Kollajen ile indüklenen on Aggregation Pannexin1-inhibitör Parlak Mavi FCF: Türbidimetrik İnsanlar üzerinde Trombositler Yıkanmış

Özet

Biz bulanıklık derecesi agonist kaynaklı trombosit agregasyon ölçümleri ile takip insan kanından yıkanıp trombosit izolasyonu için basit bir yöntem tarif eder. Bir örnek olarak, Pannexin1 kanalı inhibitörü Parlak Mavi FCF ile bir ön kuluçkalama sonrası kollajen insan trombosit agregasyon cevap üzerinde çalışma yapılması için bu yöntemi uygulanır.

Özet

Türbidimetrik birine ait kullanım ya da agonist bir kombinasyonu ile (yıkanmış trombositler), ya plazma (platelet bakımından zengin plazma, PRP) 'de ya da tampon maddesi içinde süspansiyon haline getirildi, trombosit agregasyonunu ölçülmesi için tatbik edilen bir laboratuar tekniğidir. plazma ortamından ve antikoagülan yokluğunda ayrılır, yıkanır platelet kullanımı içsel trombosit özelliklerini incelemek için izin verir. agonistleri, arakidonik asit (AA), adenozin, di-fosfat (ADP), büyük panelin arasında, trombin ve kollajen en sık kullanılanlardır. agregasyon yanıtı sürekli karıştırma altında trombosit süspansiyonu zamanla görece optik yoğunluk (OD) ölçerek belirlenir. Homojen süspansiyon içinde trombositler bir agonistin eklenmesinden sonra ışığın geçişini sınırlandırmak, trombosit şekil değişimi OD küçük geçici artış meydana oluşur. Bu ilk Aktivasyon aşamasından sonra, trombosit pıhtıları, res olarak süspansiyon içinden ışığın geçmesine izin veren, yavaş yavaş meydanave ön muamele OD azalmıştır. toplama işlemi sonunda, trombosit bakımından fakir plazma ya da tampon OD ile karşılaştırıldığında, bir yüzde olarak ifade edilir. Titiz kalibrasyon her denemenin başında dolayısıyla esastır. Genel bir kural olarak: Kalibrasyon% 0 hiçbir trombositlerden oluşan süspansiyon ortamının OD ölçümü% 100 arasında bir değere temsil ederken olmayan bir uyarılan platelet süspansiyonu OD ölçümü ile ayarlanır. Trombosit agregasyonu, genellikle gerçek zamanlı agregasyon eğrisinin olarak görülür. Türbidimetrik platelet fonksiyonunun incelenmesi için en yaygın olarak kullanılan laboratuar tekniklerinden biridir ve tarihi altın standart olarak kabul edilir ve platelet toplanmasını inhibe etmeyi hedefleyen yeni farmasötik maddelerin geliştirilmesi için kullanılır. Burada, insan hazırlanması yıkanmış plateletler ve insan kolajen kaynaklı agregasyonun 2) türbidimetrik analiz trombositler son kimliklerini olduğu gıda boyası Parlak Mavi FCF ile ön işleme tabi tutulmuş, yıkanmış) 1 için ayrıntılı protokoller tarifPannexin1 (Panx1) kanallarının bir inhibitörü olarak tified.

Giriş

Trombositler, kan ve pıhtılaşma ile ana işlevi-birlikte önemli bileşenleridir, kan damar hasarı sonrası kanamayı durdurmak için faktörlerin-olduğunu. Trombositler, kemik iliği ¹ megakaryosit türetilmiş küçük (2-3 um) nukleussuz fragmanlarıdır. Trombositler ve bu süreçte mercek şeklinde yapılar olarak görünür, aktif olmayan halde dolaşır. endotelyumdaki kesinti üzerine, trombosit delik, birincil hemostaz adı verilen bir işlem takmak için kan damarı hasar bölgesinde toplanır. Başlangıçta, trombositler yaralanma yapışma aşama ^2'de bir sonucu olarak maruz kollajen ve von Willebrand faktörü gibi bir alt endotelial moleküller, ekleyin. Sonra, şekil değiştirebilir ve kimyasal haberciler-aktivasyon aşamasını salgılar. Son olarak, reseptörleri toplanma aşaması köprü ile birbirine bağlanır. Primer hemostaz stabilize fibrin birikimi, pıhtılaşma aktivasyonu kapsayan bir ikincil işlem takip ederBaşlangıç trombus ² s.

Miyokardiyal enfarktüs ³ olarak akut iskemik olaylar nedeniyle sıklıkla bir aterosklerotik plak fiziksel parçalama (kopma) arasında meydana trombusları. Güncel antiplatelet ilaçlar bu yaygın hastalığın tedavisinde temel taşlarıdır ancak klinik yarar kanama riskinde artış ile sınırlıdır. Kardiyovasküler hastalarda, aspirin ve anti-P2Y12 bileşikleri en çok önerilen ilaçlar, tromboksan A2 ve trombosit aktivasyonu giden ana yollar sırasıyla ADP yollar ^4, hedef. Ancak, optimum antitrombotik etkileri ve hemorajik riski dengelemek olurdu yeni hedeflere doğru yenilikçi araştırmalar hala gereklidir.

Bugüne 1960'lardan ⁵ itibaren, türbidimetrik agregometri trombosit reaktivitesi ve i bilgimizi arttırmak, araştırma önemli bir rol oynamıştırİnsanlarda anti-trombotik reaktiflerin potansiyelinin kontrolü n. Türbidimetrik ilk kan örneklerinden ekstrakte PRP uygulanmıştır. Gerçekten de, kan toplama sitrat trombosit bütünlüğü ve işlevi üzerinde herhangi bir etkiye sahip olmaksızın PRP hızlı ve büyük üretimine izin verir içeren tüpler içerisinde gerçekleştirildi. Bununla birlikte, PRP kısa süreli kararlılık (yaklaşık 3 saat) ve trombin gibi kalan plazmatik enzim, ve potansiyel olarak artefakt agregasyon profilleri ile bağlantılı düşük kalsiyum konsantrasyonlu PRP kullanımı için önemli bir rahatsızlık vardır. Önemli bir ilerleme ek bir santrifüjleme ve yıkama ⁶ numaralı adımları ile trombosit izolasyonu için bir yöntemin geliştirilmesi olmuştur. bir izo-ozmotik bir fosfat tamponu (Tyrode tamponu) içeren glikoz, insan serum albumini ve iki değerli c tekrar askıya alınmadan önce Kısacası, PRP asit sitrat dektroz (CD) üzerinde alınan tam kandan izole edilir ve trombosit seri santrifüj aşamasından sonra izole ediliralar (Ca2 ⁺ ve ^{Mg2 +).} trombosit reaktivite değişiklikleri önlemek için, Tyrode tamponu pH dikkatli bir şekilde 7.35-7.4 tutulur. Ayrıca, trombositlerin arzu edilmeyen aktivasyonunun, bir santrifüj aşamasından önce _(PGI2) prostasiklin ilave edilerek baskılanmaktadır. Son olarak, apiraz eklenmesi ATP / ADP etkisine karşı dirençli hale gelen yıkanmış trombositler engeller. Elde edilen trombosit süspansiyonu pıhtılaştırıcı faktörler sahip değildir ve PRP çözümlere kıyasla gibi platelet stabilitesi, en azından iki kat artar. Buna ek olarak, trombositler aktif olmayan fakat sağlam garanti eder türbidimetrik ölçümlerin tekrarlanabilirlik ve aslında optimal bir şekilde agonistleri veya trombosit agregasyon antagonistlerinin işlem çalışma olanağı sağlar.

Bu yöntemi kullanarak, son çalışmada göstermiştir ki, bir genetik yaklaşım Panx1 kanallarının oluşumunu inhibe etmek (knock-out fareler) ya da farmakolojik ile Panx1 kanal aktivitesini azaltarakindirgenmiş kolajen ile uyarılan platelet birikmesini ⁷ yaklaşır. Panx1 her yerde bulunan bir insan trombositleri ^{7, 8} de dahil olmak üzere bir çok hücre tipinde ifade edilir, ATP-salım kanalları oluşturur. İnsan inhibe çeşitli agonistlerin ilavesinden önce daha çok ya da daha az spesifik kimyasal blokerleri (probenesid, meflokin, ¹⁰ Panx1 peptitler) bir panelin bir 7 dakika ön inkübasyon, kolajen ile uyarılan bu yıkanmış plateletler üzerinde Aslında, bulanıklık derecesi gösterdi platelet agregasyon AA ve ADP trombosit tepkileri etkilenmemektedir. Biz Panx1 kanallardan ATP salma, kolajen ile uyarılan agregasyonuna yol açan GPVI sinyalleme yolağında müdahale olduğunu göstermiştir. İlginç bir şekilde, başka hastalıkların (probenesid, meflokin) uygulamaları ile birden çok FDA onaylı bileşikler trombositlerde Panx1 kanallarının aktivitesini etkiler. Bir yandan, bu seçmek için yeni terapötik perspektifler açıyoryanıtını verdiler trombosit reaktivitesi değiştirin. Öte yandan, bir bu bileşiklerin potansiyel ikincil etkilerini dikkate almalıdır. Bu bağlamda, güvenli gıda boyası Parlak Mavi FCF Panx1 ⁹ seçici bir inhibitörü olarak tarif edilmiştir birden fazla şeker ve enerji içecekleri kullanılır. Burada bir trombosit agregasyon antagonisti olarak Parlak Mavi FCF boya etkisini araştırmak üzere uyarlanmış insan yıkanmış trombositler ve trombosit agregasyon türbidimetrik ölçümleri izolasyonu için bir protokol açıklar.

Protokol

Beş ilgisiz sağlıklı gönüllüler trombosit izolasyon ve kümelenme testleri için kan örneği almak için alınmıştır. Yazılı onayları alınmıştır ve protokol Cenevre Üniversitesi Hastaneleri'nin Merkez Etik Komitesi tarafından onaylandı. sertifikalı Tüm gönüllüler sağlıklı olmak için ve deneyler öncesinde en az 10 gün boyunca herhangi bir trombosit müdahale ilaçları almamış etmek.

İnsan Kan Toplama 1. Tampon Hazırlama ve Yıkanmış Trombosit İzolasyonu

1. _{(Cı-6H 8} O ₇ • _H2O, 66.6 mM), 2.5 gr trisodyum sitrat dihidrat _{(Na3 C6 H5} 1.4 g sitrik asit monohidrat çözülmesiyle asit sitrat dektroz (CD) bir 100 ml sulu çözelti hazırlayın O ₇ • 2 _H2O, 85 mM) ve susuz D (+) 2 g - glikoz ihtiva eder. Çözeltinin pH değeri yaklaşık 4.5 olan.
2. Şöyle Tyrode tampon için stok çözelti hazırlayın
   1. , Nispi final konsantrasyon 2.73 M, 238 53.6 mM olan, 10 g NaHCC ₃ ve 0.58 g _{NaH2 4} * H damıtılmış _H2O 500 mL ₂ O 80 g NaCl, 2 g KCI çözülmesiyle stok çözelti hazırlayın 1 mM ve 8.4 mm. 4 ° C'de çözelti tutun.
   2. O 4 ° C'de çözüm tutun _H2 damıtılmış 500 ml içinde 10.15 g _MgCl2 x 6 _H2O (100 mM) eritilmesi ile stok solüsyonu 2 hazırlayın.
   3. 10.95 g O, 4 ° C 'de çözüm tutun ₂ O 500 ml damıtılmış _H2 (100 mM) _CaCl2 * 6H eritilerek stok çözelti 3 hazırlanır.
3. 136,5 mM NaCl, 2.68 mM KCI, nihai konsantrasyonlara karşılık gelir Bu damıtık _H2O ile 50 mL'lik bir son hacim içinde stok çözeltisi 1 2.5 mL seyreltilerek Tyrode tamponu hazırlayın 11.9 mM NaHCOj ₃ ve 0.42 mM _{NaH2? 4} * _H2O 7.35 pH ayarlamak ve 0.22 um f filtre edilerek sterilizeiltrelerini.
4. 5 ml stok çözeltisi 1 seyreltilmesi ile Tyrode albümin% 0.35 tamponu (TA tamponu ⁷⁾ hazırlanması, stok çözeltisi 2, 1 mL stok solüsyonu 3, 0.5 mL 1 M HEPES, 200 g / L, insan serum albümini, 1.8 ml 2 ml ve susuz D (+) 0.1 g - 100 mL'lik nihai bir hacim içinde glükoz damıtık _H2O
   1. 1 N HCI ile 7,35 pH ayarlama ve damıtılmış _H2O (toplam hacmin% 10) eklenmesi ile 295 mOsm / L ozmolarite ayarlayın. Bu çözelti içinde nihai konsantrasyonları şunlardır: 124 mM NaCI, 2.44 mM KCI, 10.82 mM NaHCOj _3, 0.38 mM _{NaH2? 4} * _H2O, 0.91 mM _MgCl2 x 6 _H2O, 1.82 mM _CaCl2 * 6 _H2O . tüm deney boyunca 37 ° C 'de TA tamponu tutun.

2. Kan Toplama

1. Con 50 ml tüplere, bir 19 G iğne ve bir ya da düşük turnike kullanılarak antekubital damardan, venöz kan 45-50 mL toplamak(Kan 6 hacim 1 hacim ACD) ettirilmesi ACD antikoagülan. trombin ve doku faktörü yok etmek için kan ilk 1-2 mL atın.
   1. Toplandıktan sonra yavaşça tersini tüp ACD ile kan karıştırın. 37 ° C'de 10 dakika boyunca örnek inkübe.

İnsan 3. Bileşik Trombositler Yıkanmış

1. 37 ° C'ye kadar santrifüj önceden ısıtın. Bütün santrifüjleme aşamaları aşağıda bu sıcaklıkta gerçekleştirilir.
2. 13 dakika PRP elde etmek için 250 x g'de 15 ml tüpler (tüp başına 5 mL) ve santrifüj toplanmış kan gönderir.
   Not: Örnek üç tabakadan üretimindeki bu santrifüjleme aşaması sonucu: 1) üst tabaka, plazma, trombositler oluşur ve beyaz kan hücrelerinin çok küçük bir bölümü. 2) ara tabaka, beyaz kan hücreleri açısından zengin bir bölümü. 3) esas olarak kırmızı kan hücrelerinden oluşur alt tabaka.
3. Üst la pipetleme PRP toplayınYer dikkatli bir şekilde maksimum kırmızı ve beyaz kan hücreleri ile kirlenmesini önlemek ve 37 ° C'de 10 dakika boyunca inkübasyona yeni bir 15 mL tüpe.
4. (5 ml PRP) 12 dakika boyunca 2200 x g'de PRP santrifüjleyin.
   NOT: Bu santrifüj aşaması düşük frenle veya frensiz yapılmalıdır.
5. Süpernatant (trombosit bakımından fakir plazma) çıkarın ve dikkatli bir şekilde bir plastik pastör pipeti kullanılarak, heparin 2 uL / mL içeren ta tamponu, 10 mL (5000 U / ml) ve 25 uM _PGI2 2.5 uL / mL pelletini. 37 ° C'de 10 dakika süreyle inkübe edilir.
6. (Düşük fren veya fren olmadan) 1,900 x g'de 8 dakika boyunca 25 uM _PGI2 ve santrifüj 2.5 uL / mL ekleyin.
7. Süpernatantı ve bir plastik pastör pipeti kullanılarak 25 uM _PGI2 2.5 uL / mL içeren 5 ml ta tamponu ile pelletini. 37 ° C'de 10 dakika süreyle inkübe edilir.
8. İnkübasyon sırasında, trombosit süspansiyonu 150 uL pipetleyinve 1.5 ml tüp otomatize hücre sayacı (bu doğru akım direnci değişiklikleri ölçerek kan hücrelerinin boyutunu tespit eder) kullanılarak, trombositler sayısı.
9. 10 dakika inkübasyondan sonra, trombosit süspansiyonuna 25 uM _PGI2 2.5 uL / mL eklemek ve hemen sonra 8 dakika boyunca 1.900 x g'de santrifüj.
10. Süpernatantı ve ta tamponu yeterli bir hacmi ile 250.000 trombosit / uL bir konsantrasyona pelletini U 0.01 apiraz 32 uL / mL ihtiva eden (hücre sayısı uL 500.000, 10 ml ta tamponu içinde tekrar süspansiyon yani ise) / ml (son konsantrasyon, 0.32 U / ml).
    Not: apiraz yüksek konsantrasyonu agonistleri yokluğunda, ATP ^{10, 11} kendiliğinden salgılanmasıyla oluşan P2X1 reseptörlerinin desensitizasyon önlemek için kullanılır. Kollajen ile indüklenen tepkileri hızlı parakrin ile uyarılmaktadır Bu önemlidir, çünkü / ATP tarafından P2X1 otokrin aktivasyon fr yayımlananom trombosit aktive. trombosit sinyal yolu kritik P2X1 fonksiyonunun korunmasına gerektirmez ise, 0.02 U / ml apiraz kullanın. (Mahaut-Smith ve ark., ¹⁰ gözden) çeşitli çalışmalar 0.02 U / ml apiraz ihmal edilebilir P2X1 yanıtlarla ADP reseptör P2Y1 duyarsızlaştırma engellediğini göstermiştir.
11. aggregometric ölçümleri yapılmadan önce, 37 ° C'de en az 30 dakika boyunca bir hücre süspansiyonu inkübe edin. Hazırlama 5 ile 8 saat boyunca stabildir.

4. agregometri

1. Tyrode tampon içinde fibrinojen (56 mg / ml) hazırlayın.
2. Cam küvet içine trombosit süspansiyonu pipetleyin 260 uL (Şekil 1A, sol küvet) - bekletme oyuklarında, bu 37 ° C 'de 3 dakika 10 fibrinojen uL (56 mg / ml) ve bir manyetik karıştırma çubuğu içeren, daha sonra 2 süspansiyonu inkübe agregometre (Şekil 1B ve 1C) içinde.
3. Panx1 ile önceden kuluçkayaönleyicisi Parlak Mavi ÜİT 37 ° C 'de, 7 dakika için 2.8 mM veya 28 mM stok çözeltisi (nihai konsantrasyon 100 uM ve 1 sırasıyla mM), 10 uL eklenmesiyle gerçekleştirilebilir.
4. 10 uL fibrinojen (56 mg / ml), trombositler olmadan 10 uL Parlak Mavi FCF (2.8 mM veya 28 mM) ve TA tamponu ihtiva eden bir küvete OD'si ölçülerek, bir varsayımsal% 100 agregasyon değerine agregometre kalibre edin.
   1. Bir toplama de altında otomatik olarak karıştırıldı küvet yerleştirilir ve (agregasyon da 1 kullanılırsa, örneğin, pres F1) agregometrede bağlantılı bilgisayarın klavyesi karşılık gelen düğmesine basın.
      NOT: Aşağıda açıklanan Bu deney Parlak Mavi ÜİT içerir. Kalibrasyon için kullanılan bileşik deney koşulu için ayarlanmalıdır.
5. Otomatik karıştırma altında deney için kullanılacak olan aynı trombosit örnek kullanarak, bir varsayımsal% 0 agregasyon değerine agregometre kalibreg.
   1. İyi bir araya getirilmesinde küvet koyun ve agregometre bağlantılı bilgisayarın klavyesinde karşılık gelen düğmeye basın. Devam etmeden önce yaklaşık 20-30 sn bekleyin. Bu gecikme hiçbir toplama agonistleri eklemeden önce olur sağlamak için hizmet vermektedir.
      Not: trombosit sayısında herhangi bir fark ölçülen OD üzerinde bir etkiye sahip gibi,% 0 kalibrasyon adımı, her bir ölçüm için tekrar edilmesi gerekmektedir.
6. küvet içine, (75 uM son), araşidonik asidin arzu edilen agonist 20 uL, örneğin 15 ug / ml kolajen (1 ug / mL nihai) ya da 1.125 mM ekleyin. Hemen agregometrede bağlantılı bilgisayarın klavyesi karşılık gelen düğmeye basarak sürekli otomatik karıştırma altında kayıt başlar.
   Not: agonist ilave trombosit aktivasyonuna yol açar. Trombosit agregalar açık deneyde (Şekil 1A sonunda cam küvet içinde ayırt edilebilir; Right küvet).
7. kayıt otomatik 6 dakika sonra durur. Bu noktada, bilgisayarın tasarruf simgesine tıklayarak verileri kaydetmek.
   Not: agregasyon hızının hesaplanması yüzdesi olarak kümelenme işlemi uç sonuçlar ifade bilgisayar tarafından gerçekleştirilir.
8. Verileri analiz edin.
   1. Yıkanmış trombositler süspansiyonlar ve trombosit agregasyonunun türbidimetrik ölçüm hazırlanması için protokoller ek detaylı bilgi için bu alanda ^{12, 13,} uzmanlar tarafından kaleme diğer kağıtlar bakın.

Sonuçlar

agregasyonu yazılım otomatik agregasyon eğri oluşturur ve yüzde olarak maksimum agregasyon değerlerini vermektedir. değerleri istatistiksel analiz ve çubuk grafikler halinde maksimum toplanma değerleri görselleştirmek için bir veri analiz yazılımı kopyalanabilir. İsteğe bağlı olarak, toplama eğrileri her bir nokta eğrileri görselleştirmek için bir tablo yazılımı içine ve daha sonra istatistiksel yazılım (örneğin, GraphPad) art arda verilebilir. Ba...

Tartışmalar

Kanama riskini artıran olmadan tromboz önlemek amacıyla trombosit fonksiyonunu modüle edebilen yeni ilaç bulmakta büyük bir ilgi vardır. Bu amaç için, güvenilir ve tekrarlanabilir bir insan plateletlerinde agregasyon karşılıklarının izlenmesi için, in vitro laboratuar testleri kesinlikle gereklidir. Bulanıklık agregometri gerçekleştirmek için kolay bir tekniktir. Ancak, bazı önlemler unutulmaması gerekir. toplama işlemi karıştırıldıktan büyük ölçüde bağımlı olduğu gibi ö...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
citric acid monohydrate (C6H8O7*H2O)	Roth	5949-29-1	danger of eye damage/irritation
trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7*2H2O)	Sigma-Aldrich	S1804	-
D(+)-glucose	Sigma-Aldrich	G8270	-
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	-
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	-
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6014	-
Sodium dihydrogenophosphate monohydrate (NaH2PO4*H2O)	Sigma-Aldrich	S9638	-
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2*6H2O)	Sigma-Aldrich	M9272	-
Calcium chloride hexahydrate (CaCl2*6H2O)	Sigma-Aldrich	442909	danger of eye damage/irritation
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (Hepes)	ThermoFisher Scientific	15630	-
human serum albumin	CSL Behring	00257/374	-
hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	320331	Corrosive and irritative for the respiratory system. Can cause severe skin and eye damages.
Eppendorf 5810 R	Fisher Scientific	-	-
heparin	Drosspharm AG/SA	20810
prostacyclin I2 (PGI2)	Cayman	18220	-
apyrase from potatoes	Sigma-Aldrich	A6535	-
fibrinogen (Haemocomplettan)	CSL Behring	HS 73466011	-
thrombo-aggragometer SD-Medical	SD-Innovation	TA8V	-
Brilliant blue FCF (Erioglaucine disodium salt)	Sigma-Aldrich	80717	Harmful to aquatic life with long lasting effects (Avoid release to the environnement)
collagen	Horm, Nycomed		-
arachidonic acid	Bio/Data corporation	C/N 101297	-
cell counter Sysmex KX-21N	Sysmex Digitana	-	-
HEPES	Gibco	15630-056	-
glass cuvettes	SD-Innovation	THCV1000	-
magnetic stirrers	SD-Innovation	THA100	-