균질 현탁액 혈소판 작용제 첨가 후 빛의 통과를 제한하는 혈소판 형상 변화가 작은 OD 일시적인 증가 제조 일어난다. 초기 활성화 단계에 이어, 혈소판 응고가 입술로 현탁 통해 빛의 통과를 허용 서서히 형성의 ULT는 OD 감소했다. 응집 공정은 결국 혈소판 - 결핍 혈장 또는 버퍼의 OD와 비교하여 백분율로 표현된다. 엄격한 교정은 각 실험의 시작 부분에 따라서 필수적이다. 일반적으로 : 교정 0 % 더 혈소판을 함유하지 않은 현탁액 매질의 OD를 측정하면 100 %의 값을 나타내고 비 - 자극 된 혈소판 현탁액의 OD를 측정함으로써 설정된다. 혈소판 응집은 일반적으로 실시간 집계 곡선으로 시각화된다. 탁도는 혈소판 기능의 조사를 위해 가장 일반적으로 사용되는 실험 방법 중 하나이며, 과거 금 표준으로 간주 혈소판 응집을 억제하는 목적으로 새로운 약제의 개발에 사용된다. 여기서는 인간 혈소판 제제를 세정하고, 인간의 콜라겐 - 유도 된 응집 2) 혼탁도 분석은 최근 혈소판 아이덴이었다 식품 염료 브릴리언트 블루 FCF 전처리 씻어 1)에 대한 상세한 프로토콜 설명Pannexin1 (Panx1) 채널의 억제제로서 tified.

서문

혈소판은 혈액 응고와의 주요 기능 모임의 중요한 구성 요소입니다 혈관 손상 후 출혈을 멈추게하는 요인-입니다. 혈소판은 골수 1 거핵 세포로부터 유도 된 작은 (2-3 μm의) anuclear 단편이다. 혈소판은 동안 그들은 렌즈 형상의 구조로 나타나는, 비 액티브 상태로 순환. 내피의 중단되면, 혈소판 구멍, 차 지혈이라는 프로세스를 연결하는 혈관 손상의 사이트에 수집합니다. 우선, 혈소판 부상 밀착성 2 단계의 결과로 노출되는 콜라겐 및 폰 빌레 브란트 인자로서 서브 내피 분자에 부착. 그런 다음, 그들은 모양을 변경하고 화학 메신저 - 활성화 단계를 분비한다. 마지막으로, 그들은 수용체 응집 단계를 브리징에 의해 서로 연결합니다. 기본 지혈이 안정화 피브린 침착으로 응고 캐스케이드의 활성화를 수반하는 보조 공정 뒤에초기 혈전 2이야.

심근 경색 3과 같은 급성 허혈성 사건은 종종 때문에 동맥 경화성 플라크의 물리적 중단 (파열)의 형성 혈전의 결과. 현재 항 혈소판 약물이 광범위한 질병의 치료의 초석이지만 임상 적 혜택은 출혈 위험 증가에 의해 제한됩니다. 심혈관 환자 아스피린 및 항 P2Y12 화합물에서 가장 처방 약물은 트롬 복산 A2 및 혈소판 활성화에 이르는 주요 경로이다 각각 ADP 통로 (4), 대상. 그러나, 최적의 항 혈전 효과와 haemorragic 위험의 균형을 것입니다 새로운 목표를 향한 혁신적인 연구는 여전히 필요하다.

오늘 1960 년대 5에서 혼탁 aggregometry는 혈소판 반응성와 나는 우리의 지식을 향상 연구에 중요한 역할을하고있다인간의 항 혈전 시약의 효능의 모니터링을 n 개. 탁도는 초기 혈액 샘플로부터 추출 된 PRP 도포 하였다. 실제로, 혈액 수집 시트르산 혈소판 무결성 및 기능에 영향없이 PRP 빠르고 큰 제조를 허용 함유 튜브에서 수행 하였다. 그러나, PRP의 단기 안정성 (약 3 시간) 및 트롬빈과 같은 잔여 혈장 효소, 잠재적 artefactual 통합 정보와 연관된 낮은 칼슘 농도 PRP를 사용하는데 큰 불편하다. 진일보 추가적인 원심 분리 및 세척 단계 6 혈소판 분리하는 방법을 개발하고있다. 이소 삼투 인산 완충액 (타이로드의 버퍼)를 함유하는 글루코스, 인간 혈청 알부민과 가의 C에 재현 탁되기 전에 즉, PRP는 산 - 시트 레이트 - 덱 스트로스 (ACD)에 수집 된 전혈로부터 분리하고, 혈소판 직렬 원심 분리 단계 후에 분리되어ations (칼슘 및 마그네슘 2+). 혈소판 반응성의 변화를 방지하기 위해, 타이로드의 버퍼의 pH를 조심스럽게 7.35-7.4로 유지된다. 또한, 혈소판의 활성화를 원하지 않는 일부를 원심 분리 단계 전에 (PGI 2) 사이클린을 첨가함으로써 방지된다. 마지막 apyrase 첨가 ATP / ADP의 작용에 대하여 내성 해지는 세척 혈소판을 방지한다. 생성 된 현탁액 혈소판 응집 인자를 결여하고 PRP 솔루션에 비해 혈소판의 안정성은 적어도 두 배만큼 증가된다. 또한, 혈소판은 비활성하지만 그대로 영장을 혼탁도 측정의 재현성하고 있다는 사실은 최적의 방법으로 작용제 또는 혈소판 응집의 길항제의 작용을 연구 할 수있는 기능을 제공합니다.

이 방법을 사용하여, 우리는 최근 연구 결과에 의하면 유전 방식에 의해 Panx1 채널의 형성을 억제 (녹아웃 마우스) 또는 약학 적으로 Panx1 채널 활성을 감소감소 된 콜라겐 - 유도 된 혈소판 응집 7에 접근한다. Panx1은 보편적으로 인간 혈소판 7,8 포함한 많은 세포 유형에서 발현된다 ATP 방출 채널을 형성한다. 인간 억제 다양한 효능 제의 첨가에 앞서 다소간 특정 화학 차단제 (프로 베네 시드, 메플로퀸 10 개 Panx1 펩티드)의 패널을 함께 7 분간 예비 배양은 구체적으로는 콜라겐 - 유도한다는 혈소판 세정에 사실, 우리는 탁도 의해 입증 혈소판 응집 AA와 ADP에 대한 혈소판 응답이 영향을받지 않았다있다. 우리는 Panx1 채널을 통해 ATP 자료는 특히 콜라겐 유도 집계로 이어지는 GPVI의 신호 전달 경로에 방해 있음을 보여 주었다. 흥미롭게도, 다른 질병 (프로 베네 시드, 메플로퀸)에서 응용 프로그램과 여러 FDA 승인 화합물은 혈소판에서 Panx1 채널의 활동에 영향을 미친다. 한편,이 선택하는 새로운 치료 관점 열립니다ively 혈소판 반응성을 수정합니다. 반면에, 하나는 이러한 화합물의 잠재적 보조 효과를 고려해야한다. 이러한 맥락에서, 안전한 식품 염료 브릴리언트 블루 FCF는 Panx1 9의 선택적 억제제로서 설명되었지만 여러 사탕 에너지 음료에 사용되는. 우리는 여기에 혈소판 응집 길항제로서 브릴리언트 블루 FCF 염료의 효과를 조사하도록 세정 인간 혈소판 및 혈소판 응집의 혼탁도 측정의 절연을위한 프로토콜을 기술한다.

프로토콜

다섯 명 관련이없는 건강한 지원자는 혈소판 분리 및 통합 테스트를위한 혈액 채취에 대한 보충되었다. 서면 동의를 얻었다과 프로토콜은 제네바 대학 병원의 중앙 윤리위원회에 의해 승인되었다. 인증 된 모든 자원 봉사자들은 건강하고 실험에 앞서 적어도 10 일 동안 모든 혈소판 방해하는 약물을 촬영하지 않은 수 있습니다.

인간의 혈액 채취 1. 버퍼 준비 및 세척 혈소판 분리

  1. (C 6 H 8 O 7 • H 2 O, 66.6 mM)을 2.5 g 트리 나트륨 시트 레이트 디 하이드레이트 (NA 3 C 6 H 5 1.4 g 시트르산 일 수화물을 용해시켜 산 - 시트 레이트 - 덱 스트로스 (ACD)의 100 mL의 수용액을 제조 O 7 • 2 H 2 O, 85 mM)을 무수 D (+) 2 g을 - 글루코스. 용액의 pH는 약 4.5이다.
  2. 다음과 같이 타이로드의 버퍼 재고 솔루션을 준비
    1. 각각의 최종 농도는 2.73 M, 238 53.6 mm로되어 10 g의 NaHCO3 및 0.58 g의 NaH 2 PO 4 *의 H 증류 H 2 O. 500ml에 2 O 80g 염화나트륨 2 g의 KCl을 용해시켜 스톡 용액 (1)을 준비 밀리미터와 8.4 밀리미터. 4 ° C에서 솔루션을 유지합니다.
    2. O. 4 ℃에서 용액을 유지 H 2 증류수 500 ㎖에 10.15 g의의 MgCl 2 * 6 H 2 O (100 mm)를 용해시켜 스톡 용액 (2)을 준비한다.
    3. 10.95 g O. 4 ℃에서 용액을 유지 2 O 500 ㎖ 증류수 H 2 (100 mM)을 CaCl2를 H * 6 용해시켜 스톡 용액 (3)을 준비한다.
  3. 136.5 mM의 염화나트륨, 2.68 mM의 KCl을, 최종 농도에 대응이 증류 H 2 O로 50 ㎖의 최종 부피 원액 1 2.5 mL로 희석하여 타이로드의 버퍼를 준비 11.9 mM의 NaHCO3을 0.42 밀리미터의 NaH 2 PO 4 * H 2 O가 7.35로 pH를 조정하고 0.22 μm의 F를 여과하여 멸균ilters.
  4. 5 ㎖의 스톡 용액 (1) 희석하여 타이로드의 알부민 0.35 % 완충액 (TA 버퍼 7)을 준비, 원액 (2)의 1 ㎖, 원액 (3) 0.5 mL의 1M HEPES, 200g / L, 인간 혈청 알부민 1.8 mL를 2 mL의 무수 D (+) 0.1 g - 100 ㎖의 최종 부피 당 증류수 H 2 O.
    1. 1N HCl로 pH를 7.35로 조정 한 증류수를 H 2 O (총 용적의 10 %)을 첨가하여 295 mOsm / L의 삼투압을 설정. 이 용액의 최종 농도는 124 mM의 염화나트륨, 2.44 mM의 KCl을, 10.82 밀리미터의 NaHCO3, 0.38 밀리미터의 NaH 2 PO 4 *의 H 2 O 0.91 밀리미터의 MgCl 2 * 6 H 2 O, 1.82 mM의 CaCl2를 * 6 H 2 O . 전체 실험 기간 동안 37 ℃에서 TA 버퍼를 유지.

2. 혈액 컬렉션

  1. 콘 50 개 ㎖ 튜브로, 19 G 바늘없이 또는 낮은 지혈대를 사용 전주 정맥으로부터 정맥혈의 45-50 mL로 모아서(피 6 볼륨 1 볼륨 ACD) 이닝 ACD 항응고제. 트롬빈 및 조직 인자의 존재를 피하기 위해 혈액의 제 1-2 용액을 버린다.
    1. 수집 한 후, 부드럽게 튜브를 반전하여 ACD와 피를 섞는다. 37 ° C에서 10 분 동안 샘플을 인큐베이션.

3. 인간 제조 혈소판 씻어

  1. 37 ° C에 원심 분리기를 사전 가열한다. 모든 원심 분리 단계는 아래에이 온도에서 수행된다.
  2. 13 분 PRP를 얻기 위해 250 XG에 15ml의 튜브 (튜브 당 5 ㎖) 및 원심 분리로 수집 된 혈액을 배송.
    주의 : 샘플 3 층 생산이 원심 분리 단계 결과 : 1) 상층, 혈장, 혈소판으로 구성하고, 백혈구의 작은 부분. 2) 중간층 백혈구 풍부한 부. 3) 실질적으로 적혈구 구성된다 하부층.
  3. 상단 라 피펫 팅하여 PRP를 수집YER 신중 최대한 빨강 및 백혈구 오염을 방지하고, 37 ° C에서 10 분 동안 배양 새로운 15ml를 튜브에.
  4. (5 ㎖에 대한 PRP) 12 분 동안 2,200 XG의 PRP를 원심 분리기.
    참고 :이 원심 분리 단계가 낮은 브레이크 또는 브레이크없이 수행해야합니다.
  5. 상청액 (혈소판 - 결핍 혈장)을 분리하고, 신중 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 헤파린 2 μL / mL를 함유 TA 완충액 10 ㎖ (5,000 U / ㎖) 및 25 μM의 PGI 2 2.5 μL / mL로 펠렛을 재현 탁. 37 ° C에서 10 분 동안 인큐베이션.
  6. (낮은 브레이크 또는 브레이크 없음) 1,900 XG에서 8 분, 25 μM PGI 2 원심 2.5 μL / mL를 넣고.
  7. 상등액을 제거하고 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 25 μM의 PGI 2 2.5 μL / ㎖을 함유하는 5 ㎖ TA 완충액 펠렛을 재현 탁. 37 ° C에서 10 분 동안 인큐베이션.
  8. 인큐베이션 기간에서 혈소판 현탁액을 150 μL 피펫및 1.5 ㎖의 튜브에 셀이 자동화 카운터 (즉, 직류 저항의 변화를 측정하여 적혈구의 크기를 검출한다)을 사용하여, 혈소판 카운트.
  9. 10 분 인큐베이션 후, 혈소판 현탁액에 25 μM PGI 2 2.5 μL / mL를 첨가하고 바로 8 분 동안 1,900 XG 원심 분리기.
  10. 상등액을 제거하고 TA 버퍼의 적절한 부피의 25 혈소판 / μL의 농도로 펠렛을 재현 탁 U 0.01 apyrase 32 μL / mL를 함유 (셀 수가 μL 500,000, 10 ㎖ TA 버퍼에 재현 탁 인 즉 경우) / ㎖ (최종 농도 0.32 U / ㎖).
    참고 : apyrase의 높은 농도는 작용제의 부재에서 ATP (10), (11)의 자연 분비에 의해 유발 P2X1 수용체의 탈감작을 방지하기 위해 사용된다. 콜라겐 유도 응답이 빠르게 분비에 의해 유발되기 때문에이 중요하다 / ATP에 의해 P2X1의 분비 활성화 FR 발표톰은 혈소판을 활성화. 혈소판 신호 전달 경로가 매우 P2X1 기능의 보존을 필요로하지 않는 경우, 0.02 U / ML의 apyrase를 사용합니다. (Mahaut 스미스 등. (10)에 검토) 몇몇 연구 0.02 U / ㎖의 apyrase 무시할 P2X1 응답으로 ADP P2Y1 수용체의 탈감작을 방지하는 것이 보였다.
  11. aggregometric 측정을 수행하기 전에 37 ℃에서 적어도 30 분 동안 세포 현탁액을 인큐베이션. 제조는 5~8 시간 동안 안정하다.

4. Aggregometry

  1. 타이로드의 버퍼 피브리노겐 (56 ㎎ / ㎖)을 제조 하였다.
  2. 유리 큐벳에 혈소판 현탁액의 피펫 260 μL (도 1A, 왼쪽 큐벳) - 배양 웰 본을 37 ° C에서 3 분간 10 피브리노겐 μL (56 ㎎ / ㎖) 및 자기 교반 막대를 포함하는 후 2의 현탁 배양 aggregometer (도 1b 및도 1c)이다.
  3. Panx1와 사전 부화브릴리언트 블루 FCF 방지제를 37 ℃에서 7 분 동안 2.8 MM 또는 28 mM의 스톡 용액 (100 μM 최종 농도 1 mM의 각각)의 10 μL를 추가하여.
  4. 10 μL 피브리노겐 (56 ㎎ / ㎖), 혈소판없이 10 μL 브릴리언트 블루 FCF (2.8 MM 또는 28 mM)을하고 TA 완충액을 함유하는 큐벳의 OD를 측정함으로써 가정적 100 % 집계 값 aggregometer 보정.
    1. 응집 잘 교반하에 자동으로 큐벳 놓고 (집약도 1을 사용하는 경우, 즉 프레스 F1)을 aggregometer에 연결된 컴퓨터의 키보드에 해당하는 버튼을 누른다.
      참고 : 아래에 설명이 실험은 브릴리언트 블루 FCF가 포함되어 있습니다. 교정에 사용되는 화합물은 실험 조건을 조정해야한다.
  5. 자동 stirrin 하에서 실험에 사용되는 동일한 혈소판 샘플을 이용하여 0 % 가정적 집계 값 aggregometer 보정지.
    1. 잘 집계에서 큐벳을 놓고 aggregometer에 연결된 컴퓨터의 키보드에 해당하는 버튼을 누릅니다. 진행하기 전에 약 20 ~ 30 초 동안 기다립니다. 이 지연은 더 집계가 작용제를 추가하기 전에 일이 없다는 것을 보장하는 역할을한다.
      주 : 혈소판 수의 차이가 OD 측정에 영향을 미칠 수있는 바와 같이, 0 % 교정 단계는 각각의 측정을 반복 할 필요가있다.
  6. 큐벳로 (75 μM 최종) 아라키돈 산을 목적하는 효능의 20 μL, 예컨대 15 ㎍ / ㎖의 콜라겐 (1 ㎍ / ㎖의 최종) 또는 1.125 mm로 추가한다. 즉시 aggregometer에 연결된 컴퓨터의 키보드에 해당하는 버튼을 누르면 자동 연속 교반 하에서 기록을 시작한다.
    참고 : 작용제의 추가는 혈소판 활성화를 유도한다. 혈소판 집계 명확 실험 (그림 1A의 말에 유리 큐벳에 구별 할 수있다 맞을t 큐벳).
  7. 기록은 6 분 후에 자동적으로 정지한다. 이 시점에서, 컴퓨터의 저장 아이콘을 클릭하여 데이터를 저장합니다.
    주 : 응집 율 계산은 백분율로 응집 처리의 최종 결과를 표현하는 컴퓨터에 의해 수행된다.
  8. 데이터를 분석 할 수 있습니다.
    1. 세척 혈소판 현탁액 및 혈소판 응집의 혼탁도 측정의 준비를위한 프로토콜에 관한 추가의 광범위한 내용 필드 (12, 13)의 다른 전문가에 의해 작성된 논문 참조.

결과

aggregometer 소프트웨어가 자동으로 집계 곡선을 생산하고 비율에서 최대 집계에 대한 값을 제공합니다. 값은 통계 분석을 수행 한 바 차트 형태로 응집 최대 값을 시각화하기 위해 데이터 분석 소프트웨어로 복사 할 수있다. 임의로, 응집 곡선의 각 점은 곡선을 시각화하기 위해 스프레드 시트 소프트웨어에 다음 통계 소프트웨어 (그래프 패드 등)에 차례로 반출 할 ?...

토론

출혈의 위험을 향상없이 ​​혈전을 방지하기 위해 혈소판 기능을 조절할 수있는 새로운 약물을 찾는 데 관심이있다. 이를 위해, 신뢰성 및 재현성 인간의 혈소판의 응집 반응을 모니터링 할 수 있습니다 체외 실험실 테스트는 절대적으로 필요하다. 탁도 aggregometry 수행 할 수있는 쉬운 기술이다. 그러나 일부주의 사항을 명심해야합니다. 응집 공정은 교반에 크게 의존 그 측정이 연속 교반...

공개

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 말

이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)에서 보조금 (피에르 폰타나에 310030_162579 / 브렌다 레 곽에 1 320030_144150)뿐만 아니라하여 스위스 심장 재단에서 부여에 의해 지원되었다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
citric acid monohydrate (C6H8O7*H2O)Roth5949-29-1danger of eye damage/irritation
trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7*2H2O)Sigma-AldrichS1804-
D(+)-glucoseSigma-AldrichG8270-
Sodium chloride (NaCl)Sigma-AldrichS9888-
Potassium chloride (KCl)Sigma-AldrichP9541-
Sodium bicarbonate (NaHCO3)Sigma-AldrichS6014-
Sodium dihydrogenophosphate monohydrate (NaH2PO4*H2O)Sigma-AldrichS9638-
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2*6H2O)Sigma-AldrichM9272-
Calcium chloride hexahydrate (CaCl2*6H2O)Sigma-Aldrich442909danger of eye damage/irritation
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (Hepes)ThermoFisher Scientific 15630-
human serum albuminCSL Behring00257/374-
hydrochloric acidSigma-Aldrich320331Corrosive and irritative for the respiratory system. Can cause severe skin and eye damages.
Eppendorf 5810 RFisher Scientific--
heparinDrosspharm AG/SA20810
prostacyclin I2 (PGI2)Cayman18220-
apyrase from potatoesSigma-AldrichA6535-
fibrinogen (Haemocomplettan)CSL BehringHS 73466011-
thrombo-aggragometer SD-MedicalSD-InnovationTA8V-
Brilliant blue FCF (Erioglaucine disodium salt)Sigma-Aldrich80717Harmful to aquatic life with long lasting effects (Avoid release to the environnement)
collagenHorm, Nycomed-
arachidonic acidBio/Data corporationC/N 101297-
cell counter Sysmex KX-21NSysmex Digitana --
HEPESGibco15630-056-
glass cuvettesSD-InnovationTHCV1000-
magnetic stirrersSD-InnovationTHA100-

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