Turbidimetria em plaquetas humanas lavadas: O efeito do inibidor Pannexin1-Brilliant Blue FCF na agregação induzida por colagénio

Resumo

Descreve-se um método simples para o isolamento de plaquetas lavadas a partir de sangue humano seguido por meio de medições de agregação plaquetária induzida por agonistas por turbidimetria. Como exemplo, aplicam-se este método para estudar a resposta de agregação de plaquetas humanas a colagénio depois de uma pré-incubação com o inibidor do canal Pannexin1 Brilliant Blue FCF.

Resumo

Turbidimetria é uma técnica de laboratório que é aplicado para medir a agregação de plaquetas em suspensão em qualquer de plasma (plasma rico em plaquetas, PRP) ou em tampão de plaquetas lavadas (), pelo uso de um ou uma combinação de agonistas. A utilização de plaquetas lavadas separadas do seu ambiente de plasma e na ausência de anticoagulantes permite o estudo das propriedades intrínsecas de plaquetas. Entre o grande painel de agonistas, o ácido araquidónico (AA), a adenosina-di fosfato de (ADP), colagénio e trombina são os mais frequentemente utilizados. A resposta de agregação é quantificada através da medição da densidade óptica relativa (DO) ao longo do tempo de suspensão de plaquetas, sob agitação contínua. As plaquetas em suspensão homogénea limitar a passagem de luz após a adição de um agonista, alteração da forma das plaquetas ocorre a produção de um pequeno aumento transitório da OD. Seguindo este passo de activação inicial, a formação de coágulos de plaquetas formar gradualmente, o que permite a passagem de luz através da suspensão como um result de diminuição da OD. O processo de agregação é em última análise, expresso como uma percentagem, em comparação com o diâmetro externo de plasma pobre em plaquetas ou tampão. calibração rigorosa é, portanto, essencial no início de cada experimento. Como uma regra geral: calibração de 0% é definido através da medição da DO de uma suspensão de plaquetas não estimuladas ao medir o OD do meio de suspensão que não contém plaquetas representa um valor de 100%. A agregação plaquetária é geralmente visualizado como uma curva de agregação em tempo real. Turbidimetria é uma das técnicas de laboratório mais comumente utilizados para a investigação da função plaquetária e é considerado como padrão-ouro histórico e utilizado para o desenvolvimento de novos agentes farmacêuticos que visam inibir a agregação plaquetária. Aqui, nós descrevemos protocolos detalhados para 1) preparação de plaquetas humanas lavadas e 2) análise turbidimétrico de agregação induzida por colagénio de plaquetas humanas lavadas pré-tratados com o corante alimentar azul brilhante FCF que foi recentemente idencado como um inibidor dos canais de Pannexin1 (Panx1).

Introdução

As plaquetas são componentes cruciais do sangue e a sua principal função-juntamente com factores de coagulação-se para parar o sangramento após a lesão do vaso sanguíneo. As plaquetas são fragmentos pequenos (2-3 mm) anuclear derivados de megacariócitos de medula óssea ^1. As plaquetas circulam no estado n activado, durante a qual eles aparecem como estruturas em forma de lente. Após a interrupção do endotélio, as plaquetas se reúnem para o local da lesão vaso sanguíneo para tapar o buraco, um processo chamado hemostasia primária. Inicialmente, as plaquetas para anexar moléculas de sub-endotelial, tais como o colagénio e o factor de von Willebrand, que são expostos como um resultado do passo de lesão-adesão ^2. Em seguida, eles mudam de forma e secretar passo mensageiros-activação química. Finalmente, eles se conectam uns com os outros colmatando passo receptores de agregação. hemostase primária é seguida por um processo secundário envolvendo activação da cascata de coagulação com a deposição de fibrina, que estabilizams o trombo inicial ^2.

Eventos isquémicos agudos, tais como enfarte do miocárdio ³ muitas vezes resultar de trombos que formam por causa de ruptura física (ruptura) de uma placa aterosclerótica. medicamentos anti-plaquetários atuais são a pedra angular do tratamento desta doença generalizada, mas seu benefício clínico é limitado por um aumento do risco de sangramento. As drogas mais prescritas em pacientes com doenças cardiovasculares, compostos da aspirina e anti-P2Y12, o alvo do tromboxano A2 e os percursos ADP ^4, respectivamente, que são as principais vias que conduzem à activação de plaquetas. No entanto, pesquisas inovadoras para novos alvos que otimamente equilibrar efeitos antitrombóticos e risco hemorrágico ainda é necessária.

A partir da década de 1960 ⁵ até hoje, agregometria turbidimétrico tem desempenhado um papel crucial na pesquisa, aumentando o nosso conhecimento da reatividade plaquetária e iN, a monitorização da actividade dos reagentes anti-trombóticos em seres humanos. Turbidimetria foi inicialmente aplicada ao PRP extraída a partir de amostras de sangue. Com efeito, a colheita de sangue realizada em tubos contendo citrato permite a produção rápida e grande de PRP sem ter qualquer efeito sobre a integridade e a função das plaquetas. No entanto, a estabilidade a curto prazo (cerca de 3 h) de PRP e os restantes enzimas plasmáticas, tais como a trombina, e a baixa concentração de cálcio associado com perfis de agregação potencialmente artefatuais são de grande inconveniente para a utilização de PRP. Um importante passo em frente tem sido o desenvolvimento de um método para o isolamento de plaquetas com centrifugação e passos de lavagem ⁶ adicional. Em suma, o PRP foi isolado a partir de sangue total recolhido de ácido-citrato-dextrose (ACD) e as plaquetas são isolados depois de passos de centrifugação de série antes de serem ressuspensas num tampão iso-osmótico fosfato (tampão de Tyrode) contendo glucose, albumina do soro humano e divalente cções (Ca ²⁺ e Mg ^2+). Para evitar alterações na reactividade das plaquetas, o pH do tampão de Tyrode é cuidadosamente mantida a 7,35-7,4. Além disso, a activação indesejada de plaquetas é impedida pela adição de prostaciclina (PGI ₂₎ antes de alguns passos de centrifugação. Finalmente, a adição de apirase evita que as plaquetas lavadas de se tornar resistente contra a acção de ATP / ADP. A suspensão de plaquetas resultante não tem factores coagulantes e a estabilidade de plaquetas é aumentada de pelo menos duas vezes, em comparação com soluções de PRP. Além disso, o facto de que as plaquetas são inactivos mas garante intactas a reprodutibilidade das medições turbidimétricas e fornece a capacidade para estudar a acção de agonistas ou antagonistas de agregação de plaquetas de uma forma optimizada.

Usando este método, temos demonstrado num estudo recente de que a inibição da formação de canais Panx1 por uma abordagem genética (knock-out ratinhos) ou diminuir a actividade de canal Panx1 por farmacológicaaproxima-se reduzida a agregação de plaquetas induzida por colagénio ^7. Panx1 forma canais de ATP de libertação, que são ubiquamente expressos em muitos tipos de células incluindo plaquetas humanas ^{7, 8.} De facto, foi demonstrado por turbidimetria em plaquetas humanas lavadas que um 7 min de pré-incubação com um painel de mais-ou-menos específicos bloqueadores químicos (probenecida, mefloquina e ¹⁰ péptidos Panx1) antes da adição de vários agonistas, inibiu especificamente induzida por colagénio agregação plaquetária enquanto as respostas de plaquetas para AA e ADP não foram afetados. Nós demonstramos que o ATP libertação por meio de canais Panx1 interfere especificamente na via de sinalização de GPVI que conduz à agregação induzida por colagénio. Curiosamente, vários compostos aprovados pela FDA, com aplicações em outras doenças (probenecida, mefloquina) afectar a actividade de canais Panx1 em plaquetas. Por um lado, isso abre novas perspectivas terapêuticas para selecionarvamente modificar a reactividade de plaquetas. Por outro lado, deve-se considerar os potenciais efeitos secundários destes compostos. Neste contexto, o corante de alimentos seguros Brilliant Blue FCF usado em vários doces e bebidas energéticas tem sido descrito como um inibidor selectivo da Panx1 ^9. Descrevemos aqui um protocolo para o isolamento de plaquetas humanas lavadas e medições turbidimétricas de agregação de plaquetas adaptado para investigar o efeito do corante azul brilhante FCF como um antagonista da agregação plaquetária.

Protocolo

Cinco voluntários saudáveis ​​não relacionados foram recrutados para a amostragem de sangue para testes de isolamento e de agregação de plaquetas. consentimento informado por escrito foi obtido e o protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Central dos Hospitais da Universidade de Genebra. Todos os voluntários certificados para ser saudável e não ter tomado quaisquer drogas interferir plaquetas durante pelo menos os 10 dias que antecederam os experimentos.

1. Preparação de buffer para coleta de sangue humano e lavou Isolamento de plaquetas

1. Prepara-se uma solução aquosa de 100 mL de ácido-citrato-dextrose (ACD) por dissolução de 1,4 g de mono-hidrato de ácido cítrico (C ₆ H ₈ O ₇ • _H2O, 66,6 mM), 2,5 g de citrato trissódico di-hidratado (Na ₃ C ₆ H ₅ O ₇ • 2 _H2O, 85 mM) e 2 g de D anidro (+) - glucose. O pH da solução é cerca de 4,5.
2. Preparar soluções estoque de tampão de Tyrode como segue
   1. Preparar a soluo de estoque 1 por dissolução de 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 10 g de _NaHCO3 e 0,58 g de NaH ₂ PO ₄ * _H2O em 500 mL de _H2O destilada As respectivas concentrações finais são 2,73 M, 53,6 mM, 238 mM e 8,4 mM. Manter a solução a 4 ° C.
   2. Preparar a solução stock 2 por dissolução de 10,15 g de _MgCl2 * 6 _H2O (100 mM) em 500 mL _{de H2O} destilada Mantenha a solução a 4 ° C.
   3. Preparar solução mãe 3 por dissolução de 10,95 g (100 mM), _CaCl2 * 6 _H2O em 500 mL de _H2O destilada Mantenha a solução a 4 ° C.
3. Preparar tampão de Tyrode por diluição de 2,5 ml de solução de estoque 1 em um volume final de 50 ml com água destilada H ₂ O. Isto corresponde a concentrações finais de NaCl 136,5 mM, KCl 2,68 mM, 11,9 mM de _NaHCO3 e 0,42 mM NaH ₂ PO ₄ * _H2O Ajustar o pH a 7,35 e esterilizar por filtração com 0,22? m-filters.
4. Preparar albumina de tampão de 0,35% de Tyrode (tampão TA ⁷⁾ por diluição de 5 ml de solução stock de 1, 1 mL de solução stock de 2, 2 mL de solução de reserva 3, 0,5 ml de HEPES 1M, 1,8 ml de 200 g / L de albumina de soro humano e 0,1 g de D anidro (+) - glucose num volume final de 100 mL _{de H2O} destilada
   1. Ajustar o pH a 7,35 com HC1 IN e ajustar a osmolaridade a 295 mOsm / l através da adição de _H2O destilada (10% do volume total). As concentrações finais nesta solução são: NaCl 124 mM, KCl 2,44 mM, 10,82 mM de _NaHCO3, 0,38 mM NaH ₂ PO ₄ * _H2O, MgCl 0,91 mM de ₂ * 6 _H2O, CaCl 1,82 ₂ * 6 _H2O . Manter tampão TA a 37 ° C durante todo o experimento.

Coleção 2. Sangue

1. Recolha de 45-50 ml de sangue venoso, a partir da veia antecubital usando uma agulha G 19, e pouca ou nenhuma torniquete, em tubos de 50 ml de ConAtaining ACD anticoagulante (1 volume de ACD para 6 volumes de sangue). Rejeitar os primeiros 1-2 ml de sangue para evitar a presença de trombina e factor tecidular.
   1. Após a recolha, misturar o sangue com o ACD por invertendo suavemente o tubo. Incubar a amostra durante 10 min a 37 ° C.

3. Preparação de plaquetas humanas lavadas

1. Pré-aqueça o centrifugador a 37 ° C. Todos os passos de centrifugação abaixo são realizadas a esta temperatura.
2. Despachar o sangue recolhido em tubos de 15 mL (5 mL por tubo) e centrifugar a 250 xg durante 13 min para se obter o PRP.
   NOTA: Este passo de centrifugação resulta na produção de três camadas da amostra: 1) A camada superior, composta de plasma, plaquetas, e uma pequena fracção de glóbulos brancos. 2) A camada intermédia, uma porção rica em glóbulos brancos. 3) A camada inferior, que é essencialmente composto por células vermelhas do sangue.
3. Recolhe-se o PRP por pipetagem a la superioryer cuidadosamente para um novo tubo de 15 mL para evitar ao máximo a contaminação por glóbulos vermelhos e brancos do sangue, e incubar durante 10 min a 37 ° C.
4. Centrifugar o PRP a 2200 x g durante 12 min (para 5 ml de PRP).
   NOTA: Esta etapa de centrifugação deve ser realizada com baixa freio ou sem freio.
5. Remover o sobrenadante (plasma pobre em plaquetas), e ressuspender cuidadosamente o sedimento com 10 ml de tampão TA contendo 2 ul / ml de heparina (5000 U / mL) e 2,5 mL / mL de 25? M PGI _2, utilizando uma pipeta de Pasteur de plástico. Incubar durante 10 min a 37 ° C.
6. Adicionar 2,5 uL / mL de 25? M _PGI2 e centrifuga-se durante 8 minutos a 1900 xg (com baixo freio ou sem travão).
7. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet com 5 mL de tampão TA contendo 2,5 uL / mL de 25? M _PGI2 usando uma pipeta de Pasteur de plástico. Incubar durante 10 min a 37 ° C.
8. Durante o período de incubação, pipeta 150 uL da suspensão de plaquetas empara um tubo de 1,5 ml e contagem de plaquetas, usando um contador de células automatizado (que detecta o tamanho das células do sangue medindo as mudanças na resistência de corrente contínua).
9. Após a incubação de 10 min, adicionar 2,5 mL / mL de 25? M _PGI2 para a suspensão de plaquetas e centrifugar imediatamente a 1900 x g durante 8 min.
10. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento para uma concentração de 250.000 plaquetas / microlitro com um volume adequado de tampão TA (isto é, se a contagem de células é de 500.000 por ml, ressuspender em 10 ml de tampão TA) contendo 32 pL / mL de apirase em 0,01 L / ml (concentração final de 0,32 U / ml).
    NOTA: alta concentração de apirase é utilizado para evitar a dessensibilização de receptores P2X1 induzidas pela secreção espontânea de ATP ^{10, 11} na ausência de agonistas. Isto é importante porque as respostas induzidas por colagénio são induzidas por parácrina rápido / activação autócrina de P2X1 por ATP libertado from plaquetas activadas. Se a via de sinalização de plaquetas não requer criticamente preservação da função P2X1, usar 0,02 U / mL de apirase. Vários estudos (revisto em Mahaut-Smith et al. ¹⁰⁾ demonstraram que a 0,02 U / mL de apirase evita ADP dessensibilização do receptor de P2Y1 com respostas P2X1 negligenciáveis.
11. Incubar a suspensão de células durante pelo menos 30 min a 37 ° C antes da realização das medições aggregometric. A preparação é estável durante 5 a 8 horas.

4. agregometria

1. Preparar fibrinogénio (56 mg / mL) em tampão de Tyrode.
2. Pipetar 260 L de suspensão de plaquetas em cuvetes de vidro (Figura 1A; cuvete esquerdo) contendo 10 ul de fibrinogénio (56 mg / mL) e uma haste de agitação magnética, depois incubar a suspensão durante 2-3 min a 37 ° C em poços de incubação presentes no agregómetro (Figura 1B e 1C).
3. Pré-incubar com o Panx1inibidor Brilliant Blue FCF pela adição de 10 uL de uma solução 2,8 mM ou estoque 28 mM (concentração final de 100 uM e 1 mM, respectivamente) durante 7 minutos a 37 ° C.
4. Calibrar o agregómetro para um valor assumptive agregação de 100%, medindo a OD de uma cuvete contendo 10 ul de fibrinogénio (56 mg / mL), 10 uL Brilliant Blue FCF (2,8 mM ou 28 mM) e tampão TA sem plaquetas.
   1. Coloque a cuvete num agregado bem sob agitação automática e pressionar o botão correspondente no teclado do computador ligado ao agregómetro (isto é, prima F1 se bem a agregação 1 é utilizado).
      NOTA: Este experimento descrito abaixo inclui Brilliant Blue FCF. O composto usado para calibragem tem de ser ajustado para a condição experimental.
5. Calibrar o agregómetro para um valor assumptive agregação 0% utilizando a mesma amostra de plaquetas que será utilizado para a experiência sob mexendo automáticag.
   1. Coloque a cuvete na agregação bem e pressione o botão correspondente no teclado do computador ligado à agregómetro. Aguarde cerca de 20-30 s antes de prosseguir. Este atraso serve para assegurar que nenhuma agregação acontece antes da adição dos agonistas.
      NOTA: Como qualquer diferença no número de plaquetas pode ter um efeito sobre a DO medida, o passo de calibração 0% precisa de ser repetido para cada medição individual.
6. Adiciona-se 20 uL de agonista desejado, tal como 15 ug de colagénio / ml (1? G / ml final) ou 1,125 mM de ácido araquidónico (75 uM final), na cuvete. começar imediatamente a gravação, sob agitação automático contínuo pressionando o botão correspondente no teclado do computador ligado ao agregómetro.
   NOTA: A adição do agonista induz a activação de plaquetas. Agregados de plaquetas pode ser claramente distinguida na cuvete de vidro no final da expericia (Figura 1A; right cuvete).
7. A gravação é interrompida automaticamente após 6 min. Neste ponto, salvar os dados clicando no ícone salvar do computador.
   NOTA: O cálculo da taxa de agregação é executada pelo computador, que expressa os resultados finais do processo de agregação como uma porcentagem.
8. Analisar os dados.
   1. Para informação adicional sobre extensa protocolos para a preparação das suspensões de plaquetas lavadas e medição turbidimétrica de agregação de plaquetas, referem-se outros papéis de autoria de peritos no campo ^{12, 13.}

Resultados

O software aggregometer produz automaticamente as curvas de agregação e dá os valores de agregação máxima em percentagem. Os valores podem ser copiados para um software de análise de dados, a fim de realizar a análise estatística e visualizar os valores de agregação máxima na forma de gráficos de barras. Opcionalmente, cada ponto individual da curva de agregação pode ser exportado sucessivamente para um software de folha de cálculo e, em seguida, para o software de estat?...

Discussão

Há um grande interesse em encontrar novos medicamentos capazes de modular a função das plaquetas, a fim de prevenir a trombose sem aumentar o risco de hemorragia. Para este efeito, em testes in vitro de laboratório, que pode de forma fiável e reprodutível monitorizar respostas de agregação em plaquetas humanas são absolutamente necessárias. agregometria Turbidimétrico é uma técnica fácil de executar. No entanto, algumas precauções devem ser mantidos em mente. As medições têm de ser e...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
citric acid monohydrate (C6H8O7*H2O)	Roth	5949-29-1	danger of eye damage/irritation
trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7*2H2O)	Sigma-Aldrich	S1804	-
D(+)-glucose	Sigma-Aldrich	G8270	-
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	-
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	-
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6014	-
Sodium dihydrogenophosphate monohydrate (NaH2PO4*H2O)	Sigma-Aldrich	S9638	-
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2*6H2O)	Sigma-Aldrich	M9272	-
Calcium chloride hexahydrate (CaCl2*6H2O)	Sigma-Aldrich	442909	danger of eye damage/irritation
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (Hepes)	ThermoFisher Scientific	15630	-
human serum albumin	CSL Behring	00257/374	-
hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	320331	Corrosive and irritative for the respiratory system. Can cause severe skin and eye damages.
Eppendorf 5810 R	Fisher Scientific	-	-
heparin	Drosspharm AG/SA	20810
prostacyclin I2 (PGI2)	Cayman	18220	-
apyrase from potatoes	Sigma-Aldrich	A6535	-
fibrinogen (Haemocomplettan)	CSL Behring	HS 73466011	-
thrombo-aggragometer SD-Medical	SD-Innovation	TA8V	-
Brilliant blue FCF (Erioglaucine disodium salt)	Sigma-Aldrich	80717	Harmful to aquatic life with long lasting effects (Avoid release to the environnement)
collagen	Horm, Nycomed		-
arachidonic acid	Bio/Data corporation	C/N 101297	-
cell counter Sysmex KX-21N	Sysmex Digitana	-	-
HEPES	Gibco	15630-056	-
glass cuvettes	SD-Innovation	THCV1000	-
magnetic stirrers	SD-Innovation	THA100	-