コラーゲン誘発凝集に対するPannexin1阻害剤の効果ブリリアントブルーFCF：比濁法は、人間に洗浄血小板を

要約

我々は、比濁法によるアゴニスト誘導性血小板凝集の測定に続いてヒト血液からの洗浄した血小板を単離するための簡単な方法を記載します。一例として、我々は、ブリリアントブルーFCF Pannexin1チャネル阻害剤とのプレインキュベーション後にコラーゲンをヒト血小板の凝集応答を研究するため、この方法を適用します。

要約

濁度は、1つの使用またはアゴニストの組み合わせにより、血漿（多血小板血漿、PRP）又は緩衝液（洗浄血小板）のいずれかに懸濁した血小板の凝集を測定するために適用される実験室技術です。洗浄血小板の使用は、そのプラズマ環境から分離し、抗凝固剤の不存在下で固有の血小板の性質を研究することができます。アゴニストの大型パネル、アラキドン酸（AA）のうち、アデノシン二リン酸（ADP）、トロンビンおよびコラーゲンは、最も頻繁に使用されます。凝集反応は、連続撹拌下で血小板懸濁液の経時的な相対光学密度（OD）を測定することによって定量化されます。均質な懸濁液中の血小板は、アゴニストの添加後の光の通過を制限し、血小板の形状の変化はODの小さな一時的な増加を生成生じます。この最初の活性化段階に続いて、血小板血栓は、RES、懸濁液を通る光の通過を可能にし、徐々に形成します減少したODのULT。凝集プロセスは、最終的に血小板に乏しい血漿または緩衝液のODと比較し、パーセンテージとして表現されます。厳格なキャリブレーションは、各実験の開始時にこれが不可欠です。 0％に較正ない血小板を含まない懸濁媒体のODを測定しながら、非刺激血小板懸濁液のODを測定することによって設定された100％の値を表す：一般的なルールは次のように。血小板凝集は、一般的にリアルタイム集計曲線として可視化されます。比濁法は、血小板機能の調査のための最も一般的に使用される実験技術の一つであり、歴史的なゴールドスタンダードとみなされ、血小板凝集を阻害することを目的とし、新たな医薬品の開発に使用されます。ここでは、人間の準備が血小板を洗浄し、2）人間のコラーゲン誘発凝集の比濁分析は、最近のiDENた食用色素ブリリアントブルーFCFで前処理した血小板を洗浄し、1）詳細なプロトコルを記述しますPannexin1（Panx1）チャネルの阻害剤としてtified。

概要

血小板は血液や血管損傷後の出血を止めるために凝固-ある要因とその主な機能は、一緒の重要なコンポーネントです。血小板は、骨髄¹の巨核球に由来する小さな（2-3μm）の無核の断片です。血小板は、その間にそれらがレンズ状構造として現れる、非活性状態で循環します。内皮の中断時には、血小板は穴、一次止血と呼ばれるプロセスをプラグインする血管損傷部位に集まります。最初に、血小板は損傷接着ステップ²の結果として公開され、コラーゲンおよびフォンビルブラント因子としてサブ内皮分子に取り付けます。その後、彼らは形状を変更し、化学的メッセンジャー活性化工程を分泌します。最後に、彼らは、受容体 - 凝集工程をブリッジによって互いに接続されています。一次止血を安定化フィブリン沈着と凝固カスケードの活性化を含む二工程、続いて初期血栓²よ。

例えば心筋梗塞³などの急性虚血性イベントは、しばしばアテローム硬化性プラークの物理的破壊（破裂）の形態血栓に起因します。現在の抗血小板薬は、この広範囲の疾患の治療の基礎ですが、その臨床的有用性は、出血のリスクの増大によって制限されています。心血管患者、アスピリンや抗P2Y12化合物の中で最も処方薬は、トロンボキサンA2および血小板の活性化につながる主要な経路は、それぞれ、ADP経路^4を 、ターゲットにしています。しかし、最適な抗血栓効果と出血性リスクのバランスを取るだろう新たな目標に向けた革新的な研究は依然として必要です。

1960 ⁵から今日まで、比濁凝集は、血小板反応性と私の知識を高め、研究に重要な役割を果たしてきましたヒトにおける抗血栓剤の効力のモニタリングをNです。濁度測定は、最初の血液サンプルから抽出されたPRPに適用しました。確かに、クエン酸を含むチューブで行われる採血は、血小板の完全性と機能上の任意の影響を与えることなく、PRPの迅速かつ大規模な生産を可能にします。しかし、PRPとトロンビンのような残りの血漿酵素の短期安定性（約3時間）、そして潜在的に人為的凝集プロファイルに関連付けられた低カルシウム濃度は、PRPの使用のための主要な不便です。重要な前進は、追加の遠心分離および洗浄工程⁶と血小板の単離のための方法の開発でした。等浸透圧リン酸バッファー（タイロード緩衝液）を含むグルコース、ヒト血清アルブミン及び二価のC中に再懸濁される前に要するに、PRPは、酸 - クエン酸塩 - デキストロース（ACD）に採取した全血から単離され、血小板がシリアル遠心分離工程の後に単離されますations（のCa ²⁺およびMg ^2+）。血小板反応性の変化を避けるために、タイロード緩衝液のpHは7.35から7.4に慎重に保たれています。また、血小板の望ましくない活性化は、いくつかの遠心分離工程の前にプロスタサイクリン（PGI _2）を添加することによって防止されます。最後に、アピラーゼの添加は、ATP / ADPの作用に対して耐性になってからの洗浄血小板を防止します。得られた血小板懸濁液は、凝固因子を欠き、PRPソリューションと比較して、血小板の安定性は少なくとも2倍増加します。血小板が比濁測定の再現性不活性であるが、無傷のワラントであり、最適な方法での血小板凝集のアゴニストまたはアンタゴニストの作用を研究する能力を提供することに加えて、実際。

この方法を使用して、我々は、遺伝的アプローチ（ノックアウトマウス）でPanx1チャネルの形成を阻害または薬理学的によりPanx1チャネル活性を低下させることが最近の研究で示されました減少したコラーゲン誘発血小板凝集^7に近づきます。 Panx1は遍在ヒト血小板^7、8を含む多くの細胞型において発現されるATP放出チャネルを形成します。ヒト阻害種々のアゴニストの添加に先立って多かれ少なかれ特定の化学ブロッカー（プロベネシド、メフロキン及び^10の Panx1ペプチド）のパネルとの7分間のプレインキュベーションは、具体的にはコラーゲン誘発こと血小板を洗浄に実際に、我々は、比濁法によって実証しました血小板凝集AAおよびADPへの血小板応答は影響を受けなかった一方で。私たちは、Panx1のチャネルを通じてATP放出は、特にコラーゲン誘発凝集につながるGPVIのシグナル伝達経路に干渉することを実証しました。興味深いことに、他の疾患（プロベネシド、メフロキン）中のアプリケーションと複数FDA承認化合物は、血小板におけるPanx1チャネルの活性に影響を与えます。一方で、これは、選択するために新たな治療展望を開きますively血小板反応性を修正します。一方、1は、これらの化合物の潜在的な二次的影響を考慮する必要があります。この文脈では、安全な食品染料ブリリアントブルーFCFはPanx1 ⁹の選択的阻害剤として記載されている複数のキャンディーやエネルギードリンクに使用します。ここでは、血小板凝集のアンタゴニストとしてブリリアントブルーFCF色素の効果を調査するために適合され、ヒト洗浄血小板および血小板凝集の比濁測定を単離するためのプロトコルを記述しています。

プロトコル

ファイブ無関係な人の健康なボランティアは、血小板の分離・凝集試験のための血液採取のために募集されました。書面によるインフォームドコンセントを得て、プロトコルは、ジュネーブ大学病院の中央倫理委員会によって承認されました。すべてのボランティアは、健康であることを認定し、実験の前に、少なくとも10日の間に任意の血小板薬の干渉を受けていないし。

ヒト血液収集し、洗浄血小板の単離1.バッファーの調製

1. （C ₆ H ₈ O _{7•H 2} O、66.6ミリモル）、2.5グラムのクエン酸三ナトリウム二水和物（のNa ₃ C ₆ H ₅ 1.4グラムのクエン酸一水和物を溶解することにより、酸-クエン酸-デキストロース（ACD）の100mLの水溶液を調製_7•2 O、H ₂ O、85ミリモル）及び無水D（+）を2g -グルコース。溶液のpHは約4.5です。
2. 次のようにタイロードバッファのためのストック溶液を準備します
   1. それぞれの最終濃度は2.73 M、238 53.6 mmであり、10グラムのNaHCO ₃および0.58グラムのNaH ₂ PO _4・Hを蒸留H ₂ O 500mLの₂ O 80グラムのNaCl、2グラムのKClを溶解させてストック溶液1を調製MMおよび8.4 mMの。 4℃で溶液を保管してください。
   2. H ₂ Oを500mlの蒸留で10.15グラムの_塩化マグネシウム・6 H ₂ O（100ミリモル）を溶解させてストック溶液2を調製し、4℃で溶液を維持。
   3. H ₂ Oを500mlの蒸留で10.95グラム（100ミリモル）のCaCl _2・6 H ₂ Oに溶解させてストック溶液3を調製し、4℃で溶液を維持。
3. これは136.5のNaCl、2.68ミリモルのKCl、11.9 mMのNaHCO ₃および0.42ミリモルのNaH ₂ PO _4×の最終濃度に対応し、蒸留H ₂ Oで50mlの最終体積に原液1の2.5 mLで希釈することによりタイロード緩衝液を調製H ₂ Oは7.35のpHを調整し、0.22μmのFで濾過することによって滅菌しますilters。
4. 、原液1を5mLに希釈することによってタイロードアルブミン0.35％緩衝液（TAバッファー^7）を調製1のストック溶液2 mLの、2ストック溶液3、0.5mLの1M HEPES mLの、200グラム/ Lの1.8 mLのヒト血清アルブミンと無水D（+）0.1gの- 100 mLの最終容積中のグルコースの蒸留H ₂ O.
   1. 1N HClで7.35にpHを調整し、蒸留H ₂ O（全容量の10％）を添加することにより295ミリオスモル/ Lの浸透圧を設定します。この溶液の最終濃度は：124のNaCl、2.44ミリモルのKCl、10.82ミリモルのNaHCO _3、0.38ミリモルのNaH ₂ PO ₄ *のH ₂ O、0.91ミリモルのMgCl _2・6 H ₂ O、1.82ミリモルのCaCl _2・6 H ₂ O 。全実験中、37℃でTAバッファーを維持。

2.採血

1. CON 50mLのチューブに、19 G針なしまたは低止血帯を使用して、肘前静脈から、静脈血の45~50ミリリットルを集めます（血液の6つのボリュームの1つの体積ACD）taining ACD抗凝固剤。トロンビンおよび組織因子の存在を回避するために、血液の最初の1~2ミリリットルを廃棄します。
   1. 収集した後、チューブを静かに反転させることによってACDで血液を混ぜます。 37℃で10分間、試料をインキュベートします。

ヒトの調製は、血小板を洗浄しました

1. 37°Cに遠心分離機を予備加熱します。すべての遠心分離工程は、以下のこの温度で実行されています。
2. PRPを得るために、13分間、250×gで15 mLチューブ（チューブ当たり5 mL）に溶解し、遠心分離に採取した血液を送出します。
   注：サンプル中の3層の製造におけるこの遠心分離工程の結果：1）上部膜、血漿、血小板から構成され、白血球細胞の小画分。 2）中間層、白血球に富んだ部分。 3）本質的に赤血球から構成されている底部層、。
3. アッパー・ラ・ピペッティングによりPRPを収集ヤー注意深く新しい15mL試験管に最大限赤血球および白血球による汚染を防ぐため、37℃で10分間インキュベートします。
4. 遠心分離（5 mLのPRP用）12分間、2,200×gでPRP。
   注：この遠心分離工程は、ローブレーキまたはブレーキなしで実行する必要があります。
5. 上清（血小板貧血漿）を取り外し、そして注意深くヘパリンの2μL/ mLを含むTA緩衝液10ml（5,000 U / mL）およびプラスチック製パスツールピペットを用いて、25μMのPGI ₂の2.5μL/ mLでペレットを再懸濁します。 37℃で10分間インキュベートします。
6. （ローブレーキまたはブレーキなし）1,900×gで8分間、25μMPGI ₂及び遠心分離機の2.5μL/ mLを加え。
7. 上清を除去し、プラスチック製パスツールピペットを用いて、25μMのPGI ₂の2.5μL/ mLを含む5mLのTAバッファーでペレットを再懸濁します。 37℃で10分間インキュベートします。
8. インキュベーション期間中に血小板懸濁液の150μLをピペット1.5mlチューブへと自動化細胞カウンター（すなわち、直流抵抗の変化を測定することによって血球の大きさを検出する）を使用して、血小板を数えます。
9. 10分間のインキュベーション後、血小板懸濁液に25μMPGI ₂の2.5μL/ mLを加え、すぐに8分間、1,900×gで遠心します。
10. （細胞数は、10 mLのTAバッファーに再懸濁μL500,000であればIE）0.01 Uでアピラーゼの32μL/ mLを含む上清を除去し、TAバッファーの十分な量と25万血小板/μLの濃度にペレットを再懸濁/ mLの（最終濃度0.32 U / mL）を添加しました。
    注：アピラーゼの高濃度は、アゴニストの非存在下でATP ^10,11の自発的分泌により誘発されるP2X1受容体の脱感作を回避するために使用されます。コラーゲン誘発性応答が速いパラクリンによって誘導されるため、これは重要です/ ATPによるP2X1の自己分泌活性化は、FRをリリースOMは、血小板を活性化しました。血小板シグナル伝達経路は決定的P2X1機能の保存を必要としない場合は、0.02 U / mLのアピラーゼを使用します。 （Mahaut-Smith ら ¹⁰に概説）いくつかの研究は、0.02 U / mLのアピラーゼは無視できるP2X1応答を持つADP受容体P2Y1脱感作を回避することを実証しました。
11. aggregometric測定を行う前に、37℃で少なくとも30分間細胞懸濁液をインキュベートします。製剤は、5〜8時間安定です。

4.凝集

1. タイロード緩衝液中のフィブリノーゲン（56ミリグラム/ ml）を調製します。
2. ピペット260ガラスキュベットに血小板懸濁液のμL（ 図1A、左キュベット）、次いで2ための懸濁液をインキュベートし、10フィブリノーゲンのμL（56ミリグラム/ mL）および磁気攪拌棒を含有する-本培養ウェル中で37℃で3分間凝集（ 図1Bおよび1C）です。
3. Panx1と事前インキュベート37℃で7分間、2.8 mm以上28 mMのストック溶液（各々の最終濃度100μMおよび1mM）の10μLを添加することにより、ブリリアントブルーFCFを阻害。
4. 10μLのフィブリノーゲン（56 mg / mlと）、血小板ずに10μLブリリアントブルーFCF（2.8 mm以上28 mm）でTA緩衝液を含むキュベットのODを測定することによって仮定100％凝集値に凝集計を較正します。
   1. （凝集ウェル1が使用される場合、すなわちプレスF1）だけでなく、自動攪拌しながら凝集キュベットを配置し、凝集に連結されたコンピュータのキーボード上の対応するボタンを押します。
      注：以下に示す。この実験は、ブリリアントブルーFCFを含んでいます。キャリブレーションのために使用される化合物は、実験条件に調整されなければなりません。
5. 自動stirrin下の実験のために使用される同一の血小板試料を使用して、仮定0％凝集値に凝集計を校正グラム。
   1. うまく集約にキュベットを置き、血小板凝集計に接続されたコンピュータのキーボード上の対応するボタンを押してください。先に進む前に、約20〜30秒待ちます。この遅延は全く凝集がアゴニストを添加する前に起こらないことを保証するのに役立ちます。
      注：血小板数の差を測定ODに影響を与えることができるように、0％校正ステップは、個々の測定のために繰り返される必要があります。
6. キュベットに、例えば15 / mlのコラーゲン（最終的に1μg/ ml）または1.125 mMのアラキドン酸（最終75μM）として、所望のアゴニストの20μLを加えます。直ちに凝集に連結されたコンピュータのキーボード上の対応するボタンを押すことによって、連続的に自動撹拌しながら記録を開始。
   注：アゴニストの添加は血小板の活性化を誘導します。血小板凝集は、明らかに実験（ 図1Aの終了時にガラスキュベットに区別することができる。RIGHTキュベット）。
7. 自動的に録音が6分後に停止します。この時点で、コンピュータの保存アイコンをクリックしてデータを保存します。
   注：凝集速度の計算は、パーセンテージとして凝集プロセスの最終結果を表すコンピュータにより実行されます。
8. データを分析します。
   1. 洗浄した血小板懸濁液および血小板凝集の濁度測定を調製するためのプロトコルの追加広範な情報のために、フィールド^12、13の専門家によって作成他の論文を参照。

結果

凝集ソフトウェアが自動的に集計曲線を生成し、パーセンテージで最大凝集のための値を示します。値は、統計的な分析を行い、棒グラフの形で最大凝集値を視覚化するために、データ解析ソフトにコピーすることができます。任意に、凝集曲線の各個々の点が曲線を可視化するために、表計算ソフトにした後、統計ソフトウェア（ 例えば、グラフパッド）に...

ディスカッション

出血のリスクを高めることなく、血栓症を防ぐために、血小板機能を調節することができる新薬の発見に大きな関心が寄せられています。この目的のために、確実かつ再現ヒト血小板に集約応答を監視することができin vitroの実験室でのテストは絶対に必要です。比濁凝集を行うための簡単なテクニックです。しかし、いくつかの注意が念頭に置いておく必要があります。測定は、凝?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
citric acid monohydrate (C6H8O7*H2O)	Roth	5949-29-1	danger of eye damage/irritation
trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7*2H2O)	Sigma-Aldrich	S1804	-
D(+)-glucose	Sigma-Aldrich	G8270	-
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	-
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	-
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6014	-
Sodium dihydrogenophosphate monohydrate (NaH2PO4*H2O)	Sigma-Aldrich	S9638	-
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2*6H2O)	Sigma-Aldrich	M9272	-
Calcium chloride hexahydrate (CaCl2*6H2O)	Sigma-Aldrich	442909	danger of eye damage/irritation
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (Hepes)	ThermoFisher Scientific	15630	-
human serum albumin	CSL Behring	00257/374	-
hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	320331	Corrosive and irritative for the respiratory system. Can cause severe skin and eye damages.
Eppendorf 5810 R	Fisher Scientific	-	-
heparin	Drosspharm AG/SA	20810
prostacyclin I2 (PGI2)	Cayman	18220	-
apyrase from potatoes	Sigma-Aldrich	A6535	-
fibrinogen (Haemocomplettan)	CSL Behring	HS 73466011	-
thrombo-aggragometer SD-Medical	SD-Innovation	TA8V	-
Brilliant blue FCF (Erioglaucine disodium salt)	Sigma-Aldrich	80717	Harmful to aquatic life with long lasting effects (Avoid release to the environnement)
collagen	Horm, Nycomed		-
arachidonic acid	Bio/Data corporation	C/N 101297	-
cell counter Sysmex KX-21N	Sysmex Digitana	-	-
HEPES	Gibco	15630-056	-
glass cuvettes	SD-Innovation	THCV1000	-
magnetic stirrers	SD-Innovation	THA100	-