Turbidimetria su Human Lavato Piastrine: l'effetto della Pannexin1-inibitore blu brillante FCF sul livello di aggregazione indotta dal collagene

Riepilogo

Descriviamo un metodo semplice per l'isolamento di piastrine lavate dal sangue umano seguita da agonista indotta misurazioni aggregazione piastrinica turbidimetria. A titolo di esempio applichiamo questo metodo per lo studio della risposta di aggregazione delle piastrine umane al collagene dopo un pre-incubazione con l'inibitore del canale Pannexin1 blu brillante FCF.

Abstract

Turbidimetria è una tecnica di laboratorio che viene applicata per misurare l'aggregazione delle piastrine sospese in entrambi plasma (plasma ricco di piastrine, PRP) o in tampone (piastrine lavate), mediante l'uso di uno o una combinazione di agonisti. L'uso di piastrine lavate separati dal loro ambiente plasma e in assenza di anticoagulanti consente di studiare le proprietà intrinseche delle piastrine. Tra il grande pannello di agonisti, acido arachidonico (AA), adenosina di-fosfato (ADP), trombina e collagene sono i più usati. La risposta di aggregazione viene quantificato misurando la densità ottica relativa (OD) nel tempo di sospensione di piastrine sotto continua agitazione. Piastrine in sospensione omogenea limitano il passaggio della luce dopo l'aggiunta di un agonista, piastrinico cambiamento forma verifica produrre un piccolo aumento transitorio in OD. A seguito di questa fase di attivazione iniziale, trombi piastrinici formano gradualmente, permettendo il passaggio della luce attraverso la sospensione come result di diminuita OD. Il processo di aggregazione è infine espresso in percentuale, rispetto alla densità ottica del plasma povero di piastrine o tampone. calibratura rigorosa è quindi essenziale all'inizio di ogni esperimento. Come regola generale: taratura 0% è impostato misurando la densità ottica di una sospensione non stimolata piastrine mentre si misura la densità ottica del mezzo di sospensione non contenente piastrine rappresenta un valore del 100%. L'aggregazione piastrinica è generalmente visualizzato come una curva di aggregazione in tempo reale. Turbidimetria è una delle tecniche di laboratorio più comunemente usati per lo studio della funzione piastrinica ed è considerato come il gold standard storico e utilizzato per lo sviluppo di nuovi agenti farmaceutici volti a inibire l'aggregazione piastrinica. Qui, descriviamo protocolli dettagliati per 1) preparazione di umana lavato piastrine e 2) analisi turbidimetrica di aggregazione indotta da collagene di umana lavato piastrine pretrattato con il colorante alimentare blu brillante FCF che è stato recentemente identificata come inibitore di Pannexin1 canali (Panx1).

Introduzione

Le piastrine sono componenti cruciali del sangue e la loro funzione, insieme a fattori di coagulazione-è quello di fermare l'emorragia dopo la lesione dei vasi sanguigni. Le piastrine sono piccoli frammenti (2-3 micron) anuclear derivate da megacariociti del midollo osseo ^1. Piastrine circolano in stato non attivato, durante i quali appaiono come strutture lenticolari. Su interruzione della endotelio, piastrine si riuniscono per il sito di lesione dei vasi sanguigni per tappare il buco, un processo chiamato emostasi primaria. Inizialmente, piastrine attaccano alle molecole sub-endoteliale, quali il collagene e fattore di von Willebrand, che sono esposti a seguito della fase di lesione aderenza ^2. Poi, cambiano forma e secernono passo messaggeri-attivazione chimica. Infine, si collegano tra loro da colmare passo recettori-aggregazione. dell'emostasi primaria è seguita da un processo secondario che coinvolge l'attivazione della cascata coagulativa con deposizione di fibrina, che stabilizzanos trombo iniziale ^2.

Eventi ischemici acuti quali infarto miocardico ³ spesso il risultato di trombi che si formano a causa di interruzione fisica (rottura) di una placca aterosclerotica. farmaci anti-piastrinici attuali sono la pietra angolare del trattamento di questa malattia molto diffusa, ma il loro beneficio clinico è limitato da un aumentato rischio di sanguinamento. I farmaci più prescritti in pazienti cardiovascolare, composti aspirina e anti-P2Y12, indirizzare il trombossano A2 e le vie ADP ^4, rispettivamente, che sono le principali vie che portano all'attivazione piastrinica. Tuttavia, la ricerca innovativa verso nuovi obiettivi che in modo ottimale bilanciare gli effetti antitrombotici e il rischio emorragico è ancora necessario.

Dal 1960 ad oggi ^5, aggregometria turbidimetrico ha svolto un ruolo cruciale nella ricerca, migliorare la nostra conoscenza della reattività piastrinica ed ion per il monitoraggio della potenza di reagenti anti-trombotici nell'uomo. Turbidimetria stata inizialmente applicata a PRP estratto da campioni di sangue. Infatti, la raccolta del sangue eseguita in provette contenenti citrato permette una produzione rapida e grande di PRP senza avere alcun effetto sulla integrità e la funzionalità piastrinica. Tuttavia, la stabilità a breve termine (circa 3 h) PRP e le restanti enzimi plasmatici, quali trombina, e la bassa concentrazione di calcio associato con un profilo di aggregazione potenzialmente artefattuali sono di gravi inconvenienti per l'uso di PRP. Un importante passo avanti è stato lo sviluppo di un metodo per l'isolamento delle piastrine con centrifugazione e lavaggio passi ⁶ supplementare. In breve, PRP è isolato dal sangue intero raccolto in acido citrato destrosio (ACD) e le piastrine sono isolati dopo le fasi di centrifugazione seriale prima di essere risospese in un tampone iso-osmotica fosfato (tampone di Tyrode) contenente glucosio, albumina di siero umano e bivalente cni (Ca ²⁺ e Mg ^2+). Per evitare variazioni di reattività piastrinica, il pH del tampone di Tyrode è attentamente mantenuta a 7,35-7,4. Inoltre, l'attivazione indesiderata di piastrine è impedito aggiungendo prostaciclina (PGI ₂₎ prima di alcune fasi di centrifugazione. Infine, l'aggiunta di apyrase impedisce piastrine lavate di diventare resistente contro l'azione di ATP / ADP. La sospensione di piastrine risultante manca di fattori coagulanti e la stabilità delle piastrine è aumentata di almeno due volte rispetto alle soluzioni PRP. Inoltre, il fatto che le piastrine sono mandati inattive ma intatti riproducibilità delle misurazioni turbidimetriche e fornisce la possibilità di studiare l'azione di agonisti o antagonisti di aggregazione piastrinica in modo ottimale.

Usando questo metodo, abbiamo dimostrato in un recente studio che inibendo la formazione di canali Panx1 da un approccio genetico (knock-out topi) o diminuendo canale attività Panx1 da farmacologicaapprocci ridotta aggregazione piastrinica indotta da collagene ^7. Panx1 forma canali ATP-rilascio, che sono ubiquitariamente espressi in molti tipi di cellule inclusi piastrine umane ^{7, 8.} Infatti, abbiamo dimostrato mediante turbidimetria su umano lavato piastrine che un 7 min preincubazione con un pannello di bloccanti più o meno specifici chimici (probenecid, meflochina e ¹⁰ peptidi Panx1) prima della aggiunta di vari agonisti, inibito specificamente collagene-indotta aggregazione piastrinica mentre le risposte alle piastrine AA e ADP non sono stati influenzati. Abbiamo dimostrato che l'ATP rilascio attraverso canali Panx1 interferisce in modo specifico nella via di segnalazione che porta alla GPVI aggregazione indotta da collagene. È interessante notare che, più composti FDA ha approvato con applicazioni in altre malattie (probenecid, meflochina) influenzano l'attività dei canali Panx1 in piastrine. Da un lato, questo apre nuove prospettive terapeutiche per selezionaretivamente modificare reattività piastrinica. D'altra parte, si dovrebbe prendere in considerazione i potenziali effetti secondari di questi composti. In questo contesto, il colorante alimentare sicuro Blu Brillante FCF utilizzato in più caramelle e bevande energetiche è stato descritto come un inibitore selettivo di Panx1 ^9. Descriviamo qui un protocollo per l'isolamento di piastrine lavate umani e misurazioni turbidimetrici dell'aggregazione piastrinica adattato per investigare l'effetto del colorante blu brillante FCF come antagonista di aggregazione piastrinica.

Protocollo

Cinque volontari sani non imparentati sono stati reclutati per il prelievo di sangue per le prove di isolamento e l'aggregazione piastrinica. consenso informato scritto è stato ottenuto e il protocollo è stato approvato dal Comitato Etico Centrale delle ospedali universitari ginevrini. Tutti i volontari certificati per essere sani e di non hanno preso tutte le droghe piastrine-interferire durante almeno i 10 giorni precedenti esperimenti.

1. Buffer Preparazione per la Raccolta Sangue umano e isolamento piastrinico Lavato

1. Preparare una soluzione acquosa di 100 mL di acido-citrato-destrosio (ACD) sciogliendo 1,4 g acido citrico monoidrato (C ₆ H ₈ O ₇ • H ₂ O, 66,6 mM), 2,5 g di trisodio citrato diidrato (Na ₃ C ₆ H ₅ O ₇ • 2 H ₂ O, 85 mm) e 2 g di D anidro (+) - glucosio. Il pH della soluzione è circa 4,5.
2. Preparare soluzioni per il buffer di Tyrode come segue
   1. Preparare soluzione stock 1 sciogliendo 80 g di NaCl, KCl 2 g, 10 g NaHCO ₃ e 0,58 g di NaH ₂ PO ₄ * H ₂ O in 500 ml di H _{2 O} distillata O. Le rispettive concentrazioni finali sono 2,73 M, 53,6 mM, 238 mM e 8,4 mM. Mantenere la soluzione a 4 ° C.
   2. Preparare soluzione stock 2 sciogliendo 10,15 g MgCl ₂ * 6 H ₂ O (100 mM) in 500 mL di acqua distillata H ₂ O. Conservare soluzione a 4 ° C.
   3. Preparare soluzione madre 3 sciogliendo 10,95 g (100 mM) CaCl ₂ * 6 H ₂ O in 500 ml H _{2 O} distillata O. Conservare soluzione a 4 ° C.
3. Preparare tampone Tyrode diluendo 2,5 ml di soluzione stock 1 in un volume finale di 50 ml con acqua distillata H ₂ O. Ciò corrisponde a concentrazioni finali di 136,5 mM NaCl, 2,68 mM KCl, 11,9 mM NaHCO ₃ e 0,42 mM NaH ₂ PO ₄ * H ₂ O. Regolare il pH a 7,35 e sterilizzare filtrando con 0,22 micron filters.
4. Preparare albumina 0,35% tampone Tyrode (TA tampone ⁷⁾ diluendo 5 ml di soluzione 1, 1 ml di soluzione 2, 2 ml di soluzione madre 3, 0.5 mL 1M HEPES, 1,8 mL di 200 g / l di albumina sierica umana e 0,1 g di D anidro (+) - glucosio in un volume finale di 100 mL di acqua distillata H ₂ O.
   1. Regolare il pH a 7,35 con HC1 e impostare l'osmolarità di 295 mOsm / L aggiungendo H _{2 O} distillata O (10% del volume totale). Concentrazioni finali di questa soluzione sono: 124 mM NaCl, 2,44 mM KCl, 10,82 mM NaHCO _3, 0.38 mM NaH ₂ PO ₄ * H ₂ O, 0,91 mM MgCl ₂ * 6 H ₂ O, 1,82 mM CaCl ₂ * 6 H ₂ O . Mantenere tampone TA a 37 ° C durante l'intero esperimento.

Collezione 2. Sangue

1. Raccogliere 45-50 ml di sangue venoso, dalla vena antecubitale usando un ago G 19 e non o basso laccio emostatico, in 50 mL provette conTaining ACD anticoagulante (1 volume ACD per 6 volumi di sangue). Eliminare i primi 1-2 mL di sangue per evitare la presenza di trombina e fattore tissutale.
   1. Dopo la raccolta, miscelare il sangue con ACD capovolgendo delicatamente il tubo. Incubare il campione per 10 min a 37 ° C.

3. Preparazione di Human Washed Piastrine

1. Pre-riscaldare la centrifuga a 37 ° C. Tutte le fasi di centrifugazione seguito vengono eseguite a questa temperatura.
2. Inviare il sangue raccolto in provette 15 ml (5 ml per provetta) e centrifugare a 250 xg per 13 min per ottenere PRP.
   NOTA: Questo centrifugazione risultati passo nella produzione di tre strati del campione: 1) Lo strato superiore, composto da plasma, piastrine, e una piccola frazione di cellule bianche del sangue. 2) Lo strato intermedio, una porzione ricco di cellule bianche del sangue. 3) Lo strato inferiore, che è essenzialmente composto da globuli rossi.
3. Raccogliere il PRP pipettando la tomaia layer accuratamente in un nuovo tubo 15 ml per evitare al massimo la contaminazione con i globuli rossi e bianchi, e incubare per 10 min a 37 ° C.
4. Centrifugare la PRP a 2.200 g per 12 min (per 5 mL PRP).
   NOTA: Questa fase di centrifugazione deve essere eseguita con una bassa freno o senza freno.
5. Rimuovere il surnatante (plasma povero di piastrine), e risospendere accuratamente il pellet con 10 ml di tampone TA contenente 2 microlitri / ml di eparina (5.000 U / ml) e 2,5 ml / ml di 25 pM PGI ₂ utilizzando una pipetta di plastica Pasteur. Incubare per 10 minuti a 37 ° C.
6. Aggiungere 2,5 microlitri / ml di 25 micron PGI ₂ e centrifugare per 8 min a 1.900 g (con basso freno o senza freno).
7. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet con 5 mL di tampone TA contenente 2,5 microlitri / ml di 25 pM PGI ₂ utilizzando una plastica Pasteur pipetta. Incubare per 10 minuti a 37 ° C.
8. Durante il periodo di incubazione, pipettare 150 microlitri della sospensione piastrinicaad una provetta da 1,5 ml e conta piastrine, utilizzando un contatore di cellule automatizzata (che rileva la dimensione dei globuli misurando le variazioni di resistenza in corrente continua).
9. Dopo il 10 minuti di incubazione, aggiungere 2,5 microlitri / ml di 25 pM PGI ₂ alla sospensione di piastrine e subito centrifugare a 1900 xg per 8 minuti.
10. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet ad una concentrazione di 250.000 piastrine / mL con un volume adeguato di tampone TA (ossia se il numero di celle è 500.000 per ml, risospendere in 10 mL di tampone TA) contenente 32 microlitri / ml di apyrase a 0.01 U / ml (concentrazione finale 0,32 U / mL).
    NOTA: Alta concentrazione di apyrase viene utilizzato per evitare la desensibilizzazione dei recettori P2X1 indotte da secrezione spontanea di ATP ^{10, 11} in assenza di agonisti. Questo è importante perché risposta indotta dal collagene sono indotte da paracrino veloce / attivazione autocrina di P2X1 da ATP rilasciato from attivato piastrine. Se il percorso di segnalazione di piastrine non richiede criticamente conservazione della funzione P2X1, utilizzare 0,02 U / mL apyrase. Diversi studi (recensiti Mahaut-Smith et al. ¹⁰⁾ hanno dimostrato che 0,02 U / mL apyrase evita ADP desensibilizzazione del recettore P2Y1 con risposte P2X1 trascurabili.
11. Incubare la sospensione cellulare per almeno 30 minuti a 37 ° C prima di effettuare le misurazioni aggregometric. La preparazione è stabile da 5 a 8 h.

4. Aggregometria

1. Preparare fibrinogeno (56 mg / ml) in tampone di Tyrode.
2. Pipettare 260 ml di sospensione di piastrine in cuvette di vetro (Figura 1A; cuvetta sinistra) contenente 10 ml di fibrinogeno (56 mg / mL) e un agitatore magnetico poi incubare la sospensione per 2 - 3 minuti a 37 ° C in pozzetti di incubazione presenti nel aggregometro (Figura 1B e 1C).
3. Pre-incubazione con il Panx1inibitore blu brillante FCF aggiungendo 10 ml di 2,8 mM o 28 soluzione madre mM (concentrazione finale 100 pM e 1 mM, rispettivamente) per 7 minuti a 37 ° C.
4. Calibrare l'aggregometro ad un valore di aggregazione assumptive 100% misurando la densità ottica di una cuvetta contenente 10 microlitri fibrinogeno (56 mg / mL), 10 microlitri blu brillante FCF (2,8 mm o 28 mM) e la soluzione tampone TA senza piastrine.
   1. Posizionare la cuvetta in un'aggregazione ben sotto agitazione automatica e premere il tasto corrispondente sulla tastiera del computer collegato al aggregometro (cioè premere F1 se si usa l'aggregazione ben 1).
      NOTA: Questo esperimento descritto di seguito include blu brillante FCF. Il materiale impiegato per la taratura deve essere adattata alla condizione sperimentale.
5. Calibrare l'aggregometro ad un valore di aggregazione assumptive 0% utilizzando lo stesso campione di piastrine che verrà utilizzata per l'esperimento sotto Stirrin automaticag.
   1. Posizionare la cuvetta nell'aggregazione pozzo e premere il tasto corrispondente sulla tastiera del computer collegato al aggregometro. Attendere circa 20-30 s prima di procedere. Questo ritardo serve per assicurare che nessun aggregazione avviene prima di aggiungere gli agonisti.
      NOTA: Come qualsiasi differenza nel numero di piastrine può avere un effetto sul diametro esterno misurato, la fase di calibrazione 0% deve essere ripetuta per ogni singola misura.
6. Aggiungere 20 ml di agonista desiderato, ad esempio 15 ug collageno / mL (1 ug / ml finale) o 1,125 mM acido arachidonico (75 uM finale), nella cuvetta. avviare immediatamente la registrazione sotto continua agitazione automatica premendo il tasto corrispondente sulla tastiera del computer collegato al aggregometro.
   NOTA: L'aggiunta del agonista induce l'attivazione piastrinica. Aggregati piastrinici possono essere chiaramente distinti nella cuvetta di vetro alla fine dell'esperimento (Figura 1A; right cuvetta).
7. La registrazione si interrompe automaticamente dopo 6 min. A questo punto, salvare i dati facendo clic sull'icona di salvataggio del computer.
   NOTA: Il calcolo del tasso di aggregazione viene eseguita dal computer, che esprime il risultato finale del processo di aggregazione in percentuale.
8. Analizzare i dati.
   1. Per ulteriori informazioni esaustive su protocolli per la preparazione di piastrine lavate e sospensioni misurazione turbidimetrica dell'aggregazione piastrinica, fare riferimento ad altri documenti scritti da esperti del settore ^{12, 13.}

Risultati

Il software aggregometro produce automaticamente le curve di aggregazione e fornisce i valori per l'aggregazione massima in percentuale. I valori possono essere copiati ad un software di analisi dei dati per effettuare analisi statistiche e visualizza i valori massimi di aggregazione in forma di grafici a barre. Facoltativamente, ogni singolo punto delle curve di aggregazione possono essere esportati successivamente in un foglio elettronico e poi software statistico (es Grap...

Discussione

C'è un grande interesse nella ricerca di nuovi farmaci in grado di modulare la funzione delle piastrine al fine di prevenire la trombosi senza aumentare il rischio di sanguinamento. A tale scopo, in vitro test di laboratorio che possono monitorare affidabile e riproducibile risposte di aggregazione di piastrine umane sono assolutamente necessarie. aggregometria turbidimetrico è una tecnica facile da eseguire. Tuttavia, alcune precauzioni devono essere tenuti in considerazione. Le misurazioni devono essere...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
citric acid monohydrate (C6H8O7*H2O)	Roth	5949-29-1	danger of eye damage/irritation
trisodium citrate dihydrate (Na3C6H5O7*2H2O)	Sigma-Aldrich	S1804	-
D(+)-glucose	Sigma-Aldrich	G8270	-
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	-
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	-
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6014	-
Sodium dihydrogenophosphate monohydrate (NaH2PO4*H2O)	Sigma-Aldrich	S9638	-
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2*6H2O)	Sigma-Aldrich	M9272	-
Calcium chloride hexahydrate (CaCl2*6H2O)	Sigma-Aldrich	442909	danger of eye damage/irritation
N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (Hepes)	ThermoFisher Scientific	15630	-
human serum albumin	CSL Behring	00257/374	-
hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	320331	Corrosive and irritative for the respiratory system. Can cause severe skin and eye damages.
Eppendorf 5810 R	Fisher Scientific	-	-
heparin	Drosspharm AG/SA	20810
prostacyclin I2 (PGI2)	Cayman	18220	-
apyrase from potatoes	Sigma-Aldrich	A6535	-
fibrinogen (Haemocomplettan)	CSL Behring	HS 73466011	-
thrombo-aggragometer SD-Medical	SD-Innovation	TA8V	-
Brilliant blue FCF (Erioglaucine disodium salt)	Sigma-Aldrich	80717	Harmful to aquatic life with long lasting effects (Avoid release to the environnement)
collagen	Horm, Nycomed		-
arachidonic acid	Bio/Data corporation	C/N 101297	-
cell counter Sysmex KX-21N	Sysmex Digitana	-	-
HEPES	Gibco	15630-056	-
glass cuvettes	SD-Innovation	THCV1000	-
magnetic stirrers	SD-Innovation	THA100	-