Turbidimetry על אדם שנשטף טסיות: השפעת מעכבי Pannexin1 FCF הכחול המבריק על צבירה מושרת קולגן

Summary

אנו מתארים שיטה פשוטה עבור בידוד של טסיות נשטף מן הדם האנושי ואחריו מדידות צימות טסיות דם הנגרמת אגוניסט ידי turbidimetry. כדוגמא אנחנו מיישמים שיטה זו לחקר התגובה אגרגציה של טסיות אדם קולגן לאחר דגירה מראש עם מעכב ערוץ Pannexin1 בריליאנט בלו FCF.

Abstract

Turbidimetry היא טכניקת מעבדה מוחלת על מנת למדוד את ההצטברות של טסיות מושעה או פלזמה (פלזמה העשירה בטסיות-, PRP) או במאגר (טסיות נשטפה), על ידי שימוש באחד או שילוב של אגוניסטים. השימוש טסיות נשטף מופרד מסביבתם הפלזמה שלהם בהעדר תרופות נגד קרישת הדם מאפשר לחקר מאפיינים טסיות מהותיים. בין הפנל הגדול של אגוניסטים, חומצה הארכידונית (AA), אדנוזין די-פוספט (ADP), תרומבין קולגן הם נפוץ ביותר בשימוש. תגובת הצבירה מכומת על ידי מדידת הצפיפות האופטית היחסית (OD) לאורך זמן השעיה הטסיות תחת בחישה מתמדת. טסיות השעיה הומוגנית להגביל המעבר של אור לאחר התוספת של אגוניסט, שינוי צורה טסיות מתרחש לייצר גידול חולף קטן OD. בעקבות צעד ההפעלה הראשונית הזו, קרישי טסיות יוצרים בהדרגה, המאפשר מעבר של אור דרך ההשעיה כמו מילult של ירידת OD. תהליך הצבירה בסופו של דבר מבוטא באחוזים, לעומת OD של פלזמה ירודה טסיות או חיץ. כיול מדוקדק כן חיוני בתחילת כל ניסוי. ככלל: כיול ל 0% מוגדרים על ידי מדידת OD של השעית הטסיות הלא מגורה תוך מדידת OD של מדיום ההשעיה המכיל שום טסיות מייצגת שווי של 100%. טסיות צבירה היא דמיינה בדרך כלל עקומת צבירה בזמן אמת. Turbidimetry היא אחת טכניקות המעבדה הנפוצות ביותר לחקירת תפקוד הטסיות ונחשבת כתקן זהב ההסטורי המשמשת לפיתוח סוכני תרופות החדשים שמטרתן עיכוב צימות טסיות דם. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים 1) הכינו אדם שנשטף טסיות 2) ניתוח turbidimetric של צבירת מושרה הקולגן של אדם שנשטף pretreated טסיות עם צבע המזון FCF הכחול המבריק שהיה לאחרונה iDENtified כמעכב של ערוצי Pannexin1 (Panx1).

Introduction

טסיות הן מרכיב חיוני של דם והתפקוד יחד העיקרי שלהם עם קרישת גורמים-הוא כדי לעצור את הדימום לאחר פציעה של כלי דם. טסיות קטנות (2-3 מיקרומטר) שברי anuclear נגזר megakaryocytes של מח עצם ^1. טסיות להסתובב המדינה הלא-מופעל, שבמהלכה הם מופיעים כמו מבנים דמוית-עדשה. לאחר הפסקה של האנדותל, טסיות לאסוף לאתר של פגיעה בכלי הדם כדי לסתום את החור, תהליך הנקרא המוסטאסיס העיקרי. בתחילה, טסיות לצרף מולקולות תת-אנדותל, כגון קולגן גורם פון Willebrand, כי נחשפות כתוצאת הצעד הדבק-פציעת ^2. ואז, הם משנים צורה להפריש צעד שליחי הפעלה כימי. לבסוף, הם מתחברים זה לזה על ידי גישור צעד קולטני-צבירה. המוסטאסיס ראשי ואחריו תהליך משני מעורבי הפעלה של מפל הקרישה עם בתצהיר הפיברין, אשר לייצבזה פקיק ² הראשוני.

אירועים חריפים איסכמי כגון אוטם שריר לב ³ לעתים קרובות נובעים בורידים היוצרות בגלל שיבוש פיזי (קרע) של פלאק טרשת עורק. תרופות אנטי-טסיות הנוכחיות הן אבן הפינה של הטיפול במחלה נפוצה זו אך התועלת הקלינית שלהם מוגבלת על ידי סיכון מוגבר לדימומים. תרופות מרשם ביותר בחולים קרדיו, אספירין ותרכובות נגד P2Y12, למקד את thromboxane A2 ואת השבילים ADP ^4, בהתאמה, המהווים את המסלולים העיקריים המובילים ההפעלה טסיות. עם זאת, מחקר חדשני לקראת יעדים חדשים שיאזנו בצורה אופטימלית תופעות נוגדות וסיכון haemorragic הוא עדיין נחוץ.

מ 1960 ⁵ עד היום, aggregometry turbidimetric שיחק תפקיד מרכזי במחקר, שיפור הידע שלנו היצמדות טסיות הדם ואניn את הניטור של העוצמה של ריאגנטים אנטי טרומבוטיים בבני אדם. Turbidimetry בתחילה היה מוחל PRP מופק דגימות דם. ואכן, איסוף דם שבוצע צינורות המכילים ציטרט מאפשר ייצור מהיר גדול של PRP מבלי כל השפעה על שלמות טסיות ולתפקד. עם זאת, את היציבות לטווח הקצר (כ 3 שעות) של PRP ואת אנזימי plasmatic הנותרים, כגון תרומבין, ואת ריכוז סידן הנמוך הקשורים פרופילי צבירה artefactual בפוטנציה הם של המטרד הזה לשימוש PRP. צעד חשוב קדימה כבר הפיתוח של שיטה לבידוד טסיות עם צנטריפוגה נוסף כביסת שלבי ^6. בקיצור, PRP מבודד דם כולו נאסף על ציטרט חומצת דקסטרוז (ACD) וטסיות מבודדות לאחר צעדי צנטריפוגה סדרה בטרם resuspended ב חיץ פוספט iso-אוסמוטי (החיץ של Tyrode) גלוקוז המכיל, אלבומין אנושי ג divalentהוא שינויים (Ca ²⁺ ו Mg ^2+). כדי להימנע משינויי היצמדות טסיות דם, ה- pH של החיץ של Tyrode נשמר בקפידה על 7.35-7.4. יתר על כן, הפעלה לא רצויה של טסיות נמנעת על ידי הוספת prostacyclin (PGI ₂₎ לפני כמה צעדים צנטריפוגה. לבסוף, תוספת של apyrase מונע טסיות שטף מלהפוך עמיד נגד הפעולה של ה- ATP / ADP. השעית טסיות וכתוצאה חסרת גורמים מקרישים ואת היציבות של טסיות גדלה ב לפחות פי שתיים בהשוואה לפתרונות PRP. בנוסף, העובדה כי טסיות הם כתבים פעילים אך ללא פגע השחזור של מדידות turbidimetric ומספקת את היכולת ללמוד את הפעולה של אגוניסטים או אנטגוניסטים של הצטברות טסיות בצורה אופטימלית.

באמצעות שיטה זו, אנו הראו במחקר שנערך לאחרונה כי מעכב את יצירתו של ערוצי Panx1 ידי גישה גנטית (נוק-אאוט עכברים) או ירידה בפעילות ערוץ Panx1 ידי תרופתיגישות טסיות מופחתת מושרה קולגן צבירה ^7. Panx1 יוצר ערוצי שחרור ATP, אשר באים לידי ביטוי בכל מקום בגוף בסוגי תאים רבים, כולל טסיות אדם ^{7, 8.} למעשה, אנו שהפגנו turbidimetry על אדם שנשטף טסיות כי preincubation 7 הדק 'עם פנל של חוסמים כימיים יותר-או-פחות ספציפיים (probenecid, mefloquine ו ¹⁰ פפטידים Panx1) לפני התוספת של אגוניסטים שונים, עכבות במיוחד קולגן מושרה צימות טסיות דם ואילו תגובות טסיות ל- AA ו- ADP לא הושפעו. הראינו כי שחרור ATP בערוצי Panx1 מפריע במיוחד את מסלול איתות GPVI המוביל צבירה מושרת קולגן. מעניין, מספר תרכובות ה- FDA עם יישומים במחלות אחרות (probenecid, mefloquine) משפיעים על הפעילות של ערוצי Panx1 במספר טסיות הדם. מצד אחד, זו פותחת אופקים חדשים טיפוליים כדי לבחורively לשנות היצמדות טסיות הדם. מצד השני, יש לשקול השפעות משניות פוטנציאל של תרכובות אלה. בהקשר זה, לצבוע מזון הבטוח FCF הכחול המבריק בשימוש סוכריות מרובות ומשקאות אנרגיה תואר בתור מעכב סלקטיבי של Panx1 ^9. אנו מתארים כאן פרוטוקול לבידוד של טסיות נשטף האנושית ומדידות turbidimetric של הצטברות טסיות מותאמים לחקור את ההשפעה של צבע FCF הכחול המבריק כאל יריב של הצטברות טסיות.

Protocol

חמש מתנדב בריאים שאינו קשור גויסו דגימת דם לבדיקות בידוד צימות טסיות דם. הסכמה מדעת נכתב הושג ואת פרוטוקול שאושר על ידי ועדת האתיקה המרכזית של בתי חולים אוניברסיטת ז'נבה. כל המתנדבים מוסמכים להיות בריאים כדי לא נקטו כל תרופות מפריעה-טסיות במהלך לפחות 10 הימים שקדמו ניסויים.

הכנת חוצץ 1. עבור אוסף דם אדם ובידוד טסיות שטף

1. הכן תמיסה מימית 100 מ"ל של חומצה-ציטרט דקסטרוז (ACD) על ידי המסת מונוהידראט 1.4 גרם חומצת לימון (C ₆ H ₈ O ₇ • H ₂ O, 66.6 מ"מ), מימית ציטראט Trisodium 2.5 גרם (Na ₃ C ₆ H ₅ O ₇ • 2 H ₂ O, 85 מ"מ) ו 2 גרם של D נטול מים (+) - גלוקוז. ה- pH של התמיסה הוא כ 4.5.
2. הכן פתרונות מניות עבור החיץ של Tyrode כדלקמן
   1. כן מניות פתרון 1 על ידי המסת 80 גרם NaCl, KCl 2 גרם, 10 גרם NaHCO ₃ ו 0.58 גרם לאא ₂ PO ₄ * H ₂ O ב 500 מיליליטר של H ₂ O. מזוקק הריכוזים הסופיים בהתאמה הם 2.73 M, 53.6 מ"מ, 238 מ"מ ו 8.4 מ"מ. שמור את הפתרון על 4 מעלות צלזיוס.
   2. הכן פתרון המניות 2 על ידי המסת 10.15 גרם MgCl ₂ * 6 H ₂ O (100 מ"מ) ב- 500 מ"ל מזוקקים H ₂ O. שמור פתרון ב- C 4 °.
   3. הכן פתרון מניות 3 על ידי המסת 10.95 גרם (100 מ"מ) CaCl ₂ * 6 H ₂ O ב 500 מ"ל מזוקקים H ₂ O. שמור פתרון ב- C 4 °.
3. הכן חיץ של Tyrode ידי דילול 2.5 מ"ל של פתרון מניות 1 בנפח סופי של 50 מ"ל עם O. H ₂ מזוקקים זו תואמת ריכוזים הסופי של 136.5 מ"מ NaCl, 2.68 mM KCl, 11.9 מ"מ NaHCO ₃ ו 0.42 מ"מ לאא ₂ PO ₄ * H ₂ O. התאם את ה- pH 7.35 לעקר ידי סינון עם 0.22 מיקרומטר Filters.
4. הכן חיץ 0.35% אלבומין של Tyrode (ת"א חיץ ⁷⁾ על ידי דילול 5 מ"ל של פתרון מניות 1, 1 מ"ל של פתרון המניות 2, 2 מ"ל של פתרון המניות 3, 0.5 מ"ל 1M HEPES, 1.8 מ"ל של 200 גר '/ ל אלבומין אנושי 0.1 גרם של D נטול מים (+) - גלוקוז בנפח סופי של 100 מ"ל מזוקקים H ₂ O.
   1. התאם את ה- pH 7.35 עם 1N HCl ולהגדיר את osmolarity כדי 295 mOsm / L ידי הוספת H מזוקק ₂ O (10% של נפח כולל). ריכוזים גמר בתמיסה זו הם: 124 מ"מ NaCl, 2.44 KCl mM, 10.82 מ"מ NaHCO _3, 0.38 מ"מ לאא ₂ PO ₄ * H ₂ O, 0.91 מ"מ MgCl ₂ * 6 H ₂ O, 1.82 מ"מ CaCl ₂ * 6 H ₂ O . שמור חיץ ת"א ב 37 מעלות צלזיוס במהלך הניסוי כולו.

איסוף דם 2.

1. אסוף 45-50 מיליליטר של דם ורידים, מוריד antecubital באמצעות מחט 19 G ואין או חוסם עורקים נמוכים, תוך 50 צינורות מיליליטר conקרישת ACD Taining (1 הנפח ACD עבור 6 כרכים של דם). מחק את הדם 1-2 מ"ל של הראשון כדי למנוע את נוכחותו של תרומבין גורם לרקמות.
   1. לאחר איסוף, לערבב את הדם עם ACD ידי צינור היפוך בעדינות. דגירה המדגם עבור 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.

3. הכנת האדם שנשטפה טסיות

1. טרום לחמם את צנטריפוגות כדי 37 מעלות צלזיוס. כל הצעדים צנטריפוגה מתחת מבוצעים בטמפרטורה זו.
2. שלחי הדם נאסף לתוך 15 מ"ל צינורות (5 מ"ל לכל צינור) צנטריפוגות ב 250 XG במשך 13 דקות כדי להשיג PRP.
   הערה: תוצאות צעד צנטריפוגה זה בייצור משלוש שכבות במדגם: 1) השכבה העליונה, מורכבת הפלזמה, טסיות, ואת חלק קטן של תאי דם לבנים. 2) שכבת ביניים, חלק עשיר בתאי דם לבנים. 3) השכבה התחתונה, אשר מורכבת בעיקר של תאי דם אדומים.
3. אסוף את PRP ידי pipetting la העליוןyer בזהירות לתוך צינור 15 מ"ל חדש למניעת זיהום מקסימאלי עם תאי דם אדומים ולבנים, דגירה במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
4. צנטריפוגה PRP ב 2200 XG במשך 12 דקות (עבור 5 מ"ל PRP).
   הערה: זה צעד צנטריפוגה צריכה להתבצע עם נמוך בלם או בלי בלמים.
5. הסר את supernatant (פלזמה ירודה טסיות), ובזהירות resuspend גלולה עם 10 מ"ל של חיץ ת"א המכיל 2 μL / מ"ל של הפרין (5000 U / mL) ו 2.5 μL / מ"ל של 25 מיקרומטר PGI ₂ באמצעות pipet פלסטיק פסטר. דגירה של 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
6. להוסיף 2.5 μL / מיליליטר של 25 מיקרומטר PGI ₂ צנטריפוגות במשך 8 דקות ב 1900 XG (עם בלם נמוך או ללא בלם).
7. הסר את supernatant מחדש להשעות את גלולה עם 5 חיץ מ"ל ת"א המכיל 2.5 μL / מ"ל של 25 מיקרומטר PGI ₂ באמצעות pipet פלסטיק פסטר. דגירה של 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
8. בתקופת הדגירה, pipet 150 μL של ההשעיה טסיותכדי צינור 1.5 מיליליטר ולספור טסיות, באמצעות דלפק תא automatized (שמזהה את הגודל של תאי דם על ידי מדידת שינויי ההתנגדות ישירה נוכחית).
9. לאחר דגירה 10 דקות, להוסיף 2.5 μL / מ"ל של 25 מיקרומטר PGI ₂ להשהייה טסיות צנטריפוגות מיד 1900 XG במשך 8 דקות.
10. הסר את supernatant מחדש להשעות את הגלולה לריכוז של 250,000 טסיות / μL עם נפח נאות של חיץ ת"א (כלומר אם את ספירת התאים היא 500,000 לכל μL, גלולה ב 10 חיץ המ"ל ת"א) המכיל 32 μL / מיליליטר של apyrase ב 0.01 U / מ"ל ​​(ריכוז סופי 0.32 U / mL).
    הערה: ריכוז גבוה של apyrase משמש כדי למנוע את הקהיה של קולטני P2X1 המושרה על ידי הפרשת ספונטנית של ^{10 ATP, 11} בהיעדרו של אגוניסטים. זה חשוב כי תגובות מושרות קולגן הם המושרה על ידי paracrine המהיר / הפעלת autocrine של P2X1 ידי ATP שפורסמה frאום מופעל טסיות. אם את מסלול איתות טסיות אינו מחייב באופן ביקורתי שימור התפקוד P2X1, להשתמש 0.02 U / mL apyrase. מספר מחקרים (הנסקרת ב Mahaut-סמית ואח '. ¹⁰⁾ הדגימו כי 0.02 U / mL apyrase ימנע הקהיה P2Y1 קולטן ADP עם התגובות P2X1 זניח.
11. לדגור על השעיית התא למשך 30 דקות לפחות 37 מעלות צלזיוס לפני ביצוע מדידות aggregometric. ההכנה היא יציבה במשך 5 עד 8 שעות.

4. aggregometry

1. הכן פיברינוגן (56 מ"ג / מ"ל) במאגר של Tyrode.
2. Pipet 260 μL של השעיה טסיות לתוך cuvettes זכוכית (איור 1A; קובט שמאל) המכיל 10 μL של פיברינוגן (56 מ"ג / מ"ל) ו מוט בחישה מגנטית, ואז דגירה ההשעיה עבור 2 - 3 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בארות הדגירה הנוכחי ב aggregometer (איור 1B ו 1C).
3. טרום דגירה עם Panx1מעכב FCF כחול מבריק על ידי הוספת 10 μL של פתרון המניות 2.8 מ"מ או 28 מ"מ (מיקרומטר 100 הריכוז הסופי 1 מ"מ, בהתאמה) עבור 7 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
4. כייל את aggregometer לערך צבירה 100% ובשיא ידי מדידת OD של קובט המכיל פיברינוגן 10 μL (56 מ"ג / מ"ל), 10 μL FCF כחול מבריק (2.8 מ"מ או 28 מ"מ) חיץ ת"א ללא טסיות.
   1. מניח את קובט ב הצטברות היטב תחת בחישה אוטומטית ולחץ על הכפתור המתאים במקלדת של המחשב הצמוד aggregometer (F1 העיתונות כלומר אם גם צבירת 1 משמש).
      הערה: ניסוי זה כמתואר להלן כולל FCF הכחול מבריק. המתחם משמש לכיול צריך להיות מותאם על תנאי הניסוי.
5. כייל את aggregometer לערך צבירת 0% ובשיא באמצעות המדגם הזהה טסיות אשר ישמש לצורך הניסוי תחת בערבוב אוטומטיז.
   1. מניחים את קובט של צבירה היטב ולחץ על הכפתור המתאים במקלדת של המחשב צמוד aggregometer. מתן כ 20-30 s לפני שתמשיך. עיכוב זה משמש כדי להבטיח ששום צבירה קורית לפני הוספת אגוניסטים.
      הערה: כמו כל הבדל מספר הטסיות עלול להיות השפעה על OD נמדד, צעד כיול 0% יש צורך לחזור על כל מדידה בודדת.
6. להוסיף 20 μL של אגוניסט הרצוי, כגון 15 מיקרוגרם / מ"ל ​​קולגן (1 מיקרוגרם / מ"ל ​​הסופי) או 1.125 מ"מ החומצה הארכידונית (75 מיקרומטר הסופי), לתוך קובט. מיד מתחיל להקליט תחת בחישה אוטומטית רציפה על ידי לחיצה על הכפתור המתאים במקלדת של המחשב צמוד aggregometer.
   הערה: התוספת של אגוניסט גורמת הפעלת טסיות. אגרגטים טסיות ניתן להבחין בבירור קובט זכוכית בסוף הניסוי (איור 1A; righקובט t).
7. ההקלטה נפסקת באופן אוטומטי לאחר 6 דקות. בשלב זה, לשמור את הנתונים על ידי לחיצה על הסמל להציל את המחשב.
   הערה: החישוב של שיעור הצבירה מבוצעת על ידי המחשב, אשר מבטא את התוצאות בסופו של תהליך ההצטברות כאחוז.
8. לנתח את הנתונים.
   1. לקבלת מידע נרחב נוסף על פרוטוקולים להכנת השעיות טסיות נשטפו ומדידת turbidimetric של הצטברות טסיות, מתייחס עיתונים אחרים שחברו מומחים בתחום ^{12, 13.}

תוצאות

תוכנת aggregometer אוטומטית מייצרת את עקומות צבירה ונותנת את הערכים עבור צבירה מירבית באחוזים. הערכים ניתן להעתיק תוכנה לניתוח נתונים על מנת לבצע ניתוח סטטיסטי ולדמיין ערכי צבירה מירבית בצורה של תרשימים ברים. לחלופין, כל נקודה בודדת של עקומות צבירה ניתן ...

Discussion

יש עניין רב במציאת תרופות חדשות המסוגל ויסות תפקוד הטסיות כדי למנוע פקקת ללא שיפור את הסיכון לדימום. לשם כך, בבדיקות מעבדה במבחנה אשר יכול באמינות reproducibly לפקח תגובות אגרגציה טסיות אדם נחוצות לחלוטין. aggregometry Turbidimetric הוא טכניקה קלה לביצוע. עם זאת, כמה אמצעי זה?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
citric acid monohydrate (C6H8O7*H2O)	Roth	5949-29-1	danger of eye damage/irritation
trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7*2H2O)	Sigma-Aldrich	S1804	-
D(+)-glucose	Sigma-Aldrich	G8270	-
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	-
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	-
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6014	-
Sodium dihydrogenophosphate monohydrate (NaH2PO4*H2O)	Sigma-Aldrich	S9638	-
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2*6H2O)	Sigma-Aldrich	M9272	-
Calcium chloride hexahydrate (CaCl2*6H2O)	Sigma-Aldrich	442909	danger of eye damage/irritation
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (Hepes)	ThermoFisher Scientific	15630	-
human serum albumin	CSL Behring	00257/374	-
hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	320331	Corrosive and irritative for the respiratory system. Can cause severe skin and eye damages.
Eppendorf 5810 R	Fisher Scientific	-	-
heparin	Drosspharm AG/SA	20810
prostacyclin I2 (PGI2)	Cayman	18220	-
apyrase from potatoes	Sigma-Aldrich	A6535	-
fibrinogen (Haemocomplettan)	CSL Behring	HS 73466011	-
thrombo-aggragometer SD-Medical	SD-Innovation	TA8V	-
Brilliant blue FCF (Erioglaucine disodium salt)	Sigma-Aldrich	80717	Harmful to aquatic life with long lasting effects (Avoid release to the environnement)
collagen	Horm, Nycomed		-
arachidonic acid	Bio/Data corporation	C/N 101297	-
cell counter Sysmex KX-21N	Sysmex Digitana	-	-
HEPES	Gibco	15630-056	-
glass cuvettes	SD-Innovation	THCV1000	-
magnetic stirrers	SD-Innovation	THA100	-