بروتوكول لتمييز الخلايا الجذعية المحفزة البشرية المستحثة في الثقافات المختلطة من الخلايا العصبية والجلد للاختبار العصبي

Summary

وتعتبر الخلايا الجذعية المحفزة البشرية (هيبسس) أداة قوية للكشف عن المخدرات والكيمياء ولتطوير نماذج جديدة في المختبر لاختبار السمية، بما في ذلك السمية العصبية. هنا، ويرد وصف بروتوكول مفصل للتمايز هيبس في الخلايا العصبية والدبقية.

Abstract

يمكن الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان التفريق في أنواع الخلايا المختلفة التي يمكن تطبيقها على المقايسات سمية في المختبر البشري. ميزة رئيسية هي أن إعادة برمجة الخلايا الجسدية لإنتاج الخلايا الجذعية المحفزة البشرية (هيبسس) يتجنب القضايا الأخلاقية والتشريعية المتعلقة باستخدام الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (هيسس). يمكن توسيع هبسس وتمييزها بكفاءة في أنواع مختلفة من الخلايا العصبية والدبقية، بمثابة نظم اختبار لاختبار السمية، وعلى وجه الخصوص، لتقييم مسارات مختلفة تشارك في العصبية. يصف هذا العمل بروتوكول لتمايز هيبس في الثقافات المختلطة من الخلايا العصبية والدبقية. يتم تعريف مسارات الإشارات التي يتم تنظيمها و / أو تفعيلها من قبل التمايز العصبية. هذه المعلومات حاسمة لتطبيق نموذج الخلية على النموذج الجديد اختبار السمية، والتي يتم تقييم المواد الكيميائية على أساس قدرتها على بيرترب مسارات بيولوجية. وكدليل على المفهوم، تم استخدام روتنون، وهو مثبط للميتوكوندريا المعقدة الجهاز التنفسي الأول، لتقييم تفعيل مسار الإشارات Nrf2، وهو منظم رئيسي لآلية الدفاع الخلوية المضادة للأكسدة الاستجابة للعنصر (أر) المدفوعة ضد الإجهاد التأكسدي .

Introduction

وقد توخى تقرير مجلس البحوث الوطني الأمريكي ( ¹⁾ نموذجا جديدا لاختبار السمية يتم فيه نقل اختبار السمية التنظيمية من نهج يعتمد على التغيرات المظهرية التي لوحظت في الحيوانات إلى نهج يركز على المقايسات الآلية في المختبر باستخدام الخلايا البشرية. وقد تمثل مشتقات الخلايا الجذعية المحفزة (بسك) بدائل لنماذج الخلايا السرطانية، حيث أن الخلايا التي تم الحصول عليها قد تشبه بشكل وثيق الظروف الفسيولوجية للأنسجة البشرية وتوفر أدوات أكثر صلة لدراسة التأثيرات الضارة الناجمة عن المواد الكيميائية. إن النوعين الرئيسيين من ثقافات ال بسك التي تعد أكثر واعدة لاختبار السمية هي الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (هيسس) والخلايا الجذعية المحفزة البشرية (هيبسس)، والتي تستخدم حاليا على نطاق واسع في مجالات البحوث الأساسية والطب التجديدي ^{2 ، 3} . ويمكن الآن الاستفادة من هذه الخبرة لتطوير فئة جديدة من السميةجيكال في المختبر الاختبارات التي تهدف إلى تحديد مسارات الفسيولوجية المضطربة المعنية مع تطور الآثار السلبية في الجسم الحي . ومع ذلك، من غير المرجح أن تقبل جميع الدول الأعضاء في الاتحاد الأوروبي والبلدان من جميع أنحاء العالم طرق الاختبار لتقييمات السلامة التنظيمية على أساس هيسس بسبب الشواغل الأخلاقية المحتملة والسياسات التشريعية الوطنية المتنوعة التي تنظم استخدام الخلايا المستمدة من الجنين.

هبسس خصائص حصة مماثلة ل هيسس ^{4 ، 5} وعقد إمكانات كبيرة لطرق في المختبر ، سواء لتحديد الأهداف العلاجية، فضلا عن تقييمات السلامة. وبالإضافة إلى ذلك، التكنولوجيا هيبسك يخفف من القيود من تجمع المانحين محدود والشواغل الأخلاقية المرتبطة الخلايا المستمدة من الجنين. ويتمثل أحد التحديات الرئيسية ل هبسس في الدليل على أن هذه الخلايا يمكن أن تولد بشكل متكرر مجموعة كبيرة من مشتقات الخلايا ذات الصلة السمية،مع الخصائص والاستجابات نموذجية من الأنسجة البشرية. وتستخدم عادة مستويات محددة مسبقا من علامات مختارة لتوصيف السكان الخلية بعد عملية التمايز وتقديم رؤى في استقرار عملية التمايز.

قيمت الأعمال السابقة مدى ملاءمة هيبس لتوليد ثقافات مختلطة من الخلايا العصبية والدبقية ولتقييم آثار روتينون، وهو مثبط للميتوكوندريا الجهاز التنفسي معقدة I، على تفعيل مسار Nrf2، منظم رئيسي للآليات الدفاع المضادة للأكسدة في العديد من أنواع الخلايا ^{6 ، 7} .

يصف هذا العمل بروتوكول يستخدم للتمايز من هبسس إلى الثقافات العصبية وبلقية مختلطة، وتوفير تفاصيل عن مسارات الإشارات (الجينات ومستوى البروتين) التي يتم تفعيلها على التمايز العصبية / الدبقية. بالإضافة إلى ذلك، يظهر العمل نتائج تمثيلية توضح كيفية ذلكيمكن استخدام نموذج الخلايا العصبية و الدبقية المستمدة من هيبسك لتقييم تنشيط الإشارات Nrf2 الناجم عن العلاج الحاد (24 ساعة) مع روتينون، مما يسمح بتقييم تحريض الإجهاد التأكسدي.

وقد أعيد برمجة الخلايا الليفية IMR90 في هبسس في I-ستيم (فرنسا) عن طريق التنبيغ الفيروسي من 2 عوامل النسخ (Oct4 و Sox2) باستخدام ناقلات بميغ ⁶ . ويمكن أيضا تطبيق نماذج هيبسك مماثلة. البروتوكولات الموصوفة أدناه تلخص جميع مراحل تمايز هبسس في الخلايا الجذعية العصبية (نسس) وكذلك إلى الثقافات المختلطة من الخلايا العصبية ما بعد الانقسامية والخلايا الدبقية (الخطوات 1 و 2، انظر أيضا موقع إورل إكفام دبالم على وصف مفصل ل البروتوكول) ⁸ .

يتم تفصيل بروتوكول إضافي للعزل، والتوسع، الحفظ بالتبريد، ومزيد من التمايز نسس في الخلايا العصبية مختلطة والخلايا الدبقية في الخطوات 3 و 4 (راجع أيضا إلى إورل إكفام دبالم نحنبسيت للحصول على وصف مفصل لهذا البروتوكول) ⁹ . وتصف الخطوة 5 التحليلات التي يمكن القيام بها لتقييم الهوية المظهرية للخلايا خلال مراحل عديدة من الالتزام والتمايز.

Protocol

1. الإنسان المستحثة الخلايا الجذعية المحفزة (هيبسك) التوسع

ملاحظة: هيبسس يمكن تربيتها على مناسبة الركيزة مزيج البروتين في وجود المتوسطة mTeSR1 تحتوي على ملاحق mTeSR1 5X (أعدت بعد تعليمات الشركة المصنعة، لوحة ~ 100 شظايا مستعمرة / طبق بتري 60 ملم). عندما تصل مستعمرات هيبسك الحجم المناسب (انظر مثال لمستعمرة في الشكل 2A )، مرور الخلايا كما هو موضح أدناه (مرة واحدة في الأسبوع).

1. أطباق معطف مع مصفوفة غشاء الطابق السفلي هيسك المؤهلين (ويسمى فيما بعد "مصفوفة المؤهلين") أو أي الركيزة البروتين مناسبة أخرى.
   1. تخزين مصفوفة المؤهلين (انظر جدول المواد ) في -80 درجة مئوية في قسائم 200 ميكرولتر في أنابيب 1.5 مل الباردة والمبرد 5 أو 10 مل ماصات.
   2. قبل تمرير، ذوبان الجليد 200 ميكرولتر من مصفوفة المؤهلين على الجليد.
   3. تمييع 200 ميكرولتر من مصفوفة المؤهلين في 20 ملتر من دمم / F12 المتوسطة (1: 100 التخفيف).
   4. معطف 60 ملم أطباق بتري مع هذا الحل (5 مل / طبق).
   5. احتضان الأطباق المغلفة في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل.
2. هيبسك جزء مستعمرة الحفظ بالتبريد والتذويب
   1. بعد قطع المستعمرات هيبسك (انظر الخطوة 1.3 لإجراء قطع مستعمرة هيبسك)، بلطف و ببطء ريسوسبيند شظايا مستعمرة هيبسك في وسط تجميد الخلايا الجذعية، ~ 100 شظايا / 250 ميكرولتر (انظر جدول المواد).
   2. قسامة شظايا مستعمرة في قارورة مناسبة لحفظ بالتبريد (250 ميكرولتر / قارورة).
   3. وضع قارورة في حاوية مليئة 2-بروبانول ووضع الحاوية في -80 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 2 ساعة وما يصل إلى 2 أسابيع.
   4. نقل القوارير إلى مرحلة بخار خزان النيتروجين السائل.
   5. لإعادة تشغيل الثقافة، ذوبان الجليد 1 قارورة مجمدة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
   6. جمع بلطف شظايا مستعمرة هيبسك في 7 مل من هيبسك قبل تحسنت كاملةمتوسطة (انظر جدول المواد ) في أنبوب 15 مل باستخدام 1، 2، أو 5 مل ماصة.
   7. أجهزة الطرد المركزي شظايا مستعمرة هيبسك في 130 x ج لمدة 3 دقائق.
   8. إزالة طاف و ريسوسبيند بلطف شظايا مستعمرة هيبسك في 1 مل من المتوسطة هيبسك كاملة باستخدام ماصة 1 أو 2 أو 5 مل.
   9. مزيد من تمييع تعليق الخلية في 3 أو 4 مل من المتوسطة هيبسك كاملة.
   10. لوحة شظايا مستعمرة هيبسك في مصفوفة المغلفة مصفوفة طبق بتري 60 ملم (~ 100 شظايا / طبق؛ معطف الأطباق كما هو موضح في الخطوة 1.1).
   11. احتضان هيبسس عند 37 درجة مئوية و 5٪ كو ₂ .
   12. إجراء التغيير المتوسط ​​الكلي كل يوم.
3. مرور المستعمرات هيبسك
   ملاحظة: يجب أن تكون هيبسس غير متمايزة جولة في الشكل، مع نوى كبيرة وبدون السيتوبلازم وفيرة. وينبغي أن تتميز المستعمرات غير المتمايزة من قبل المورفولوجيا شقة ومعبأة بإحكام. فقط مستعمرات غير متمايزة (حوالي 1 ملم طن القطر) يجب قطع لمزيد من المرور.
   1. قطع المستعمرات الخلايا الجذعية في الساحات من حوالي 200 ميكرون × 200 ميكرون باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة 30G أو أي غيرها من الأدوات المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد). استخدام مجهر مجسمة في التكبير 4x في مجلس الوزراء تدفق الصفحي في درجة حرارة الغرفة.
   2. فصل شظايا مستعمرة من سطح الطبق باستخدام ماصة 200 ميكرولتر من قبل بيبتينغ بلطف وسط تحتها لرفع القطع.
   3. نقل شظايا مستعمرة (~ 100 قطعة) إلى مصفوفة مؤهلة-دمم / F12 المغلفة لوحة مليئة 4 مل من المتوسطة هيبسك كاملة (انظر جدول المواد؛ معطف الأطباق كما هو موضح في الخطوة 1.1).
   4. احتضان لوحة جديدة (ق) في 37 درجة مئوية و 5٪ كو ₂ .
   5. إجراء التغيير المتوسط ​​الكلي كل يوم وفحص التشكل من المستعمرات باستخدام مرحلة التباينميكروسكوب في 4X و 10 X التكبير.

2. هبسك ديفيرنتياتيون إلى الخلايا العصبية المختلطة و غليا

ملاحظة: يستغرق الإجراء حوالي 28 يوما لإكمال، مع الخطوات الرئيسية المبينة في الشكل 1 (الجزء العلوي).

الشكل 1: التمثيل التخطيطي لبروتوكول التمايز العصبية. (الجزء العلوي) يمكن تقسيم مستعمرات IMR90-هيبسك إلى شظايا لتشكيل الأجسام الجنينية (إبس). بعد يومين في المختبر (ديف)، يمكن أن تكون مطلية إبس على أطباق laminin- أو المصفوفة المغلفة القياسية والمثقفة في وجود وسط تحريض الظهارية (نري) لتوليد مشتقات نيوروكتوديرمال (وريدات، ملطخة هنا ل نستن (الأخضر) و β -III-توبولين (أحمر)). روزيتس يمكن فصلها، وجمعها، أعدت على laminin- أو أطباق مصفوفة المغلفة القياسية، ومزيد من التفريق في الخلايا العصبية ناضجة (NF200 والأحمر) وبيقية(غفاب، الأخضر) الخلايا في وجود التمايز الخلايا العصبية (ند) المتوسطة. (الجزء السفلي) نسس المستمدة من روزيت (نستن والأحمر) يمكن توسيعها في وجود الحث العصبي (ني) المتوسطة، كريوبريزرفيد، أو أكثر متباينة في وجود وسط ند لتشكيل الخلايا العصبية مختلطة (NF200 والأخضر) وبيضاوية ( غفاب، الأحمر) الثقافات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. جيل من الأجسام الجنينية (إبس) (أيام 0 → 1)
   ملاحظة: يتطلب هذا الإجراء مهارات يدوية جيدة والدقة. يجب أن تكون شظايا مستعمرة هيبسك متساوية الحجم للحصول على أجسام متجانسة متجانسة (إبس) في الخطوات التالية. وينبغي استبعاد المستعمرات متباينة شكليا (مع الكسور السيتوبلازمية الكبيرة والنوى الصغيرة).
   1. تحديث المتوسطة هيبسك (3 مل / 60 ملم طبق بتري) قبل قطع مستعمرات هيبسك غير متمايزة (حوالي 1 ملم في ديامإيتر، انظر الشكل 2A ) في ظل ظروف معقمة (كما هو موضح في الخطوة 1).
   2. قطع المستعمرات غير متمايزة (كما هو مبين في الشكل 2A والشكل 2B ) إلى شظايا ما يقرب من 200 ميكرون × 200 ميكرون باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة 30G. استخدام مجهر مجسمة في 4X التكبير في مجلس الوزراء تدفق الصفحي في درجة حرارة الغرفة.
   3. فصل شظايا مستعمرة من سطح الطبق باستخدام ماصة 200 ميكرولتر من قبل بيبتينغ بلطف المتوسطة تحتها لرفع القطع.
   4. نقل جميع شظايا منفصلة والمتوسطة إلى أنبوب 15 مل باستخدام 1، 2، أو 5 مل ماصة.
   5. شطف الطبق مع 2 مل من المتوسطة هيبسك كاملة لاسترداد جميع شظايا.
   6. أجهزة الطرد المركزي في 112 x ج لمدة 1 دقيقة.
   7. نضح طاف و ريسوسبيند بلطف شظايا في 5 مل من هبسك إب المتوسطة المتوسطة (انظر جدول المواد ).
   8. لوحة المشاركشظايا لوني في مرفق منخفض جدا 60 ملم طبق بتري (5 مل / 60 ملم طبق بتري).
   9. احتضان طبق بيتري بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ كو ₂ .
   10. في اليوم التالي (يوم 1)، وجمع إبس والمتوسطة في أنبوب 15 مل باستخدام 1، 2، أو 5 مل ماصة.
   11. أجهزة الطرد المركزي إبس في 112 x ج لمدة 1 دقيقة.
   12. نضح بعناية طاف و ريسوسبيند بلطف إبس في 5 مل من هبسك إب المتوسطة المتوسطة باستخدام ماصة 1 أو 2 أو 5 مل.
   13. ريبليت إبس على جديد 60 ملم منخفضة جدا مرفق طبق بتري (5 مل / 60 ملم طبق بتري).
   14. احتضان طبق بيتري بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ كو ₂ .
2. في يوم 1، معطف الأطباق مع مصفوفة الغشاء القاعدي (على سبيل المثال، ماتريجيل، المشار إليها فيما يلي باسم "مصفوفة القياسية") أو أي الركيزة البروتين مناسبة أخرى (على سبيل المثال ، لامينين).
   1. تخزين مصفوفة القياسية (انظر جدول المواد ) في -80 درجة مئوية في200-ميكرولتر أليكوتس باستخدام الباردة 1.5 مل أنابيب والمبرد 5 أو 10 مل ماصات.
   2. ذوبان الجليد 200 ميكرولتر من المصفوفة القياسية على الجليد.
   3. تمييع 200 ميكرولتر من مصفوفة القياسية في 20 مل من دمم / F12 المتوسطة (1: 100 التخفيف).
   4. معطف 60 ملم أطباق بتري مع هذا الحل (5 مل / طبق).
   5. احتضان الأطباق المغلفة عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
      ملاحظة: سيتم استخدام هذه الأطباق لصفيحة إبس (حوالي 50 إبس / طبق) وتوليد المجاميع العصبية الظهارية (وريدات). راجع الخطوة 2.3.
3. جيل من المجاميع العصبية الظهارية (روزيتس) (أيام 2 → 7)
   1. في يوم 2، وإزالة حل مصفوفة طلاء القياسية من أطباق بتري 60 ملم (لا حاجة لشطف لوحات) وملء لهم 5 مل / طبق من وسط الحث العصبي الكامل (نري)؛ انظر جدول المواد .
   2. نقل إبس العائمة (من الخطوة 2.1.14) إلى الأطباق المغلفة (~ 50 إبس / طبق) باستخدام ماصة 200 ميكرولتر تحت ميري مجسمةكروسكوب في التكبير 4x ووضعها في مجلس الوزراء تدفق الصفحي.
      ملاحظة: من الأهمية بمكان لتحديد متجانسة، متوسطة الحجم إبس (~ 200-300 ميكرون في القطر). إبس صغيرة جدا قد لا البقاء على قيد الحياة بشكل جيد خلال التمايز نيوروكتوديرمال، في حين أن إبس كبيرة جدا تميل إلى الخضوع نخر الأساسية.
   3. احتضان الأطباق في 37 درجة مئوية و 5٪ كو ₂ .
   4. في اليوم التالي (يوم 3)، والتحقق من الأطباق تحت المجهر في التكبير 10X لضمان أن يتم إرفاق جميع إبس.
   5. قم بإجراء تغيري متوسط ​​إمجايل مع وسط غري كامل.
   6. تغيير المتوسطة نري كل يوم حتى يوم 7، عندما المجاميع العصبية الظهارية (روزيتس) يجب أن تكون مرئية.
   7. في يوم 7، مصفوفة القياسية معطف (أو لامينين)، كما هو موضح في الخطوة 2.2، على أي لوحة المطلوبة أو شكل طبق: لوحات 96 جيدا (100 ميكرولتر / جيدا)، لوحات 24 جيدا (250 ميكرولتر / جيدا)، 12- (500 ميكرولتر / جيدا)، رقائق ميي (للنشاط الكهربائي، 1 مل / رقاقة واحدة جيدا)، أو 60 ملم بيتري ديش(4 مل / طبق).
   8. احتضان لوحات المغلفة / أطباق لمدة 2 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية و 5٪ كو ₂ .
4. روزيت التفكك والتمايز الخلايا العصبية (أيام 8 → 28)
   ملاحظة: يتطلب هذا الإجراء مهارات يدوية جيدة والدقة. لتجنب جمع الأديم الأديم وخلايا الأديم، يجب أن تفكك فقط الأديم الظاهر الأودية مثل هياكل وجمعها.
   1. في يوم 8، وقطع الهياكل تشبه روزيت في شظايا تحت المجهر مجسمة في 10X التكبير في ظروف معقمة. استخدام حقنة 1 مل مع إبرة 30G. لاحظ أن ورود تميل إلى فصل بسهولة من الطبق عند لمسها مع الإبرة.
   2. استكمال مفرزة شظايا روزيت باستخدام ماصة 200 ميكرولتر.
   3. نقل الطبق تحت غطاء محرك السيارة تدفق الصفحي وجمع شظايا روزيت ووسطها في أنبوب مخروطي 15 مل باستخدام 1، 2، أو 5 مل ماصة. شطف الطبق مع 2 مل من نري المتوسطة لاستردادكل شظايا.
   4. تدور أسفل شظايا روزيت في 112 x ج لمدة 2 دقيقة.
   5. نضح طاف.
   6. ريسوسبيند بلطف بيليه في 1 مل من دبس 1X (دون الكالسيوم والمغنيسيوم) وماصة بلطف شظايا روزيت صعودا وهبوطا باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر لفصلها جزئيا.
   7. إضافة 4 مل من المتوسطة نري كاملة واعتماد الخلايا التي تستخدم الأزرق التريبان وعداد الخلية الآلي (انظر جدول المواد )
      ملاحظة: تمييع 20 ميكرولتر من تعليق خلية في 20 ميكرولتر من الأزرق تريبان. قد يتم حذف هذه الخطوة إذا كان لا يمكن جلب الخلايا إلى تعليق خلية واحدة. إذا شظايا روزيت لا تبدو منفصلة تماما، ورود شظايا المستمدة من حوالي 50 إبس / 60 ملم طبق يمكن معلق في 50 مل من نري كاملة المتوسطة ومطلي، كما هو مبين في الجدول 1 .
   8. نضح المصفوفة القياسية (أو لامينين) حل طلاء من أطباق بتري، لوحات، و / أو رقائق ميي (من الخطوة 2.3.7). لا تدع لهم الجافة.
   9. لوحة الخلايا في وسط نري كاملة وفقا لخطة الدراسة (حوالي 15،000 خلية / سم ² ؛ انظر الجدول 1 للطلاء مؤشرات حجم).
   10. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ كو ₂ .
   11. في يوم 10، إجراء التغيير المتوسط ​​الكلي باستخدام كامل التمايز الخلايا العصبية (ند). انظر جدول المواد.
   12. تحديث وسط ند الكامل مرتين في الأسبوع حتى يوم 28.
   13. تميز مشتقات الخلايا العصبية / الدبقية، كما هو موضح في الخطوة 5 (انظر الجدول 2 لمعايير القبول العامة).

3. الخلايا الجذعية العصبية المستمدة من هيبسك (نسك) التوسع والتمايز في الخلايا العصبية المختلطة و غليا

ملاحظة: نسس المستمدة من شظايا روزيت يمكن توسيعها وصيانتها بعد الإجراء الموصوف أدناه ( الشكل 1 ، الجزء السفلي). وهذا يسمح لزيادة ثه عدد من الخلايا للتمايز والاختبار الكيميائي.

1. معطف طبق بتري 60 ملم (أو قارورة T-25) مع 5 مل من مصفوفة معيار دمم / F12 حل طلاء واحتضان ذلك لمدة 2 ساعة على الأقل في 37 درجة مئوية و 5٪ كو ₂ (كما هو موضح في الخطوة 2.2).
2. تدور أسفل شظايا روزيت المستمدة من الخطوات 1-2 (انظر الخطوة 2.4) في أنبوب مخروطي 15 مل في 112 x ج لمدة 2 دقيقة.
3. ريسوسبيند بلطف بيليه في 5 مل من الوسط الحث العصبي (ني). انظر جدول المواد.
4. نقل الخلايا على مصفوفة القياسية طبق بتري مصفوفة 60 مم (أو قارورة T-25).
5. ثقافة نسس المستمدة من روزيت في وجود ني المتوسطة، منعش المتوسطة كل يوم حتى تصل الخلايا تصل التقاء.
6. عندما متموجة، مرور نسس كما هو موضح في الخطوات التالية.
   ملاحظة: مرور نسس عن مرة واحدة في الأسبوع. والنظر في استخدام أطباق المغلفة طازجة، قوارير، أو لوحات، اعتمادا على خطة الدراسة.
7. إزالة المتوسطة ني كاملة و جينتلش شطف نسس مع دبس (دون الكالسيوم والمغنيسيوم).
8. إضافة 1.5 مل من 0.05٪ التربسين إدتا قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية إلى طبق بتري 60 ملم (أو قارورة T-25) التي تحتوي على الخلايا ووضعه في الحاضنة لمدة 1 دقيقة.
9. اضغط بلطف على الطبق (أو قارورة) لفصل الخلايا.
10. إضافة 1.5 مل من المانع التربسين قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية ونقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل.
11. شطف طبق بتري (أو قارورة T-25) مع حجم مساو من ني المتوسطة (1.5 مل) وجمع حجم في نفس أنبوب 15 مل.
12. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 130 x ج لمدة 3 دقائق.
13. إزالة ريسوسبيند طاف وبلطف الخلايا في 1 مل من المتوسطة ني كاملة باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر.
14. مزيد من تمييع تعليق الخلية في 3 أو 4 مل من المتوسطة ني كاملة وعد الخلايا باستخدام التريبان الأزرق وعداد الخلية الآلي.
15. لوحة نسس على طبق بتري 60 ملم (أو قارورة T-25) من الخطوة 3.1 في كثافة حوالي 50،000 خلية / سم ² .
16. إجراء التغيير المتوسط ​​الكلي مع المتوسطة ني كاملة كل يوم.
17. تميز الخلايا لوجود مشتقات الخلايا العصبية / الدبقية، كما هو موضح في الخطوة 5.
    ملاحظة: نسس يمكن أن تكون متباينة في الثقافات المختلطة من الخلايا العصبية والدبقية في وسط ند الكامل (كما هو موضح في الخطوات 2.4.11-2.4.13)، ومنعش ند المتوسطة كاملة مرتين في الأسبوع لمدة 21 يوما.

4. المستمدة من هسك-نسك الحفظ بالتبريد والتذويب

ملاحظة: عند مرور، نسس يمكن تجميد وإعادة ذوبان بعد هذا الإجراء.

1. أجهزة الطرد المركزي ممر نسس (من الخطوة 3.12) في 130 x ج لمدة 3 دقائق.
   ملاحظة: يجب أن تحسب الخلايا في الخطوة 3.14.
2. ببطء وببطء ريسوسبيند نسس في 3 × 10 ⁶ / مل من التجميد المتوسطة (انظر جدول المواد ).
3. قسامة الخلايا في قارورة مناسبة لحفظ بالتبريد (حوالي 0.5 مل = 1.5 × 10 ⁶ / قارورة).
4. ضع القوارير في وعاء فيمع 2-بروبانول ووضع الحاوية في -80 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 2 ساعة وحتى 2 أسابيع.
5. نقل القوارير إلى مرحلة بخار خزان النيتروجين السائل.
6. لإعادة تشغيل ثقافة الخلية، ذوبان الجليد 1 قارورة المجمدة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
7. جمع بلطف الخلايا في 7 مل من قبل تحسنت المتوسطة ني المتوسطة في أنبوب 15 مل باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر.
8. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 130 x ج لمدة 3 دقائق.
9. إزالة طاف و ريسوسبيند بلطف الخلايا في 1 مل من المتوسطة ني كاملة باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر.
10. مزيد من تمييع تعليق الخلية في 3 أو 4 مل من المتوسطة ني كاملة و عد الخلايا باستخدام الأزرق التريبان و عداد الخلية الآلي (ملاحظة: تمييع 20 ميكرولتر من تعليق الخلية في 20 ميكرولتر من الأزرق التريبان، وينبغي أن تكون الجدوى بعد الذوبان ≥ 80 ٪).
11. لوحة نسس في المغلفة طبق بتري 60 ملم (أو قارورة T25) بكثافة حوالي 50،000 خلية / سم ² .

5 - شاراتبلس الخلايا المستمدة من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية

ملاحظة: عند التمايز، يمكن تمييز المشتقات العصبية و الدبقية باستخدام تقنيات مختلفة، مثل تلك الموصوفة في الأقسام التالية.

1. الكمي في الوقت الحقيقي ير (قر) يحلل ¹⁰
   1. تدور أسفل شظايا مستعمرة هيبسك، إبس، و / أو نسس في 130 x ج لمدة 3 دقائق.
   2. ريسوسبيند الخلية بيليه في 100 ميكرولتر من العازلة رنا الباردة تحلل المنصوص عليها في عدة مناسبة لاستخراج الحمض النووي الريبي.
   3. بدلا من ذلك، وجمع المشتقات العصبية / الدبقية مباشرة من لوحات عن طريق الشفط المتوسطة وإضافة الباردة رنا تحلل العازلة إلى الآبار لجمع الخلايا.
   4. عزل الرنا بعد تعليمات الشركة الصانعة.
   5. عكس النسخ 500 نانوغرام من الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام مجموعة مناسبة ل رنا إلى كدنا ريتروترانسكريبتيون.
   6. تشغيل ردود الفعل قر في تكرار باستخدام مزيج الرئيسي المناسب والتمهيديمجموعات (انظر جدول المواد ).
   7. تسجيل الانبعاث الفلورسنت في الوقت الحقيقي: 45 دورات مع الاشعال الصلب في 60 درجة مئوية.
   8. تطبيع كميات رنا النسبية ل غابد و β-أكتين كجينات مرجعية واستخدام هبسس غير متمايزة أو الخلايا غير المعالجة لظروف معايرة (طريقة ΔΔCt). بدلا من ذلك، استخدم طريقة أخرى مناسبة.
2. إمونوسيتوشيميستري والتصوير عالية المحتوى (هسي) ^{6 ، 11}
   1. إصلاح المستعمرات هيبسك، نسس، و / أو المشتقات العصبية / الدبقية مع بارافورمالدهيد باردة 4٪ لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   2. غسل بلطف الخلايا في برنامج تلفزيوني 1X وتخزين لوحات في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر.
   3. عندما تكون جاهزة للتلطيخ، بيرمابيليز الخلايا في بيرمابيليزاتيون العازلة (1X دبس تحتوي على 0.1٪ تريتون-X-100 و 3٪ بسا) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   4. إزالة بيرمابيليزاتيون بوفر واحتضان الخلايا في عرقلة العازلة (3٪ بسا / 1X دبس) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لمنع ملزمة غير محددة من الأجسام المضادة.
   5. إزالة العازلة حظر واحتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في عرقلة عازلة تحتوي على الأجسام المضادة الأولية المناسبة (انظر جدول المواد ).
   6. غسل الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني 1X.
   7. احتضان الخلايا لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في عرقلة العازلة التي تحتوي على الأجسام المضادة الثانوية مترافق فلوريوكروم مترافق (انظر جدول المواد )، كونترستينينغ النوى مع صبغ دابي.
   8. تحديد متوسط ​​كثافة مضان والنسب المئوية النسبية لأنواع الخلايا باستخدام منصة التصوير عالية المحتوى مناسبة، إذا كانت متوفرة (انظر جدول المواد ).
      ملاحظات: لتحديد مستوى شدة الخلفية الفلورسنت، احتضان بعض الخلايا / الآبار مع الأجسام المضادة الثانوية وحدها. تحليل تدفق سايتوميتريك من العيش (غير ثابتة)، أونديمكن تنفيذ هبسس غير متمايزة لتقييم التعبير عن علامات محددة بسك، مثل SSEA4 (انظر جدول المواد ). ويمكن تحليل مستعمرات هيبسك غير المتمايزة لنشاط الفوسفاتيز القلوي باستخدام مجموعات بسيب / نبت المتاحة تجاريا، وفقا لتعليمات الشركات الصانعة (انظر جدول المواد ). بالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء مقايسات مجموعة البروتينات العكسية (ربا) والتحليلات، كما هو موضح في المرجع 12 (للحصول على قائمة الأجسام المضادة التي تم اختبارها، انظر جدول المواد ).
3. القياسات الكهربية ¹³
   1. لوحة شظايا روز منفصلة (بعد 7 ديف) أو نسس مشتقة من وريدات على صفائف مولتيلكترود المغلفة (الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف؛ انظر جدول المواد ) في وسط ند الكامل (~ 1 × 10 ⁵ خلايا / واحدة جيدا رقاقة ميي ).
   2. التفريق بين الخلايا لمدة 3 أسابيع في وسط ند كاملة، منعش ثe متوسط ​​مرتين في الأسبوع.
   3. في نهاية التمايز، ختم رقائق الشرق الأوسط وأفريقيا مع غشاء شبه نفاذية تحت غطاء تدفق الصفحي للحفاظ على الثقافات العقيمة للقياسات المتكررة.
   4. استبدال واحد من الأقطاب مع إشارة أرضية واحدة، مما يسمح للتسجيلات من الأقطاب المتبقية.
   5. تسجيل معدل اطلاق متوسط ​​(مفر؛ عدد من المسامير / دقيقة) باستخدام مكبر للصوت ميي مع التحكم في درجة الحرارة المتكاملة عملية تعديلها إلى 37 درجة مئوية و 5٪ كو ₂ .
   6. كشف القمم من البيانات الخام ميي باستخدام حد عتبة -4.7σ (σ يمثل الانحراف المعياري للضوضاء القاعدية).
   7. معالجة بيانات ما بعد التسجيل مع برنامج مناسب.

النتائج

توصيف هبسس غير متمايزة

لتقييم النمط الظاهري لل هيبسس، وتحليل المستعمرة / خلية التشكل، وتحديد علامات بسك محددة، وفحص التعبير الجيني والنشاط الفوسفات القلوية يجب أن يؤديها. وينبغي أن تكون هبسس غير متمايزة جولة، مع نوى كبيرة وبدون السيتوبلازم وفيرة. يجب أن تتسم غالبية المستعمرات من التشكل شقة ومعبأة بإحكام، مؤشرا على النمط الظاهري غير متمايزة ( الشكل 2A والشكل 2B ). بالإضافة إلى ذلك، أكثر من 80٪ من المستعمرات يجب أن تكون إيجابية لالقلوية الفوسفاتيز تلطيخ النشاط ( الشكل 2C ).

حوالي 80٪ من الخلايا يجب أن تكون إيجابية للعلامات ذات الصلة متعددة القدرات الكلاسيكية، مثل Oct4، S( 2-H )، كما هو موضح من قبل الكيمياء المناعية والتدفق الخلوي، في حين أن نسب نستين ⁺ و β-إي-توبولين ⁺ الخلايا يجب أن تكون منخفضة بشكل ملحوظ (حوالي 8٪ و 3٪ على التوالي، كما هو مبين في الشكل 2H ). وينبغي أن تكون هذه النتائج قابلة للتكرار عبر المقاطع.

الشكل 2. توصيف IMR90-هيبس غير متمايزة. (A و B) الصور المتناظرة على الطور (10X و 20X التكبير) من مستعمرات IMR90-هيبسك غير متمايزة. (C) صور تمثيلية من المستعمرات الملطخة الفوسفاتيز القلوية (4X التكبير). ( دف ) ممثل الصور إمونوسيتوشيميكال من (D) Oct4 (الأحمر)، (E) SSEA3 (الأخضر)، و (F) ترa1-60 (أخضر). (G) ممثل نقطة مؤامرة من SSEA1 (CD15) و SSEA4 تلطيخ، وتحليلها عن طريق التدفق الخلوي. (H) يظهر الرسم البياني شريط النسب المئوية من Oct4 ⁺ (~ 75-80٪)، ترا1-60 ⁺ (~ 75-80٪)، SSEA3 ⁺ (~ 75-80٪)، نستن ⁺ (~ 10 - 15٪ )، و β-إي-توبولين ⁺ (~ 3 - 7٪) الخلايا، كونترستيند مع دابي وكميتها من قبل هسي، مع متوسط ​​من 3 إلى 5 مكررات البيولوجية ± سيم (الرسم البياني تعديل من المرجع 6). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تقييم تعدد القدرات عن طريق تشكيل إب

هبسس هي متعددة القدرات، وهذا يعني أنها تعبر عن ثلاث جينات ذات صلة بالطبقة الجرثومية في ظل ظروف مناسبة. لتقييم تعدد القدرات هبسك، فمن الممكن تطبيق مشتركالنهج القائم على تشكيل إب عفوية، مما يدفع تشكيل الطبقات الجرثومية الثلاثة ¹⁴ . يجب أن تشير تحاليل الجينات الخاصة بالطبقة الجرثومية إلى زيادة تعتمد على الوقت من الأديم الباطن (α-فيتوبروتين (أف) و سيتوكيراتين 18 (KRT18))، الأديم الظاهر (نيستين، سري-بوكس 1 (Sox1)، والمربع المقترن 6 (Pax6) )، والأديم المتوسط ​​(الببتيد الناتريوتريك A (نبا) و براشيوري-T) ذات الصلة التعبير الجيني ( الشكل 3A والشكل 3B ). انظر جدول المواد.

الشكل 3. تقييم تعدد القدرات عن طريق تشكيل إب. (A) ممثل صورة على النقيض من المرحلة إبس في اليوم 1. (B) يظهر الرسم البياني شريط تحليلات قر من الأديم المتوسط ​​(نبا و براشيوري)، الأديم الظاهر (Pax6، Sox1، نستن)، والأديم (أف و KRT18 ) الجينات، تطبيع إلى الجينات المرجعية، β-أكتين و غابد، ومعايرة إلى خلايا غير متمايزة (يوم 0). هذه هي الطريقة ΔΔCt، بمتوسط ​​5 تحليلات مستقلة ± سيم = p <0،05، ** p <0.01، *** p <0.001؛ رسم بياني تعديل من مرجع 6. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تحريض التمايز العصبي و الدبقية

IMR90-إيبسس يمكن أن تكون متباينة في الثقافات المختلطة من الخلايا العصبية بعد الانقسامية والخلايا الدبقية التالية الخطوات الموجزة في الشكل 1 وفي أقسام البروتوكول. 5-8 أيام بعد تصفيح إبس على أطباق مصفوفة القياسية أو لامينين في وجود المتوسطة نري كاملة، يجب أن تبدأ الهياكل مثل روزي تصبح مرئية (= "زفيغ"> الشكل 4A). وتتميز روزيتس بوجود نستين ⁺ الخلايا (السلائف العصبية، ~ 90٪)، مع عدد قليل من β-إي-توبولين ⁺ الخلايا (الخلايا العصبية الملتزمة، ~ 5-10٪)، وهذا الأخير عموما مترجمة بشكل رئيسي في محيط وزيت ( الشكل 4B ، ورود في يوم 12).

على تفكك روزيت و ريبلاتينغ على laminin- أو أطباق المصفوفة المغلفة القياسية أو لوحات في وجود المتوسطة ند كاملة، والخلايا تبدأ تمر التمايز إلى الثقافات المختلطة من الخلايا العصبية والدبقية، وتشكيل تدريجيا مجموعات من الهيئات الخلايا العصبية متصلة من قبل حزم من نيوريتس ( الشكل 4C والشكل 4D ). وينبغي الحصول على نتائج مماثلة عند تحليل السكان العصبية التي تم الحصول عليها عن طريق توسيع نسس المستمدة من روزي وتمييزها في الخلايا العصبية والدبقية. نسس الموسعة من ورود يجب أن يكون ناستين ⁺ ( الشكل 4E ، أقحم تظهر نستن ⁺ الخلايا).

بعد 21 يوما من التمايز، يجب أن تكون الخلايا إيجابية ل β-إي-توبولين. NF200. تاو. و MAP2، علامة الراحل من التشعبات ( الشكل 4D ، 4F، والشكل 4H)، مع ما لا يقل عن 10-15٪ من الخلايا إيجابية للبروتين الحمضية الليفي الحمضية (غفاب)، علامة أستروجليال ( الشكل 4G والشكل 4H) . وعلاوة على ذلك، ~ 20-30٪ من الخلايا يجب أن تحتفظ التعبير عن نستن بعد التمايز ( الشكل 4H ). من المهم أن نرى أن النسبة المئوية لكل نوع من الخلايا ( أي الخلايا العصبية ، الخلايا النجمية، نستين ⁺ الخلايا) قد تختلف عبر المقاطع، ويمكن ملاحظة التقلب التي تعتمد على المستخدم.

من خلال تحليل مجموعات فرعية فرعية الخلايا العصبية، الخلايا العصبية غابايرجيك ريبري(15 - 20٪ من مجموع الخلايا، والخلايا العصبية الدوبامين ~ 13 - 20٪، والخلايا العصبية غلوتاماترجيك ~ 35 - 42٪، كما هو موضح من قبل إمونوستينينغ للحمض غاما أمينوبوتيريك (غابا)، هيدروكسيلاز التيروزين (ث)، والجلوتامات الحويصلي الناقل 1 (VGlut1)، على التوالي (انظر الكمي ممثل في الشكل 4H ). ويمكن أيضا تقييم تحريض التمايز من خلال تحليل علامات ذات الصلة متعددة القدرات (على سبيل المثال، أكتوبر 4، ترا1-60، و SSEA3)، والتي ينبغي أن تكون أقل بكثير في خلايا متباينة مقابل هبسس غير متمايزة (لا يظهر، انظر المرجع 6). ويمكن أيضا أن يتم تأكيد هذا من خلال تحليل التعبير الجيني عن طريق قر، والتي ينبغي أن تشير إلى انخفاض في Oct4 و نانوغ و أوبريغولاتيون من الجينات العصبية، مثل الخلية العصبية التصاق جزيء 1 (NCAM1) والبروتين المرتبط ببولي إثيلين 2 (MAP2). الجين بريسينابتيك، سينابتوفيسين (سيب)؛ وجين ما بعد التشابك، تاو البروتين المرتبطة تبيب (مابت)، كما هو مبين في < سترونغ كلاس = "زفيغ"> الشكل 4I. وعلاوة على ذلك، فإن الدوبامين (ث و NR4A1)، نوادرينرجيك (PHOX2A و PHOX2B)، غلوتاماترجيك (NARG2، GRIA1 و GAP43)، غابايرجيك (GABRA1 و GABRA3)، والخلايا العصبية الحركية (ISL1 و LHX3)، و كولينرجيك (SLC5A7 و SLC18A13) والنتيجة في أوبريغولاتد الخلايا العصبية مقارنة الخلايا غير متمايزة ( الشكل 4J ).

تحليل النشاط الكهربائي عفوية، عن طريق ميي، هو قراء قيمة لتقييم وظائف الشبكة العصبية في هيبس متباينة. في نهاية فترة التمايز، وتتميز المشتقات العصبية عموما بمعدل اطلاق النار (مفر) لا يقل عن 60 طفرات / دقيقة (انظر مؤامرة النقطية ممثل في الشكل 4K ). ومع ذلك، لا يتم رصد رشقات نارية.

55702fig4.jpg "/>
الشكل 4. التمايز بين IMR90-هبسس في الثقافات المختلطة من الخلايا العصبية و غليا. (A و B) صور ممثل من روزيتس بعد 7 ديف (A) وبعد 12 ديف (B) ، ملطخة نستن (الأخضر) و β-إي-توبولين (أحمر)). (C و D) صور ممثل للخلايا متباينة بعد 22 ديف (C) و 28 ديف (D) ، ملطخة β-إي-توبولين (الأحمر) و NF200 (الأخضر)). (E) صورة ممثل نسس المستمدة من تفكك روزيت والتوسع (يظهر أقحم نستن ⁺ الخلايا والأحمر). (F و G) صور الممثل للخلايا العصبية ( F ، ملطخة ل NF200 (الأحمر) وتاو (الأخضر)) والخلايا الدبقية ( G ، ملطخة ل غفاب (الأحمر)) متباينة نسس (بعد 21 ديف). (H) الكمي من نستين، MAP2، غفاب، حمض غاما أمينوبوتيريك (غابا)، الناقل الغلوتامات الحويصلي 1 (فغلوت1)، و هيدروكسيلاز التيروزين (ث) - الخلايا الإيجابية من قبل هسي، مقارنة مشتقات IMR90-هيبسك وخلايا متباينة من نسس المستمدة من IMR90-هيبسك (رسم بياني معدلة من المرجع 7). (I و J) التي تظهر تحاليل قر للجينات متعددة القدرات (أكتوبر و نانوغ) والجينات العصبية (NCAM1 و MAP2 و سيب و مابت) (I) والدوبامين (ث و NR4A1) و نورادرينيك (PHOX2A و PHOX2B) (NARG2، GRIA1، GAP43)، غابايرجيك (GABRA1 و GABRA3)، والخلايا العصبية الحركية (ISL1 و LHX3)، و كولينرجيك (SLC5A7 و SLC18A13) الجينات المرتبطة (J) . تم تطبيع جميع التحاليل للجينات المرجعية، β-أكتين و غابد، ومعايرة إلى خلايا غير متمايزة (أشرطة خضراء). هذه هي الطريقة ΔΔCt، بمتوسط ​​5 تحليلات مستقلة ± سيم * p <0،05، ** p <0.01، *** p <0.001. تم تعديل الرسوم البيانية في I و J من المرجع 6. (K) مؤامرة الممثلة النقطية من العصبية المستمدة من IMR90-نسك(تم إجراء التسجيل بحد أدنى 600 ثانية؛ والقضبان العمودية تمثل طفرات واحدة). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يتم تنظيم توقيع معين من علامات الخلايا العصبية في متباينة IMR90-هبسس

في النموذج الجديد لاختبار السمية، من الضروري تحديد الأحداث الجزيئية والخلوية التي تحدث داخل خلية بعد التعرض لسمية سمية معينة. ولذلك، فمن المهم أن يصف مسارات الإشارات التي يتم تنشيط و / أو أوبريغولاتد داخل النموذج الخلوي قيد التحقيق.

المصفوفات المتاحة تجاريا لتحليل بروتين كيناز التعبير الجيني يمكن استخدامها لمقارنة هيبس غير متمايزة مقابل خلايا متباينة. مختلفا(إمر90-هبسك) الخاضعة للتحكم فوق الجينات في السيطرة على مستقبلات نيوروتروفين، تنظيم التوجيه المحوري، تعديل نمو نيوريت، مستقبلات العصبية المستمدة من الدبقية (غنف)، بروتين عظمي مورفوجينيتيك (بمب) / تغف بيتا المسار، مستقبلات النمو المشتقة (بدغف) مستقبلات ( الشكل 5A والشكل 5B ).

تحليل ربا يظهر أوبريغولاتيون من توقيع الخلايا العصبية محددة في متباينة IMR90-هبسس. على وجه الخصوص، يتم تنشيط إرك / كريب، أكت / PDK1 / متور، ومسارات إشارات Notch1 على التمايز ( الشكل 5C ).

الشكل 5. الخلايا العصبية متباينة وخلايا الدبقية عرض تفعيل مسارات المرتبطة العصبون. (او B) الرسوم البيانية شريط تقرير التحاليل قر من كيناس ذات الصلة الخلايا العصبية (A) وغيرها من الجينات ذات الصلة كيناز (B) . تم تطبيع البيانات التعبير الجيني إلى الجينات المرجعية 18S و غابد (المنصوص عليها في الصفيف) ومعايرة إلى خلايا غير متمايزة. لهذه التحاليل، اعتبر الجين أعلى تنظيما عندما كان تعبيره على الأقل 2x أعلى مما هو عليه في الخلايا غير المتمايزة (2 ^{-ΔΔ كت} 2)؛ يعني 3 تحليلات مستقلة ± سيم). (C) يظهر الرسم البياني شريط الكميات البروتين المطلق عن طريق تحليل رببا، مقارنة متباينة (أشرطة حمراء) وخلايا غير متمايزة (أشرطة خضراء). يتم تجميع البروتينات التي تنتمي إلى نفس المسارات تشوير المسار معا على النحو التالي: كريب / إرك / أكت، PDK1 / متور / إرك / أكت، Notch1، ش و ونت، سابك / جنك، و بمب / سماد. يعني ± سيم من 4 تحليلات مستقلة. * p <0،05، ** p <0.01، *** p <0.001؛ الرسم البياني المعدلة fروم مرجع 6. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

IMR90-هيبسك المستمدة من الخلايا العصبية / الدبقية الثقافات يمكن استخدامها لتقييم آثار روتينون

روتينون، مثبط I معقدة من سلسلة الجهاز التنفسي الميتوكوندريا، ومن المعروف أن يسبب الاكسدة عن طريق اثار تفعيل مسار Nrf2. في ظل ظروف هادئة، Nrf2 هو الراسية في السيتوبلازم من قبل Keap1 (كيلش مثل البروتين المرتبطة إش 1)، و Nrf2 الضاغطة، مما يسهل Nrf2 أوبيكيتيناتيون والتحلل البروتيني ¹⁵ . عند تحريض الإجهاد التأكسدي، Nrf2 يترجم إلى النواة وينشط التعبير عن الجينات المستهدفة Nrf2-أر ¹⁶ .

IMR90-هيبسك المستمدة من الخلايا العصبيةد الخلايا الدبقية يمكن استخدامها لتقييم آثار روتينون على تفعيل Nrf2 عن طريق تعريض الخلايا لتركيزات مختلفة من روتينون (على سبيل المثال، 1، 10، و 100 نانومتر) لمدة 24 ساعة. تم تأسيس هذه التركيزات وفقا للدراسات السابقة ^{17 ، 18} .

في هذه التركيزات وأوقات التعرض، لم روتينون لم يؤدي إلى السمية الخلوية، كما هو مبين من خلال تحديد الكمي الحية نواة الخلية ⁺ دابي ( الشكل 6A ). روتينون الناجم عن Nrf2 النووية نقل، وخاصة بعد تعريض الخلايا إلى 100 نانومتر روتينون ( الشكل 6B والشكل 6E ). في نفس التركيز، لوحظ انخفاض كبير في Kib1 السيتوبلازمية ( الشكل 6C )، جنبا إلى جنب مع زيادة في كل من ناد (P) H كينون أوكسيدوريدوكتاس 1 (NQO1) و سولفيروكسين 1 (SRXN1)، واثنين من Nrf2 المستهدفة أرزيمس ^{19 ، 20} ( الشكل 6D ).

الشكل 6. آثار روتينون على Nrf2 النووية نقل، Keap1، SRXN1، و NQO1 مستويات البروتين. (A) الكمي للخلايا دابي ^{+ +} الحية ( أي نوى غير بيكنوتيك) على 24 ساعة العلاج مع 1، 10، 100 نانومتر روتينون وتطبيع إلى الخلايا غير المعالجة (السيطرة، كتر). (B) Nrf2 البروتين النووي نقل ( أي، النسب النووية / السيتوبلازمية) بعد 24 ساعة من التعرض ل روتينون، التي قيمتها قياسات كثافة مضان باستخدام تحليل هسي. (C) الكمي من مستويات البروتين Keop1 السيتوبلازمية على العلاج روتنون، التي قيمها تحليل هسي. (D) الكمي من ناد (P) H كينون أوكسيدوريدوكتاس 1 (NQO1) وسلفيالأكسدة 1 (SRXN1) عن طريق المناعي و هسي بعد 24 ساعة من العلاج مع روتينون. (E) صور الممثل من Nrf2 توطين البروتين (الأخضر). وتظهر جميع القيم كمتوسط ​​± سيم من 3 مكررات البيولوجية. * p <0،05، ** p <0.01؛ الرقم المعدل من المرجع 7. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

في هذه التركيزات وأوقات العلاج، كما أثار روتينون زيادة تعتمد على تركيز من ستروغليال (غفاب ⁺ ) نسبة الخلية ( الشكل 7A والشكل 7B )، دون التأثير على نسب نسس (نستن ⁺ ) والخلايا العصبية (MAP2 ⁺ ) ( الشكل 7B ). من خلال النظر في نسب أنواع فرعية الخلايا العصبية محددة، والعلاج روتنون (10 نانومتر و 100 نانومتر)انخفاض كبير في عدد الخلايا العصبية الدوبامين (ث ⁺ ) ( الشكل 7C و D )، في حين أن النسب المئوية لل غابايرجيك (غابا ⁺ ) و غلوتاماترجيك (VGlut1 ⁺ ) الخلايا العصبية لم تتغير ( الشكل 7D ). على نحو مماثل، السابقة في الجسم الحي وفي الدراسات المختبرية وصفت تعتمد على روتينون وانتقائية الدوبامين الخلايا العصبية الموت ^{21 ، 22 ، 23} .

الشكل 7. آثار روتينون على الخلايا الدبقية والخلايا العصبية الدوبامين. (A) صور ممثل من الخلايا ⁺ غفاب (الأحمر)، مع التكبير 40X في إينيتس، غير المعالجة أو تعامل مع 100 نانومتر روتينون لمدة 24 ساعة. (ب) الكمي من نستين ⁺ ، MAP2 ⁺ ، و غفاب ⁺ الخلايا، تطبيع إلى الخلايا غير المعالجة (السيطرة، كتر). (C) صور ممثل الدوبامين ث ⁺ الخلايا العصبية (الأخضر)، مع التكبير 40X في إينيتس، غير المعالجة أو تعامل مع 100 نانومتر روتينون لمدة 24 ساعة. (D) الكمي للخلايا غابا ⁺ ، VGlut1 ⁺ ، و ث ⁺ الخلايا العصبية، تطبيع إلى الخلايا غير المعالجة (كتر). وتظهر جميع القيم كمتوسط ​​± سيم من 3 مكررات البيولوجية. * p <0،05، ** p <0.01، *** p <0.001؛ الرقم المعدل من المرجع 7. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم تقييم الدلالة الإحصائية بواسطة أنوفا في اتجاه واحد مع اختبار المقارنة المتعددة دونيت كاختبار ما بعد (مقارنة جميع الأعمدة مقابل عمود التحكم)كريف "> 24 أو عن طريق اثنين من الذيل غير المقنن أو الاقتران t- اختبار وفقا لنوع التحليل.جميع البيانات تمثل متوسط ​​ما لا يقل عن ثلاثة مكررات البيولوجية ± الخطأ المعياري للمتوسط ​​(سيم) وتشير علامة النجمة على شريط يشير فارق معنوي مع مجموعة السيطرة.

الجدول 1.
ملاحظة على فصل وضوح كثافة الطلاء: إذا شظايا روزيت لا تبدو منفصلة تماما، من أجل الوصول إلى كثافة الطلاء خلية من حوالي 15.000 خلية / سم ² ، فصل وريدات شظايا المشتقة من حوالي 50 إبس / 1 × 60MM طبق يمكن معلق في 50 مل من نري كاملة ومطلي على النحو التالي (اعتمادا على شكل لوحة):

لوحات مولتيويل / ميي	منطقة النمو (سم 2 / جيد)	حجم تعليق الخلية إلى لوحة لكل بئر (أو رقاقة ميي)	الحد الأقصى لعدد لوحات التي يمكن مطلي (مع 50 مل من تعليق الخلية)
96 بئرا	0.3	100 أول	5
48 بئرا	0.7	220 أول	4
24 بئرا	2	625 أول	3
12 بئرا	4	1.25 مل	3
6 آبار	10	3.125 مل	2
واحد جيدا ميي رقاقة	3.5	1.1 مل	45

الجدول 2: معايير القبول

علامة /الجسم المضاد	النسبة المئوية (على خلايا دابي + (الحية) بعد 28 ديف
B-إي-توبولين (Tuj1)	35-45٪
MAP2	50-60٪
NF200	45-55٪
GFAP	10-25٪
Nestin	15-25٪

Discussion

يصف هذا العمل بروتوكول قوي وسريع نسبيا للتمييز بين IMR90-هبسس في الخلايا العصبية ما بعد الانقسامية والخلايا الدبقية. نشرت سابقا بروتوكولات التمايز الخلايا العصبية على أساس هيسس و هيبسس عادة ما تسفر عن نسب عالية من السلائف العصبية ^{25 و 26} وعدد كبير من الخلايا المستهدفة الخلايا العصبية ^{27 و 28 و 29 و 30 و 31 و 32 و 33} . على نحو مماثل، بروتوكول التمايز الموصوفة هنا هو مناسبة لتوليد الثقافات غير المتجانسة من غابايرجيك، غلوتاماترجيك، والخلايا العصبية الدوبامين، جنبا إلى جنب مع الدبقية ونسبة منفصلة من نستين ⁺ الخلايا. ويشير وجود غلوتاماترجيك (~ 35-42٪) و غابايرجيك (~ 15-20٪) الخلايا العصبية أنهذه الثقافة تمتلك الدماغ الأمامي، والميزات القشرية مثل، ووجود عدد منفصل من الخلايا العصبية الدوبامين (~ 13-20٪) قد تشير أيضا إلى خصوصية الدماغ المتوسط. بالإضافة إلى ذلك، فإن استمرار نسبة متواضعة من نستين ⁺ الخلايا قد تكون مناسبة لدراسة تكوين الخلايا العصبية والآثار المحتملة للمواد الكيميائية على نسس، التي تقتصر أساسا على كل من الحصين والمنطقة تحت البطين (سفز) من الدماغ الأمامي ³⁴ . المزيد من التحليلات إمونوسيتوشيميكال والتعبير الجيني من شأنه أن يساعد على تحديد أفضل خصوصية إقليمية للمشتقات الخلية متباينة.

أهم خطوتين في بروتوكول التمايز الموصوفة في هذه الوثيقة هي: (1) قطع مستعمرات هيبسك إلى شظايا متجانسة (وهو أمر حاسم لتوليد إبس مع أحجام متجانسة) و (إي) قطع الهياكل العصبية السرطانية (الورود ) ل نسك التمايز، الأمر الذي يتطلب مهارة يدوية كبيرةوالدقة لتجنب جمع الأديم المتوسط ​​وخلايا الأديم التي قد تقلل من نسب الخلايا العصبية والخلايا الدبقية التي تم الحصول عليها على التمايز.

فمن الأهمية بمكان لوصف المظاهر من الخلايا أثناء التوسع (كمستعمرات غير متمايزة أو نسس) وخلال جميع خطوات التمايز. على وجه الخصوص، يجب أن تظهر ملامح التعبير الجيني والبروتين من مشتقات الخلايا العصبية / الدبقية أوبريغولاتيون وتنشيط مسارات الإشارات العصبية ذات الصلة، في حين أن التعبير عن علامات تعدد القدرات يجب أن تنخفض.

يمكن أن يكون توليد إبس والمشتقات نيوروكتوديرمال (وريدات) تحديا يدويا وعرضة للتغير. لهذا السبب، وضعنا بروتوكول لتوسيع نسس المستمدة من روزي ومزيد من التمايز في الخلايا العصبية / الدبقية.

القيود المحتملة لهذا البروتوكول التمايز هي أساسا (1) نسبة منخفضة نسبيا من د(2) عدم وجود وظائف الشبكة العصبية الناضجة (كما يتضح من عدم وجود رشقات نارية). وعلاوة على ذلك، يمكن أن مجموعات فرعية فرعية محددة من الخلايا النجمية تعمل أسلاف الأولية أو نسس ³⁵ . في حين لم يتم ملاحظة نستين / غفاب خلايا إيجابية مزدوجة في هذه الخلية الخلوية متباينة (لا تظهر البيانات)، فمن المفترض أن الخلايا ⁺ غفاب في هذه الثقافات المختلطة هي الأسلاف نجمي والنجمية. ومن المعقول أنه من خلال تمديد وقت التمايز، قد يزيد عدد الخلايا النجمية، ويمكن مورفولوجيا تصبح أكثر نضجا، كما أشير من قبل الأعمال السابقة من مجموعة تشانغ ^{36 ، 37} .

وفي النموذج الجديد لاختبار السمية، تكتسب المعارف المتعلقة بالاضطرابات الناجمة عن المواد الكيميائية في المسارات البيولوجية أهمية قصوى عند تقييم الشدائد الكيميائية. ولذلك، ينبغي أن تكون أنظمة الاختبار في المختبر قادرة علىتربط الآثار الضارة باضطرابات مسارات التشوير، وفقا لمفهوم مسار النتائج المعاكسة (أوب). كدليل على مفهوم، روتنون يمكن استخدامها لتقييم تفعيل مسار Nrf2، التي تشارك في الدفاع الخلوي ضد الأكسدة أو الإجهاد الكهربي ³⁸ ، والإجهاد التأكسدي هو الحدث الرئيسي المهم والمشترك في مختلف العمليات التشغيلية ذات الصلة ل السمية العصبية التنموية والكبار ³⁹ .

يجب أن يستحث روتينون تفعيل مسار Nrf2، والذي يمكن أن يبرهن عليه البروتين النووي Nrf2، وزيادة التعبير عن الانزيمات Nrf2 المستهدفة، بما في ذلك NQO1 و SRXN1. وقد وجد أن روتنون يدفع زيادة تعتمد على الجرعة من مستويات البروتين غفاب، مما يدل على تفعيل الخلايا النجمية ^{40 ، 41} . روتينون أيضا يقلل من عدد من الدوبامين (ث ⁺ ) الخلايا، وهو ما يتفق مع بريفيأوس في المختبر وفي الجسم الحي الدراسات التي تبين روتينون تعتمد على موت الخلايا الدوبامين، لأن هذا النوع من الخلايا العصبية حساسة بشكل خاص للإجهاد التأكسدي ^{21 ، 22 ، 23} .

في الختام، هذه هيبسك المستمدة الخلايا العصبية و الدبقية نموذج زراعة الخلايا هو أداة قيمة لتقييم الآثار السمية العصبية للمواد الكيميائية التي تثير الإجهاد التأكسدي مما أدى إلى تنشيط مسار Nrf2. كما يسمح هذا البروتوكول التمايز لتوليد الثقافات المختلطة للخلايا العصبية (غابايرجيك، الدوبامين، والخلايا العصبية غلوتاماترجيك) والنجمية، فإنه قد يثبت مناسبة لدراسة الحديث المتبادل بين الخلايا العصبية والدبقية في الظروف الفسيولوجية والمرضية، كما هو الحال في الأمراض العصبية التنكسية ( على سبيل المثال، مرض باركنسون). وعلاوة على ذلك، فإن وجود نسبة كبيرة من نسس قد تساعد على تقييم الآثار المحتملة للمواد الكيميائية على بروغ العصبيالتي يعرف أنها الهدف الرئيسي للطفرات التي يسببها كيميائيا أو الالتهابات الفيروسية ⁴² .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Complete hiPSC medium:
mTeSR1 Basal Medium	Stem Cell Technologies	05851	(Step 1.2.6). Complete mTeSR1 is stable when stored at 2 - 8°C for up to 2 weeks. 5X Supplements can be dispensed into working aliquots and stored at -20°C. Use frozen aliquots within 3 months.
mTeSR1 5X Supplements	Stem Cell Technologies	05852
Matrigel hESC-qualified Matrix	Corning	354277	1:100 (Step 1.1). Thaw Matrigel on ice, prepare 200 ul aliquots and store them in -80°C. For coating, dilute 200ul aliquot in 20 ml of DMEM/F12 medium.
CryoStem Freezing Medium	Stemgent	01-0013-50	Freeze ~ 100 fragments/250 ul/vial (Step 1.2.1)
Name	Company	Catalog Number	Comments
hiPSC EB medium:
Knockout DMEM	Thermo-Fisher	10829-018	(Step 2.1.7)
Knockout Serum Replacement (KOSR)	Thermo-Fisher	10828-028	20% final concentration (Step 2.1.7)
Non-Essential Amino Acids	Thermo-Fisher	11140-035	(Step 2.1.7)
Penicillin/Streptomycin	Thermo-Fisher	15140-122	50 U/mL final concentration (Step 2.1.7)
L-Glutamine 200 mM Solution	Thermo-Fisher	25030-081	2 mM final concentration (Step 2.1.7)
β-Mercaptoethanol	Thermo-Fisher	31350-010	50 µM final concentration (Step 2.1.7)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Complete neuroepithelial induction medium (NRI):
DMEM/F12	Thermo-Fisher	3133-038	(Step 2.3.1)
Non-Essential Amino Acids	Thermo-Fisher	11140-035	(Step 2.3.1)
N2 Supplement	Thermo-Fisher	17502-048	(Step 2.3.1)
Penicillin/Streptomycin	Thermo-Fisher	15140-122	50 U/mL final concentration (Step 2.3.1)
Heparin Grade I-A, ≥180 USP units/mg	Sigma-Aldrich	H3149-100KU	2 µg/ml final concentration (Step 2.3.1)
bFGF	Thermo-Fisher	13256-029	20 ng/ml final concentration added before use (Step 2.3.1)
Matrigel Basement Membrane Matrix	Corning	354234	1:100 (Step 2.2). Thaw Matrigel on ice, prepare 200 ul aliquots and store them in -80°C. For coating, dilute 200 ul aliquot in 20 ml of cold DMEM/F12 medium.
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	1:100 (Step 2.2). Dilute in PBS 1X.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Complete Neuronal Differentiation medium (ND):
Neurobasal Medium	Thermo-Fisher	21103049	(Step 2.4.11)
B-27 Supplements (50x)	Thermo-Fisher	17504044	(Step 2.4.11)
N2 Supplement	Thermo-Fisher	17502-048	(Step 2.4.11)
Penicillin/Streptomycin	Thermo-Fisher	15140-122	50 U/mL final concentration (Step 2.4.11)
GDNF	Thermo-Fisher	PHC7045	1 ng/ml final concentration. Added before use. (Step 2.4.11)
BDNF	Thermo-Fisher	PHC7074	2.5 ng/ml final concentration. Added before use. (Step 2.4.11)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Neural induction medium (NI):
DMEM/F12	Thermo-Fisher	3133-038	(Step 3.3)
Non-Essential Amino Acids	Thermo-Fisher	11140-035	(Step 3.3)
N2 Supplement	Thermo-Fisher	17502-048	(Step 3.3)
Penicillin/Streptomycin	Thermo-Fisher	15140-122	50 U/mL final concentration (Step 3.3)
Heparin Grade I-A, ≥180 USP units/mg	Sigma-Aldrich	H3149-100KU	2 µg/ml final concentration (Step 3.3)
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A	Thermo-Fisher	12587010	(Step 3.3)
L-Glutamine 200 mM Solution	Thermo-Fisher	25030-081	2 mM final concentration (Step 3.3)
bFGF	Thermo-Fisher	13256-029	10 ng/ml final concentration. Added before use (Step 3.3)
EGF	Thermo-Fisher	PHG6045	10 ng/ml final concentration. Added before use (Step 3.3)
BDNF	Thermo-Fisher	PHC7074	2.5 ng/ml final concentration. Added before use (Step 3.3)
Defined Trypsin Inhibitor (DTI)	Thermo-Fisher	R007-100	Pre-warm at 37°C. Add an equal amount of DTI to Trypsin-EDTA (Step 3.10)
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	Thermo-Fisher	15400054	1:10. Dilute Trypsin-EDTA in PBS 1x (without calcium and magnesium), pre-warm the solution at 37°C (Step 3.8)
CryoStor cell cryopreservation medium	Sigma-Aldrich	C2874-100ML	(Step 4.2)
Trypan Blue (0.4%)	Sigma-Aldrich	T8154-100ML	multiple manufacturers/suppliers
Name	Company	Catalog Number	Comments
TaqMan Probesets and reagents for gene expression analysis:
RNAqueous-Micro kit	Thermo-Fisher	AM1931	(Step 5.1.6)
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits	Thermo-Fisher	4368814
TaqMan Gene Expression Master Mix	Thermo-Fisher	4369016
GFAP	Thermo-Fisher	Hs00909233_m1
MAP2	Thermo-Fisher	Hs00258900_m1
NQO1	Thermo-Fisher	Hs02512143_s1
SRXN1	Thermo-Fisher	Hs00607800_m1
HMOX1	Thermo-Fisher	Hs01110250_m1
GSR	Thermo-Fisher	Hs00167317_m1
PAX6	Thermo-Fisher	Hs01088112_m1
NES	Thermo-Fisher	Hs00707120_s1
GRIA1	Thermo-Fisher	Hs00181348_m1
GAP43	Thermo-Fisher	Hs00967138_m1
GABRA3	Thermo-Fisher	Hs00968132_m1
GABRA1	Thermo-Fisher	Hs00168058_m1
NR4A2	Thermo-Fisher	Hs00428691_m1
TH	Thermo-Fisher	Hs00165941_m1
GAPDH	Thermo-Fisher	Hs02758991_g1
ACTB	Thermo-Fisher	Hs99999903_m1
MAPT	Thermo-Fisher	Hs00902194_m1
SYP	Thermo-Fisher	Hs00300531_m1
NANOG	Thermo-Fisher	Hs04260366_g1
POU5F1 (OCT4)	Thermo-Fisher	Hs04195369_s1
SOX1	Thermo-Fisher	Hs01057642_s1
AFP	Thermo-Fisher	Hs00173490_m1
KRT18	Thermo-Fisher	Hs01941416_g1
NPPA	Thermo-Fisher	Hs00383230_g1
T	Thermo-Fisher	Hs00610080_m1
NCAM1	Thermo-Fisher	Hs00941821_m1
NR4A1	Thermo-Fisher	Hs00374226_m1
PHOX2A	Thermo-Fisher	Hs00605931_mH
PHOX2B	Thermo-Fisher	Hs00243679_m1
NARG2	Thermo-Fisher	Hs00973298_g1
SLC18A3	Thermo-Fisher	Hs00268179_s1
SLC5A7	Thermo-Fisher	Hs00222367_m1
ISL1	Thermo-Fisher	Hs00158126_m1
LHX3	Thermo-Fisher	Hs01033412_m1
TaqMan Human Protein Kinase Array	Thermo-Fisher	4418721
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies and reagents for immunostaining:
B-III-tubulin (Tuj1)	Covance	MMS-435P	1:500 (Step 5.2.5). Other antibodies may also be used.
MAP2	Sigma Aldrich	M4403	1:500
NF200	Sigma Aldrich	N4142	1:1000
GFAP	Acris Antibodies GmbH	AP02002SU-N	1:500
Nestin	Sigma-Aldrich	N5413	1:200
synaptophysin (SYN)	Abcam	AB14692	1:200
Tau	Thermo-Fisher	MA5-12808	1:100
Nrf2	Abcam	AB62352	1:200
Keap1	Abcam	AB66620	1:200
sulfiredoxin1 (SRXN1)	Abcam	AB92298	1:200
NAD(P)H quinone oxidoreductase 1 (NQO1)	Abcam	AB2346	1:200
OCT4	Millipore	MAB4401	1:100
SSEA3	Millipore	MAB4303	1:100
Tra1-60	Millipore	MAB4360	1:250
Tyrosine hydroxylase (TH)	Millipore	AB152	1:200
Gamma-aminobutyric acid (GABA)	Sigma-Aldrich	A0310	1:100
Vesicular glutamate transporter 1 (VGlut1)	Abcam	AB72311	1:500
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	4% (4% formaldehyde can also be used)
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo-Fisher	14190144
Triton-X-100 Solution	Sigma-Aldrich	93443-100ML	0.1%
BSA 35%	Sigma-Aldrich	A7979-50ML	3.5%
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody, DyLight 594 conjugate	Thermo-Fisher	SA5-10040	1:500. (Step 5.2.7) Other fluorochrome-conjugated secondary antibodies may also be used. In this case, appropriate dilutions should be tested by the enduser.
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody, DyLight 488 conjugate	Thermo-Fisher	SA5-10166	1:500
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody, DyLight 488 conjugate	Thermo-Fisher	SA5-10086	1:500
DAPI Solution (1 mg/ml)	Thermo-Fisher	62248	1:1000 (Step 5.2.7)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies for Reverse Phase Protein Array (RPPA):
4E-BP1 (S65)	Abcam	AB81297	1:250 (Note after step 5.2.8)
Akt (T308)	Cell Signaling	9275	1:100
Akt (S473)	Cell Signaling	9271	1:100
AMPKalpha (T172)	Cell Signaling	2531	1:100
AMPKbeta1 (S108)	Cell Signaling	4181	1:100
ATF-2 (T71)	Cell Signaling	9221	1:100
c-Jun (S63)	Cell Signaling	9261	1:200
c-Jun (S73)	Cell Signaling	9164	1:200
c-Kit (Y719)	Cell Signaling	3391	1:250
CREB (S133)	Cell Signaling	9191	1:100
EGFR (Y1068)	Cell Signaling	2234	1:50
ErbB2/HER2 (Y1248)	Cell Signaling	2247	1:100
ERK 1/2, p44/42 (T202/Y204)	Cell Signaling	9101	1:2000
GSK-3alpha (S21)	Cell Signaling	9337	1:50
Jak1 (Y1022/1023)	Cell Signaling	3331	1:100
Lck (Y505)	Cell Signaling	2751	1:500
LKB1 (S428)	Cell Signaling	3051	1:100
mTOR (S2448)	Cell Signaling	5536	1:100
NFkB p65 (S536)	Cell Signaling	3031	1:50
p70 S6 Kinase (T389)	Cell Signaling	9205	1:200
PDK1 (S241)	Cell Signaling	3061	1:100
PKA C (T197)	Cell Signaling	4781	1:250
PRAS40 (T246)	BioSource	44-1100	1:2000
PTEN (S380)	Cell Signaling	9551	1:500
Smad1 (S463/465), Smad5 (S463/465), Smad8 (S426/428)	Cell Signaling	9511	1:500
Src (Y527)	Cell Signaling	2105	1:500
Src Family (Y416)	Cell Signaling	2101	1:200
Stat1 (Y701)	Cell Signaling	9171	1:200
Stat3 (S727)	Cell Signaling	9134	1:200
Zap-70 (Y319)	Enogene	E011159	1:100
βCatenin (S33/37/T41)	Cell Signaling	9561	1:250
CREB	Upstate Biotechnologies	06-863	1:100
Fos B	Cell Signaling	2251	1:200
GRB2	Cell Signaling	3972	1:2000
HSP70	Stressgen	SPA-810	1:100
c-Jun	Cell Signaling	9165	1:100
Kip1/p27	BD	610241	1:100
Lck	Cell Signaling	2984	1:250
Mcl-1	Cell Signaling	4572	1:80
Musashi	Cell Signaling	2154	1:100
NOTCH1	Cell Signaling	3439	1:100
PTEN	Cell Signaling	9552	1:500
SGK1	Abnova	PAB4590	1:250
Zap-70	Cell Signaling	2705	1:250
β-Catenin	Abcam	AB32572	1:1000
Dll4	Abcam	AB7280	1:500
Shh	Abcam	AB53281	1:250
HIF-1α	BD	610958	1:50
NUMB PAN-ISO	Upstate Biotechnologies	07-207	1:400
NUMB-L	Chemicon	AB15145	1:750
Cyclin B	BD	610220	1:75
c-Myc	Calbiochem	OP-10	1:100
BCIP/NBT Kit	Thermo-Fisher	002209	(Note after step 5.2.8). Kit used to measure alkaline phosphatase activity, similar kits can be used.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies for Flow Cytometry:
SSEA1 Antibody, Pacific Blue conjugate	Thermo-Fisher	MHCD1528	1:100 (Note after step 5.2.8)
SSEA4 Antibody (MC813-70), Alexa Fluor 647	Thermo-Fisher	SSEA421	1:100
Name	Company	Catalog number	Comments
Specific instruments, tools and softwares:
Countess Automated Cell Counter	Thermo-Fisher	C10227	Neubauer chamber or other suitable glass hemocytometer can be used.
MEA1060-Inv-BC	Multichannel Systems	MEA1060-Inv-BC	(Step 5.3)
MEA1060-BC control software	Multichannel Systems	MEA1060-BC	(Step 5.3)
NeuroExplorer	Multichannel Systems	NeuroExplorer (NE)	(Step 5.3) For post-processing of MEA data
Multielectrode arrays (MEA)	Multichannel Systems	60MEA100/10iR-Ti-gr	(Step 5.3) Single-well MEA chip
ArrayScan XTI High Content Platform	Thermo-Fisher	ASN00002P	(Step 5.2.8) Mean fluorescence can be quantified by using specific ArrayScan algorithms (e.g., Cytotoxicity V.4 and NucTrans V.4 bioapplications). It is recommended to take minimum 20 pictures/well, and have 7-8 internal replicates per condition
7900HT Fast Real-Time PCR System	Thermo-Fisher	4351405	(Step 5.1.6)
BD ULTRA-FINE Needle Insulin Syringe (with 30G needle)	BD	328280	(Steps 1.3.1, 2.1.2, and 2.4.1)
StemPro EZPassage Disposable Stem Cell Passaging Tool	ThermoFisher	23181010	This colony cutting tool can be used as an alternative to the use of 30G needle 1 mL syringes (Step 1.3.1)
Ultra-Low attachment Petri dish (60 mm)	Corning	10010582	(Step 2.1.8) Also other brands can be used.
Mr. Frosty Freezing container	Sigma-Aldrich	C1562-1EA