Turbidimétrie sur Human Washed: L'effet Plaquettes du Pannexin1 inhibiteur bleu brillant FCF sur l'agrégation induite par le collagène

Résumé

Nous décrivons un procédé simple pour l'isolement des plaquettes lavées à partir de sang humain suivie par des mesures de l'agrégation plaquettaire induite par l'agoniste par turbidimétrie. À titre d'exemple, nous appliquons cette méthode pour étudier la réponse d'agrégation des plaquettes sanguines humaines au collagène après une pré-incubation avec l'inhibiteur du canal Pannexin1 bleu brillant FCF.

Résumé

Turbidimétrie est une technique de laboratoire qui est appliquée pour mesurer l'agrégation des plaquettes en suspension soit dans le plasma (plasma riche en plaquettes, PRP) ou dans un tampon (plaquettes lavées), par l'utilisation d'une ou d'une combinaison d'agonistes. L'utilisation de plaquettes lavées séparés de leur environnement de plasma et en l'absence d'anticoagulants permet d'étudier les propriétés intrinsèques des plaquettes. Parmi le grand groupe d'agonistes, l'acide arachidonique (AA), l'adénosine di-phosphate (ADP), la thrombine et le collagène sont les plus fréquemment utilisés. La réponse d'agrégation est quantifié en mesurant la densité optique relative (OD) dans le temps de suspension de plaquettes sous agitation continue. Les plaquettes en suspension homogène limitent le passage de la lumière après l'addition d'un agoniste, le changement de forme des plaquettes se produit produisant une légère augmentation transitoire de la DO. Après cette étape d'activation initiale, les caillots de plaquettes forment progressivement, ce qui permet le passage de la lumière à travers la suspension en tant que resULT de diamètre extérieur a diminué. Le processus d'agrégation est finalement exprimé en pourcentage, par rapport à la densité optique du plasma pauvre en plaquettes ou de tampon. l'étalonnage est donc essentiel Rigoureuse au début de chaque expérience. En règle générale: étalonnage à 0% est réglé en mesurant la DO d'une suspension de plaquettes non stimulées tout en mesurant la densité optique du milieu de suspension ne contenant pas de plaquettes représente une valeur de 100%. L'agrégation plaquettaire est généralement visualisé sous la forme d'une courbe d'agrégation en temps réel. Turbidimétrie est l'un des plus souvent des techniques de laboratoire utilisées pour l'étude de la fonction plaquettaire et est considéré comme l'étalon-or historique et utilisé pour le développement de nouveaux agents pharmaceutiques visant à inhiber l'agrégation plaquettaire. Nous décrivons ici des protocoles détaillés pour 1) la préparation de plaquettes lavées humaine et 2) l'analyse turbidimétrique de l'agrégation induite par le collagène de plaquettes lavées humain prétraité avec le colorant alimentaire bleu brillant FCF qui a été récemment iDENtifié comme inhibiteur de canaux (Pannexin1 de Panx1).

Introduction

Les plaquettes sont des éléments essentiels du sang et de leur principale fonction en même temps que les facteurs de coagulation-est d'arrêter le saignement après une blessure des vaisseaux sanguins. Les plaquettes sont de petits (2-3 pm) de fragments anucléées dérivés de mégacaryocytes de la moelle osseuse ^1. Les plaquettes circulent dans l'état non activé, au cours de laquelle ils apparaissent comme des structures en forme de lentille. Lors de l'interruption de l'endothélium, les plaquettes se réunissent pour le site de la lésion des vaisseaux sanguins pour boucher le trou, un processus appelé hémostatique primaire. Dans un premier temps , les plaquettes se fixent aux molécules de sous-endothélial, tels que le collagène et le facteur de von Willebrand, qui sont exposés à la suite de l'étape d'adhésion des blessures ^2. Ensuite, ils changent de forme et sécrètent chimique étape messagers-activation. Enfin, ils se connectent les uns aux autres en comblant l'étape récepteurs de l'agrégation. L'hémostase primaire est suivie par un processus secondaire impliquant l'activation de la cascade de la coagulation avec un dépôt de fibrine, qui stabilisents le thrombus initial ^2.

Des événements ischémiques aigus tels que l' infarctus du myocarde ³ résultent souvent de thrombus qui se forment en raison de la perturbation physique (rupture) d'une plaque athéroscléreuse. médicaments antiplaquettaires actuels sont la pierre angulaire du traitement de cette maladie généralisée mais leur bénéfice clinique est limitée par un risque accru de saignement. Les médicaments les plus prescrits chez les patients cardio - vasculaires, l' aspirine et des composés anti-P2Y12, cible le thromboxane A2 et les voies d' ADP ^4, respectivement, qui sont les principales voies conduisant à l' activation des plaquettes. Cependant, la recherche novatrice vers de nouvelles cibles qui équilibre de façon optimale les effets antithrombotiques et le risque est encore nécessaire hémorragique.

A partir des années 1960 ⁵ aujourd'hui, turbidimétrique agrégométrie a joué un rôle crucial dans la recherche, l' amélioration de notre connaissance de la réactivité plaquettaire et in le contrôle de la puissance des réactifs anti-thrombotiques chez les humains. Turbidimétrie a d'abord été appliquée à PRP extrait à partir d'échantillons de sang. En effet, la collecte de sang réalisée dans des tubes contenant du citrate permet une production rapide et importante de PRP sans avoir aucun effet sur l'intégrité et la fonction plaquettaire. Cependant, la stabilité à court terme (environ 3 h) de PRP et les enzymes plasmatiques restantes, telles que la thrombine, et la faible concentration de calcium associé à des profils d'agrégation potentiellement artefactuelles sont des inconvénients majeurs pour l'utilisation de PRP. Un pas important a été la mise au point d'un procédé pour l' isolement des plaquettes avec une centrifugation supplémentaire et lavage étapes ^6. En bref, le PRP est isolé à partir de sang total prélevé sur citrate-dextrose acide (ACD) et les plaquettes sont isolés après les étapes de centrifugation en série avant d'être remis en suspension dans un tampon de phosphate iso-osmotique (le tampon de Tyrode) contenant du glucose, de l'albumine de sérum humain et c divalentations (Ca ²⁺ et Mg ^2+). Pour éviter des changements dans la réactivité plaquettaire, le pH du tampon de Tyrode est soigneusement maintenu à 7,35 à 7,4. De plus, l' activation indésirable des plaquettes est empêchée par l' addition de la prostacycline (PGI ₂₎ avant des étapes de centrifugation. Enfin, l'ajout de apyrase empêche les plaquettes de devenir résistant à la chaux contre l'action de l'ATP / ADP. La suspension de plaquettes résultante manque de facteurs coagulants et la stabilité des plaquettes est augmentée d'au moins deux fois par rapport à des solutions PRP. En outre, le fait que les plaquettes sont bons mais inactifs intactes la reproductibilité des mesures turbidimétriques et offre la possibilité d'étudier l'action d'agonistes ou d'antagonistes de l'agrégation plaquettaire de manière optimale.

En utilisant cette méthode, nous avons montré dans une étude récente que l'inhibition de la formation de canaux de Panx1 par une approche génétique (souris knock-out) ou en diminuant l'activité des canaux Panx1 par pharmacologiqueapproche réduit l' agrégation plaquettaire induite par le collagène ^7. Forme Panx1 canaux ATP à libération, qui sont exprimés de manière ubiquitaire dans de nombreux types de cellules , y compris les plaquettes humaines ^{7, 8.} En fait, nous avons démontré par turbidimétrie sur les plaquettes lavées humain qui a 7 min préincubation avec un groupe de blocage des produits chimiques plus ou moins spécifiques (probénécide, la méfloquine et ¹⁰ peptides Panx1) avant l'addition de divers agonistes, inhibée spécifiquement induite par le collagène l'agrégation plaquettaire alors que les réponses des plaquettes à AA et ADP ne sont pas affectés. Nous avons démontré que la libération d'ATP par la voie Panx1 interfère spécifiquement dans la voie de signalisation de GPVI conduisant à l'agrégation induite par le collagène. Fait intéressant, plusieurs composés approuvés par la FDA avec des applications dans d'autres maladies (probénécide, méfloquine) affectent l'activité des canaux Panx1 dans les plaquettes. D'une part, cela ouvre de nouvelles perspectives thérapeutiques pour sélectionnermodifier ivement réactivité plaquettaire. D'autre part, il faut tenir compte des effets secondaires potentiels de ces composés. Dans ce contexte, le colorant alimentaire sain bleu brillant FCF utilisé dans plusieurs bonbons et des boissons énergisantes a été décrit comme un inhibiteur sélectif de Panx1 ^9. Nous décrivons ici un protocole pour l'isolement des plaquettes lavées de l'homme et des mesures turbidimétriques de l'agrégation plaquettaire adapté pour étudier l'effet du colorant bleu brillant FCF comme un antagoniste de l'agrégation plaquettaire.

Protocole

Cinq volontaires sains non apparentés ont été recrutés pour le prélèvement sanguin pour les tests d'isolement et l'agrégation plaquettaire. Le consentement éclairé écrit a été obtenu et le protocole a été approuvé par le Comité central d'éthique des Hôpitaux Universitaires de Genève. Tous les bénévoles certifiés pour être en bonne santé et ont pris aucun médicament interférant plaquettaire pendant au moins les 10 jours précédant les expériences.

1. Tampon Préparation pour la collecte de sang humain et Lavé Isolation Platelet

1. Préparer une solution aqueuse d'acide-citrate-dextrose 100 mL (ACD) en dissolvant 1,4 g de monohydrate d'acide citrique (C ₆ H ₈ O ₇ • H ₂ O, 66,6 mM), 2,5 g de dihydrate de citrate trisodique (Na ₃ C ₆ H ₅ O ₇ • H ₂ O 2, 85 mM) et 2 g de D anhydre (+) - glucose. Le pH de la solution est d'environ 4,5.
2. Préparer des solutions de stock pour le tampon de Tyrode comme suit
   1. Préparer la solution mère 1 en dissolvant 80 g de NaCl, 2 g de KCl, 10 g de NaHCO ₃ et de 0,58 g de NaH ₂ PO ₄ * H ₂ O dans 500 ml d'eau distillée ₂ O. Les concentrations finales respectives sont 2,73 M, 53,6 mM, 238 mM et 8,4 mM. Conserver la solution à 4 ° C.
   2. Préparer la solution mère en dissolvant 2 g 10,15 _MgCl2 * 6 H ₂ O (100 mM) dans 500 ml d' H ₂ O. distillée Conserver la solution à 4 ° C.
   3. Préparer la solution mère en dissolvant 3 g 10,95 (100 mM) CaCl ₂ * 6 H ₂ O dans 500 ml d' eau distillée ₂ O. Conserver la solution à 4 ° C.
3. Préparer du tampon de Tyrode en diluant 2,5 ml de solution mère 1 dans un volume final de 50 ml avec de l' eau distillée ₂ O. Ceci correspond à des concentrations finales de 136,5 mM de NaCl, 2,68 mM de KCl, 11,9 mM de NaHCO ₃ et de 0,42 mM de NaH ₂ PO ₄ * H ₂ O. Ajuster le pH à 7,35 et stériliser par filtration à 0,22 um filters.
4. Préparer le tampon d'albumine de Tyrode 0,35% (tampon TA ⁷⁾ par dilution de 5 ml de solution mère 1, 1 ml de solution mère 2, 2 mL de solution mère 3, 0,5 ml de 1 M de HEPES, 1,8 ml de sérum - albumine humaine 200 g / L et 0,1 g de D anhydre (+) - glucose dans un volume final de 100 ml distillée H ₂ O.
   1. Ajuster le pH à 7,35 avec du HCl 1 N et régler l'osmolarité de 295 mOsm / L par addition de H ₂ O distillée (10% du volume total). Les concentrations finales dans cette solution sont les suivantes : 124 mM de NaCl, 2,44 mM de KCl, 10,82 mM NaHCO _3, 0,38 mM de NaH ₂ PO ₄ * H ₂ O, 0,91 mM de _MgCl2 * 6 H ₂ O, 1,82 mM de _CaCl2 * 6 H ₂ O . Garder tampon TA à 37 ° C pendant toute l'expérience.

2. Collecte de sang

1. Recueillir 45-50 ml de sang veineux à partir de la veine cubitale antérieure en utilisant une aiguille 19 G et peu ou pas tourniquet, dans des tubes de 50 ml de ConTaining anticoagulant ACD (1 volume ACD pour 6 volumes de sang). Jeter le premier 1-2 ml de sang pour éviter la présence de la thrombine et le facteur tissulaire.
   1. Après la collecte, mélanger le sang avec l'ACD en inversant doucement le tube. Incuber l'échantillon pendant 10 min à 37 ° C.

3. Préparation de l'homme Washed plaquettes

1. Préchauffer la centrifugeuse à 37 ° C. Toutes les étapes de centrifugation ci-dessous sont effectuées à cette température.
2. Envoyer le sang collecté dans des tubes de 15 ml (5 ml par tube) et centrifuger à 250 g pendant 13 min pour obtenir du PRP.
   Remarque: Cette étape de centrifugation conduit à la production de trois couches de l'échantillon: 1) La couche supérieure, composée de plasma, de plaquettes, et une petite fraction de globules blancs. 2) La couche intermédiaire, une partie riche en globules blancs. 3) La couche inférieure, qui est constitué essentiellement de globules rouges.
3. Recueillir le PRP par pipetage la supérieure layer avec précaution dans un nouveau tube de 15 ml au maximum pour éviter une contamination par les globules rouges et blancs, et incuber pendant 10 min à 37 ° C.
4. Centrifuger le PRP à 2200 g pendant 12 min (pour 5 ml de PRP).
   NOTE: doit être effectuée Cette étape de centrifugation avec frein à faible ou sans frein.
5. Retirer le surnageant (plasma pauvre en plaquettes), et remettre en suspension avec précaution du culot avec 10 ml de tampon TA contenant 2 ul / ml d'héparine (5000 U / ml) et 2,5 ul / ml de 25 uM PGI ₂ en utilisant une matière plastique pipette Pasteur. Incuber pendant 10 min à 37 ° C.
6. Ajouter 2,5 ul / ml de 25 uM de PGI ₂ et centrifuger pendant 8 min à 1900 xg (avec frein ou sans frein bas).
7. Eliminer le surnageant et remettre en suspension le culot avec 5 ml de tampon TA contenant 2,5 ul / ml de 25 uM PGI ₂ en utilisant une pipette Pasteur en matière plastique. Incuber pendant 10 min à 37 ° C.
8. Au cours de la période d'incubation, pipeter 150 ul de la suspension de plaquettes dansdans un tube de 1,5 ml et compter les plaquettes, en utilisant un compteur de cellules automatisé (qui détecte la taille des cellules du sang en mesurant les variations de la résistance en courant continu).
9. Après l'incubation de 10 min, ajouter 2,5 ul / ml de 25 uM PGI ₂ de la suspension de plaquettes et immédiatement centrifuger à 1900 g pendant 8 min.
10. Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot à une concentration de 250.000 plaquettes / ul avec un volume suffisant de tampon TA ( par exemple , si le nombre de cellules est de 500.000 par uL, remettre en suspension dans 10 ml de tampon TA) contenant 32 pl / ml d'apyrase à 0,01 U / mL (concentration finale de 0,32 U / mL).
    NOTE: Une concentration élevée de l' apyrase est utilisé pour éviter la désensibilisation des récepteurs de la P2X1 induites par la sécrétion spontanée de l' ATP ^{10, 11} en l' absence d'agonistes. Ceci est important parce que les réponses induite par le collagène sont induites par paracrine rapide / activation autocrine de P2X1 par l'ATP publié from activé plaquettes. Si la voie de signalisation plaquettaire ne nécessite pas de manière critique la préservation de la fonction P2X1, utilisez 0,02 U / ml apyrase. Plusieurs études (examinées dans Mahaut-Smith et al. ¹⁰⁾ ont démontré que 0,02 apyrase U / ml évite désensibilisation récepteur P2Y1 ADP avec des réponses P2X1 négligeables.
11. Incuber la suspension de cellules pendant au moins 30 min à 37 ° C avant d'effectuer les mesures aggregometric. La préparation est stable pendant 5 à 8 heures.

4. agrégométrie

1. Préparer le fibrinogène (56 mg / ml) dans du tampon de Tyrode.
2. Pipeter 260 ul de suspension de plaquettes dans des cuvettes en verre (Figure 1A; cuvette gauche) contenant 10 pl de fibrinogène (56 mg / mL) et une tige d'agitation magnétique, puis incuber la suspension pendant 2 - 3 minutes à 37 ° C dans les puits d'incubation présents dans l'agrégomètre (Figure 1B et 1C).
3. Pré-incubation avec le Panx1inhibiteur bleu brillant FCF par addition de 10 ul d'une 2,8 mM ou 28 mM de solution mère (concentration finale de 100 uM et 1 mM, respectivement) pendant 7 minutes à 37 ° C.
4. Calibrer l'agrégomètre à une valeur d'agrégation assomptive 100% par mesure de la DO d'une cuvette contenant 10 ul de fibrinogène (56 mg / ml), 10 ul de bleu brillant FCF (2,8 mM ou 28 mM) et du tampon TA sans plaquettes.
   1. Placer la cuvette dans une agrégation et sous agitation automatique et appuyez sur la touche correspondante sur le clavier de l'ordinateur relié à l'agrégomètre (c. - presse F1 si bien d'agrégation 1 est utilisé).
      NOTE: Cette expérience décrite ci-dessous comprend bleu brillant FCF. Le composé utilisé pour le calibrage doit être ajusté à la condition expérimentale.
5. Calibrer l'agrégomètre à une valeur d'agrégation de 0% assomptive en utilisant le même échantillon de plaquettes qui seront utilisées pour l'expérience sous Stirrin automatiqueg.
   1. Placez la cuvette bien dans l'agrégation et appuyez sur la touche correspondante sur le clavier de l'ordinateur lié à la agrégomètre. Attendez environ 20-30 s avant de poursuivre. Ce délai permet d'assurer que l'agrégation ne se produit avant d'ajouter les agonistes.
      Remarque: Comme toute différence dans le nombre de plaquettes peut avoir un effet sur le diamètre extérieur mesuré, l'étape d'étalonnage à 0% doit être répétée pour chaque mesure individuelle.
6. Ajouter 20 ul d'agoniste souhaité, tel que 15 pg / ml de collagène (finale 1 pg / ml) ou 1,125 mM d'acide arachidonique (75 uM final), dans la cuvette. Immédiatement démarrer l'enregistrement, sous agitation continue et automatique en appuyant sur la touche correspondante sur le clavier de l'ordinateur relié à l'agrégomètre.
   REMARQUE: L'ajout de l'agoniste induit une activation plaquettaire. Agrégats plaquettaires peuvent être clairement distinguées dans la cuve de verre à la fin de l'expérience (Figure 1A; droiCuve t).
7. L'enregistrement arrête automatiquement après 6 min. À ce stade, sauvegardez les données en cliquant sur l'icône de sauvegarde de l'ordinateur.
   NOTE: Le calcul du taux d'agrégation est effectuée par l'ordinateur, qui exprime le résultat final du processus d'agrégation en pourcentage.
8. Analyser les données.
   1. Pour des informations détaillées supplémentaires sur les protocoles pour la préparation de suspensions de plaquettes lavées et de la mesure turbidimétrique de l' agrégation plaquettaire, se référer à d' autres documents rédigés par des experts dans le domaine de ^{12, 13.}

Résultats

Le logiciel agrégomètre produit automatiquement les courbes d'agrégation et donne les valeurs pour l'agrégation maximale en pourcentage. Les valeurs peuvent être copiées dans un logiciel d'analyse de données afin d'effectuer des analyses statistiques et de visualiser les valeurs d'agrégation maximale sous forme de graphiques à barres. En option, chaque point de la courbe d'agrégation peut être exporté successivement dans un tableur puis de logiciels st...

Discussion

Il y a un grand intérêt à trouver de nouveaux médicaments capables de moduler la fonction plaquettaire afin d'éviter une thrombose sans augmenter le risque de saignement. A cet effet, des tests in vitro de laboratoire qui peuvent surveiller de manière fiable et reproductible des réponses d'agrégation dans les plaquettes humaines sont absolument nécessaires. Turbidimétrique agrégométrie est une technique facile à réaliser. Cependant, certaines précautions doivent garder à l'esprit. Le...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
citric acid monohydrate (C6H8O7*H2O)	Roth	5949-29-1	danger of eye damage/irritation
trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7*2H2O)	Sigma-Aldrich	S1804	-
D(+)-glucose	Sigma-Aldrich	G8270	-
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	-
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	-
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6014	-
Sodium dihydrogenophosphate monohydrate (NaH2PO4*H2O)	Sigma-Aldrich	S9638	-
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2*6H2O)	Sigma-Aldrich	M9272	-
Calcium chloride hexahydrate (CaCl2*6H2O)	Sigma-Aldrich	442909	danger of eye damage/irritation
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (Hepes)	ThermoFisher Scientific	15630	-
human serum albumin	CSL Behring	00257/374	-
hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	320331	Corrosive and irritative for the respiratory system. Can cause severe skin and eye damages.
Eppendorf 5810 R	Fisher Scientific	-	-
heparin	Drosspharm AG/SA	20810
prostacyclin I2 (PGI2)	Cayman	18220	-
apyrase from potatoes	Sigma-Aldrich	A6535	-
fibrinogen (Haemocomplettan)	CSL Behring	HS 73466011	-
thrombo-aggragometer SD-Medical	SD-Innovation	TA8V	-
Brilliant blue FCF (Erioglaucine disodium salt)	Sigma-Aldrich	80717	Harmful to aquatic life with long lasting effects (Avoid release to the environnement)
collagen	Horm, Nycomed		-
arachidonic acid	Bio/Data corporation	C/N 101297	-
cell counter Sysmex KX-21N	Sysmex Digitana	-	-
HEPES	Gibco	15630-056	-
glass cuvettes	SD-Innovation	THCV1000	-
magnetic stirrers	SD-Innovation	THA100	-