Turbidimetrie Menschen Gewaschene Thrombozyten: Die Wirkung des Pannexin1-Inhibitor Brilliant Blue FCF auf Collagen-induzierte Aggregation

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine einfache Methode zur Isolierung von gewaschenen Thrombozyten aus menschlichem Blut, gefolgt von Agonisten induzierte Thrombozytenaggregation Messungen durch Turbidimetrie. Als Beispiel verwenden wir diese Methode zur Untersuchung der Aggregationsreaktion von menschlichen Blutplättchen an Kollagen nach einer Vorinkubation mit dem Pannexin1 Kanalinhibitor Brilliant Blue FCF.

Zusammenfassung

Turbidimetrie ist eine Labortechnik, die angewandt wird, um die Aggregation von Thrombozyten in entweder Plasma (platelet-rich plasma, PRP) oder in Puffern (gewaschenen Thrombozyten), durch die Verwendung von einer oder einer Kombination von Agonisten ausgesetzt zu messen. Die Verwendung von gewaschenen Plättchen aus ihrer Plasmaumgebung getrennt und in Abwesenheit von Antikoagulantien ermöglicht intrinsische Thrombozyten Eigenschaften zu studieren. Unter den großen Panel von Agonisten, Arachidonsäure (AA), Adenosin-di-phosphat (ADP), Thrombin und Kollagen sind die am häufigsten verwendet. Die Aggregationsreaktion wird durch Messung der relative optische Dichte (OD) über die Zeit der Thrombozytensuspension unter ständigem Rühren quantifiziert. Platelets in homogener Suspension begrenzt den Durchtritt von Licht nach der Zugabe eines Agonisten tritt Plättchenformänderung eine geringe vorübergehende Zunahme des OD erzeugen. Nach diesem anfänglichen Aktivierungsschritt, bildet allmählich Thrombozytenklumpen, die den Durchgang von Licht durch die Suspension als result verminderter OD. Der Aggregationsprozess wird schließlich als ein Prozentsatz ausgedrückt, verglichen mit dem OD-Wert von plättchenarmen Plasma oder Puffer. Rigorose Kalibrierung ist zu Beginn jeden Versuch somit unerlässlich. Als allgemeine Regel gilt: Kalibrierung auf 0% wird durch Messung der OD einer nicht-stimulierten Plättchensuspension eingestellt, während der OD des Suspensionsmediums Messung keine Blutplättchen enthalten, einen Wert von 100% entspricht. Die Thrombozytenaggregation wird als Echtzeit-Aggregationskurve allgemein sichtbar gemacht. Turbidimetrie ist eines der am häufigsten verwendeten Labortechniken zur Untersuchung der Thrombozytenfunktion und wird als der historische Goldstandard und für die Entwicklung neuer pharmazeutischer Wirkstoffe bei der Hemmung der Thrombozytenaggregation Ziel verwendet. Hier beschreiben wir ausführliche Protokolle für 1) Herstellung von humanen Thrombozyten gewaschen und 2) turbidimetrische Analyse von Kollagen-induzierter Aggregation von menschlichen gewaschenen Blutplättchen mit dem Lebensmittelfarbstoff Brilliant Blue FCF vorbehandelt, das vor kurzem war IdenFertigt als Inhibitor der Pannexin1 (Panx1) -Kanäle.

Einleitung

Thrombozyten sind entscheidende Bestandteile des Blutes und ihre Hauptfunktion-zusammen mit Gerinnungsfaktoren-ist Blutungen nach der Blutgefäßverletzung zu stoppen. Thrombozyten sind klein (2-3 um) , kernlose Fragmente von Megakaryozyten des Knochenmarks abgeleitet ^1. Platelets zirkuliert im nicht aktivierten Zustand, in dem sie erscheinen, als linsenförmige Strukturen. Bei Unterbrechung des Endothels, sammeln Blutplättchen an der Stelle der Blutgefäßverletzung um das Loch zu stecken, einen Prozess, die primäre Hämostase genannt. Anfänglich legen Plättchen zu subendothelialen Moleküle wie Kollagen und von - Willebrand - Faktor, dass ² als Ergebnis der verletzungs Adhäsionsschritt ausgesetzt sind. Dann sie ihre Form verändern und chemischen Boten-Aktivierungsschritt absondern. Schließlich verbinden sie miteinander durch Rezeptoren-Aggregationsschritt überbrücken. Primäre Hämostase wird durch einen sekundären Prozess, der die Aktivierung der Gerinnungskaskade mit Fibrinablagerung, gefolgt, die Stabilisierungs die anfängliche Thrombus ^2.

Akute ischämischen Ereignisse wie Herzinfarkt ³ führen oft von Thromben , die wegen körperlicher Störung (Bruch) ein atherosklerotischen Plaques bilden. Aktuelle Anti-Thrombozyten-Medikamente sind der Grundstein für die Behandlung dieser weit verbreiteten Krankheit, aber ihr klinischer Nutzen für Blutungen durch ein erhöhtes Risiko begrenzt. Die am meisten verschriebenen Arzneimittel in kardiovaskulären Patienten, Aspirin und anti-P2Y12 Verbindungen, zielen auf den Thromboxan - A2 und die ADP Bahnen ⁴ verbunden, die die Hauptwege , die zu Plättchenaktivierung sind. Allerdings innovative Forschung auf neue Ziele, die optimal antithrombotische Wirkung und hämorrhagisches Risiko ausgleichen würden, ist nach wie vor notwendig.

Von den 1960er Jahren ⁵ bis heute hat turbidimetrischen Aggregometrie eine entscheidende Rolle in der Forschung gespielt, unser Wissen über Plättchenreaktivität verbessern und in die Überwachung der Wirksamkeit von anti-thrombotischen Reagenzien beim Menschen. Turbidimetrie wurde zunächst extrahiert aus dem Blut zu PRP angewendet Proben. Tatsächlich Blutentnahme in Röhrchen durchgeführt, die eine schnelle und Citrat große Produktion von PRP erlaubt irgendeine Wirkung auf die Thrombozytenfunktion und Integrität ohne. Allerdings ist die Kurzzeitstabilität (ca. 3 h) von PRP und die verbleibenden plasmatische Enzyme, wie Thrombin, und die niedrige Calciumkonzentration im Zusammenhang mit potentiell artefactual Aggregationsprofilen sind von großem Nachteile für die Verwendung von PRP. Ein wichtiger Schritt ist die Entwicklung eines Verfahrens zur Thrombozytentrennung mit weiteren Zentrifugieren und Waschen wurden die Schritte ^6. Kurz gesagt, ist PRP von Vollblut auf der Säure-Citrat-Dextrose (ACD) gesammelt wird, isoliert und Plättchen werden nach serieller Zentrifugationsschritte isoliert, bevor sie in ein iso-osmotischen Phosphatpuffern (Tyrode-Puffer), enthaltend Glucose, menschliches Serumalbumin und zweiwertigen C resuspendiertationen (Ca ²⁺ und Mg ^2+). Um Änderungen in Plättchenreaktivität zu vermeiden, wird der pH-Wert von Tyrode-Puffer sorgfältig bei 7,35-7,4 gehalten. Darüber hinaus unerwünschte Aktivierung von Plättchen wird durch Zugabe von Prostacyclin (PGI ₂₎ vor einiger Zentrifugationsschritte vermieden. Schließlich Zusatz von Apyrase verhindert gewaschenen Plättchen aus resistent gegen die Wirkung von ATP / ADP. Die resultierende Plättchensuspension fehlt Koagulationsmittel Faktoren und die Stabilität der Plättchen durch mindestens zweifach erhöht ist im Vergleich zu dem PRP-Lösungen. Darüber hinaus ist die Tatsache, dass Blutplättchen inaktiv aber intakt gewährleisten die Reproduzierbarkeit der turbidimetrischen Messungen sind, und bietet die Möglichkeit, die Wirkung von Agonisten oder Antagonisten von Blutplättchen-Aggregation in optimaler Weise zu studieren.

Unter Verwendung dieses Verfahrens haben wir in einer neuen Studie ergeben, dass durch einen genetischen Ansatz, um die Bildung von Kanälen Panx1 Hemmen (knock-out-Mäuse) oder Erniedrigen Panx1 Kanalaktivität durch pharmakologischeAnsätze reduziert Kollagen-induzierte Plättchenaggregation ^7. Panx1 bildet ATP-Freisetzung Kanäle, die in vielen Zelltypen , einschließlich humanen Thrombozyten ubiquitär exprimiert werden ^{7, 8.} In der Tat haben wir gezeigt , durch Turbidimetrie auf menschliche Blutplättchen , dass eine 7 min Vorinkubation mit einer Gruppe von mehr oder weniger spezifischen chemischen Blocker (Probenecid, Mefloquin und ¹⁰ Panx1 Peptide) vor der Zugabe verschiedenen Agonisten hemmte spezifisch gewaschenen kollageninduzierte Thrombozytenaggregation während Thrombozyten Reaktionen auf AA und ADP waren nicht betroffen. Wir zeigten, dass die ATP-Freisetzung durch Panx1 Kanälen interferiert speziell in der GPVI-Signalweg zu Kollagen-induzierte Aggregation führt. Interessanterweise beeinflussen mehrere FDA-zugelassene Verbindungen mit Anwendungen bei anderen Krankheiten (Probenecid, Mefloquin) die Aktivität von Panx1 Kanälen in Blutplättchen. Einerseits eröffnet diese neue therapeutische Perspektiven wählenively Plättchenreaktivität ändern. Auf der anderen Seite sollte man mögliche Nebenwirkungen dieser Verbindungen in Betracht ziehen. In diesem Zusammenhang verwendet die sichere Lebensmittel - Farbstoff Brilliant Blue FCF in mehreren Bonbons und Energy - Drinks ist als selektiver Inhibitor von Panx1 ⁹ beschrieben. Wir beschreiben hier ein Protokoll für die Isolierung von humanen gewaschenen Plättchen und turbidimetrische Messungen der Plättchenaggregation geeignet ist, die Wirkung des Farbstoffs Brillantblau FCF als Antagonist der Plättchenaggregation zu untersuchen.

Protokoll

Fünf unabhängige gesunde Probanden wurden zur Blutentnahme für die Thrombozytenaggregation und Isolierung Tests rekrutiert. Eine schriftliche Einverständniserklärung wurde erhalten und das Protokoll wurde von der Zentralen Ethikkommission der Universität Genf Krankenhäuser genehmigt. Alle Freiwilligen zertifiziert, gesund zu sein und keine plättchen störenden Medikamente während mindestens die 10 Tage genommen haben die Experimente vorhergehenden.

1. Puffer Vorbereitung für Menschen Blutentnahme und Washed Platelet Isolation

1. Vorbereiten einer 100 ml einer wässrigen Lösung von Säure-Citrat-Dextrose (ACD) , um 1,4 g Citronensäure-Monohydrat Auflösen (C ₆ H ₈ O ₇ • H ₂ O, 66,6 mM), 2,5 g Trinatriumcitrat - Dihydrat (Na ₃ C ₆ H ₅ O ₇ • 2 H ₂ O, 85 mM) und 2 g wasserfreie D (+) - Glukose. Der pH-Wert der Lösung beträgt etwa 4,5.
2. Stocklösungen für Tyrode-Puffer wie folgt
   1. Bereiten Stammlösung 1 durch 80 g NaCl aufgelöst, 2 g KCl, 10 g NaHCO ₃ und 0,58 g NaH ₂ PO ₄ · H ₂ O in 500 ml destilliertem H ₂ O. Die jeweiligen Endkonzentrationen 2,73 M, 53,6 mM, 238 mM und 8,4 mM. Halten Sie die Lösung bei 4 ° C.
   2. Bereiten Stammlösung 2 durch Auflösen von 10,15 g MgCl ₂ * 6 H ₂ O (100 mM) in 500 ml destilliertem H ₂ O - Lösung bei 4 ° C aufbewahren.
   3. Bereiten Stammlösung 3 durch Lösen von 10.95 g (100 mM) , CaCl ₂ * 6 H ₂ O in 500 ml destilliertem H ₂ O - Lösung bei 4 ° C aufbewahren.
3. Bereiten Tyrode-Puffer durch Verdünnen von 2,5 ml der Stammlösung 1 in einem Endvolumen von 50 ml mit H ₂ O destilliert Dies entspricht Endkonzentrationen von 136,5 mM NaCl, 2,68 mM KCl, 11,9 mM NaHCO ₃ und 0,42 mM NaH ₂ PO ₄ * H ₂ O. der pH - Wert auf 7,35 und sterilisieren durch Filtern mit 0,22 & mgr; m-filters.
4. Bereiten Tyrode-Albumin 0,35% Puffer (TA - Puffer ⁷⁾ durch Verdünnen von 5 ml der Stammlösung 1, 1 ml der Stammlösung 2, 2 ml der Stammlösung 3, 0,5 ml 1 M HEPES, 1,8 ml von 200 g / L humanem Serumalbumin und 0,1 g wasserfreies D (+) - Glucose in einem Endvolumen von 100 ml destilliertem H ₂ O.
   1. Den pH - Wert auf 7,35 mit 1 N HCl eingestellt und die Osmolarität auf 295 mOsm / l durch Zugabe von destilliertem H ₂ O (10% des Gesamtvolumens). Endkonzentrationen in dieser Lösung: 124 mM NaCl, 2,44 mM KCl, 10,82 mM NaHCO _3, 0,38 mM NaH ₂ PO ₄ · H ₂ O, 0,91 mM MgCl ₂ * 6 H ₂ O, 1,82 mM CaCl ₂ * 6 H ₂ O Halten. TA-Puffer bei 37 ° C während des gesamten Experiments.

2. Blutentnahme

1. Sammeln 45-50 ml venösen Blut aus der Antekubitalvene eine 19 G - Nadel und keine oder nur geringe Tourniquet, in 50 ml - Röhrchen conTaining ACD-Antikoagulans (ACD 1 Volumen für 6 Volumina Blut). Verwerfen Sie den ersten 1-2 ml Blut die Anwesenheit von Thrombin und Gewebefaktor zu vermeiden.
   1. durch vorsichtiges Umdrehen des Röhrchens nach der Entnahme, mit der ACD das Blut vermischt. Inkubieren der Probe für 10 min bei 37 ° C.

3. Herstellung von menschlichen gewaschenen Blutplättchen

1. Vorheizen Zentrifuge auf 37 ° C. Alle Zentrifugationsschritte unten werden bei dieser Temperatur durchgeführt.
2. Versand der gesammelten Blut in 15 ml-Röhrchen (5 ml pro Röhrchen) und Zentrifuge bei 250 × g für 13 min PRP zu erhalten.
   Hinweis: dieser Zentrifugationsschritt führt zur Herstellung von drei Schichten in der Probe: 1) die obere Schicht, zusammengesetzt aus Plasma, Blutplättchen und ein kleiner Anteil der weißen Blutkörperchen. 2) Die Zwischenschicht wird ein Teil reich an weißen Blutkörperchen. 3) Die Bodenschicht, die im wesentlichen aus roten Blutzellen besteht.
3. Sammeln Sie die PRP durch den oberen la Pipettierenyer vorsichtig in ein neues 15 ml-Röhrchen auf maximal Kontamination mit roten und weißen Blutzellen zu verhindern, und für 10 min bei 37 ° C inkubieren.
4. Zentrifugiere die PRP bei 2200 · g für 12 min (bei 5 ml PRP).
   HINWEIS: Dieser Zentrifugationsschritt sollte mit geringer Bremse oder ohne Bremse durchgeführt werden.
5. Entfernen Sie den Überstand (plättchenarmes Plasma) und Resuspension sorgfältig das Pellet mit 10 ml TA - Puffer, der 2 & mgr; l / ml Heparin (5000 U / ml) und 2,5 ul / ml 25 & mgr; M PGI ₂ eine Kunststoff - Pasteurpipette verwenden. bei 37 ° C für 10 min inkubieren.
6. Fügen 2,5 ul / ml 25 & mgr; M PGI ₂ und zentrifugiert für 8 Minuten bei 1.900 xg (mit niedriger Bremse oder ohne Bremse).
7. Entfernen Sie den Überstand und das Pellet mit 5 ml TA - Puffer , enthaltend 2,5 ul / ml 25 & mgr; M PGI ₂ eine Kunststoff - Pasteurpipette verwenden. bei 37 ° C für 10 min inkubieren.
8. Während der Inkubationsperiode pipettieren 150 ul der Thrombozytensuspension inin ein 1,5 ml-Röhrchen und zählen Blutplättchen, einen automatisierten Zellzähler (das erkennt die Größe der Blutzellen, durch Messen der Änderungen in der Gleichstrom-Widerstand) verwendet wird.
9. Nach der 10 min Inkubation, fügen 2,5 ul / ml 25 & mgr; M PGI ₂ zu der Plättchensuspension und sofort bei 1.900 × g für 8 min zentrifugieren.
10. Entfernen Sie den Überstand und das Pellet auf eine Konzentration von 250.000 Thrombozyten / & mgr; l mit einem ausreichenden Volumen von TA - Puffer (dh wenn die Zellzahl liegt bei 500.000 pro uL, Resuspendieren in 10 ml TA - Puffer) , enthaltend 32 ul / ml Apyrase bei 0,01 U / ml (Endkonzentration 0,32 U / ml).
    HINWEIS: Ein hohe Konzentration von Apyrase verwendet , um die Desensibilisierung von P2X1 - Rezeptoren durch spontane Sekretion von ATP ^{10, 11} in Abwesenheit von Agonisten induziert zu vermeiden. Dies ist wichtig, weil die Kollagen-induzierten Reaktionen, die durch schnelle parakrine / autokrine Aktivierung von P2X1 durch ATP induziert werden freigegeben from aktivierte Blutplättchen. Wenn der plättchen Signalweg nicht kritisch Erhaltung der P2X1-Funktion benötigt, verwendet 0,02 U / ml Apyrase. Mehrere Studien (besprochen in Mahaut-Smith et al. ¹⁰⁾ zeigte , dass 0,02 U / ml Apyrase ADP - Rezeptor P2Y1 Desensibilisierung mit vernachlässigbarer P2X1 - Antworten vermeidet.
11. mindestens 30 min bei 37 ° C inkubieren, die Zellsuspension, bevor die Messungen durchgeführt werden aggregometric. Die Zubereitung ist stabil für 5 bis 8 Stunden.

4. Aggregometrie

1. Bereiten Fibrinogen (56 mg / ml) in Tyrode-Puffer.
2. Pipettiere 260 ul der Thrombozytensuspension in Glasküvetten (1A; linke Küvette) , die 10 & mgr; l Fibrinogen (56 mg / ml) und einen magnetischen Rührstab inkubieren dann die Suspension für 2 - 3 min bei 37 ° C in Inkubationsvertiefungen vorliegenden in dem Aggregometer (1B und 1C).
3. Pre-Inkubation mit dem Panx1Inhibitor Brilliant Blue FCF von 10 & mgr; l einer 2,8 mM oder 28 mM Zugabe Stammlösung (Endkonzentration 100 & mgr; M und 1 mM jeweils) für 7 min bei 37 ° C.
4. Kalibrieren den Aggregometers zu einem 100% assumptive Aggregationswert durch die OD einer Küvette gemessen , die 10 & mgr; l Fibrinogen (56 mg / mL), 10 ul Brilliant Blue FCF (2,8 mM oder 28 mM) und TA - Puffer ohne Blutplättchen.
   1. Platzieren Sie die Küvette in einer Aggregations auch unter automatischen Rühren und drücken Sie die entsprechende Taste auf der Tastatur des Computers mit dem Aggregometer verknüpft (dh F1 drücken , wenn die Aggregation und 1 verwendet wird).
      Hinweis: Dieses Experiment unten beschrieben enthält Brilliant Blue FCF. Die Verbindung zur Kalibrierung verwendet wird, hat auf die experimentellen Bedingungen eingestellt werden.
5. Kalibrieren den Aggregometers zu einem assumptive 0% Aggregationswert durch die gleiche Blutplättchenprobe , die unter Verwendung von für das Experiment unter automatischer stirrin verwendet wirdG.
   1. Platzieren Sie die Küvette in der Aggregations gut und drücken Sie die entsprechende Taste auf der Tastatur des Computers mit dem Aggregometer verbunden. Warten Sie etwa 20-30 s, bevor Sie fortfahren. Diese Verzögerung dient dazu, sicherzustellen, dass keine Aggregation geschieht, bevor die Agonisten hinzufügen.
      HINWEIS: Wie jeder Unterschied in der Thrombozytenzahl kann eine Auswirkung auf die gemessene OD haben, die 0% Kalibrierschritt muss für jede einzelne Messung wiederholt werden.
6. Fügen Sie 20 & mgr; l der gewünschten Agonisten, wie 15 ug / ml Kollagen (1 ug / ml final) oder 1,125 mM Arachidonsäure (75 uM final), in die Küvette. Sofort startet die Aufzeichnung unter kontinuierlichem automatischem Rühren durch die entsprechende Taste auf der Tastatur des den Aggregometer verknüpften Computers drücken.
   HINWEIS: Die Zugabe des Agonisten induziert Thrombozytenaktivierung. Platelet Aggregate können deutlich in der Glasküvette am Ende des Experiments (1A unterscheiden; right-Küvette).
7. Die Aufnahme stoppt automatisch nach 6 min. An diesem Punkt speichern Sie die Daten, indem Sie auf das Symbol des Computers speichern klicken.
   HINWEIS: Die Berechnung der Aggregationsrate wird durch den Computer durchgeführt, die die Endergebnisse des Aggregationsprozesses als Prozentsatz zum Ausdruck bringt.
8. Analysieren Sie die Daten.
   1. Weitere umfangreiche Informationen über Protokolle zur Herstellung von gewaschenen Thrombozyten - Suspensionen und Trübungsmessung der Thrombozytenaggregation, beziehen sich auf andere Papiere von Experten auf dem Gebiet ^{12 verfasst, 13.}

Ergebnisse

Aggregometer Software erzeugt automatisch die Aggregationskurven und gibt die Werte für maximale Aggregation in Prozent. Die Werte können auf eine Datenanalyse-Software, um kopiert werden, um statistische Analysen durchzuführen und maximale Aggregation Werte in Form von Balkendiagrammen visualisiert werden. Wahlweise kann jeder einzelne Punkt der Aggregationskurven nacheinander in einer Tabellenkalkulations - Software exportiert werden und dann auf statistische Software (zB G...

Diskussion

Es besteht eine großes Interesse neue Medikamente bei der Suche nach der Lage der Thrombozytenfunktion in der Reihenfolge der Modulation Thrombose ohne Erhöhung die Gefahr von Blutungen zu verhindern. Zu diesem Zweck werden in vitro Laboruntersuchungen , die zuverlässig und reproduzierbar Aggregationsreaktionen in menschlichen Blutplättchen sind absolut notwendig überwachen. Turbidimetrische Aggregometrie ist eine einfache Technik auszuführen. Allerdings müssen einige Vorsichtsmaßnahmen im Auge behalten...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
citric acid monohydrate (C6H8O7*H2O)	Roth	5949-29-1	danger of eye damage/irritation
trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7*2H2O)	Sigma-Aldrich	S1804	-
D(+)-glucose	Sigma-Aldrich	G8270	-
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	-
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	-
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6014	-
Sodium dihydrogenophosphate monohydrate (NaH2PO4*H2O)	Sigma-Aldrich	S9638	-
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2*6H2O)	Sigma-Aldrich	M9272	-
Calcium chloride hexahydrate (CaCl2*6H2O)	Sigma-Aldrich	442909	danger of eye damage/irritation
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (Hepes)	ThermoFisher Scientific	15630	-
human serum albumin	CSL Behring	00257/374	-
hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	320331	Corrosive and irritative for the respiratory system. Can cause severe skin and eye damages.
Eppendorf 5810 R	Fisher Scientific	-	-
heparin	Drosspharm AG/SA	20810
prostacyclin I2 (PGI2)	Cayman	18220	-
apyrase from potatoes	Sigma-Aldrich	A6535	-
fibrinogen (Haemocomplettan)	CSL Behring	HS 73466011	-
thrombo-aggragometer SD-Medical	SD-Innovation	TA8V	-
Brilliant blue FCF (Erioglaucine disodium salt)	Sigma-Aldrich	80717	Harmful to aquatic life with long lasting effects (Avoid release to the environnement)
collagen	Horm, Nycomed		-
arachidonic acid	Bio/Data corporation	C/N 101297	-
cell counter Sysmex KX-21N	Sysmex Digitana	-	-
HEPES	Gibco	15630-056	-
glass cuvettes	SD-Innovation	THCV1000	-
magnetic stirrers	SD-Innovation	THA100	-