JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

والمستغلة نظم التعبير خلية الحشرات Nonlytic لإنتاج الخلوية الاتجار / الترجمة، والتحليل الوظيفي البروتين المؤتلف. هنا، نحن تصف وسائل لتوليد ناقلات التعبير ولاحق بروتين تعبير عابر في خطوط الخلايا حرشفية الأجنحة المتاحة تجاريا. سيعرض أيضا شارك في توطين aquaporins الذبابة البيضاء Bemisia مع البروتينات علامة فلوري التحت خلوية.

Abstract

وتستخدم أنظمة بروتين تعبير مغاير لإنتاج البروتينات المؤتلف، تفسير الخلوي الاتجار / توطين، وتحديد الوظائف الكيميائية الحيوية للبروتينات في المستوى دون العضوي. على الرغم من أن أنظمة الفيروسة العصوية التعبير وتستخدم على نحو متزايد لإنتاج البروتين في العديد من التكنولوجيا الحيوية والأدوية، والتطبيقات الصناعية، وأنظمة nonlytic التي لا تنطوي عدوى فيروسية لها فوائد واضحة ولكن غالبا ما يتم التغاضي وغير المستغلة. هنا، نحن تصف طريقة لتوليد ناقلات التعبير nonlytic وعابرة تعبير البروتين المؤتلف. يسمح هذا البروتوكول لتوطين الخلوية كفاءة من البروتينات المؤتلف، ويمكن استخدامها لتمييز بسرعة الاتجار البروتين داخل الخلية. نقدم لك مجموعة من التعبير عن أربعة بروتينات المؤتلف في خط خلية الحشرات المتاحة تجاريا، بما في ذلك اثنين من البروتينات aquaporin من الذبابة البيضاء Bemisia الحشرات، فضلاكما البروتينات علامة التحت خلوية محددة لغشاء الخلية البلازما والخلايا الجسيمات الحالة. تم إنتاج جميع البروتينات المؤتلف كما الوهم مع علامات بروتين فلوري في ترميني الكربوكسيل، والتي تسمح للكشف المباشر من البروتينات المؤتلف. ترنسفكأيشن مزدوج من الخلايا مع البلازميدات إيواء بنيات للجينات من الاهتمام وعلامة التحت خلوية تعرف يسمح لتصوير الخلايا الحية وتحسين التحقق من توطين البروتين الخلوي.

Introduction

إنتاج البروتينات المؤتلف باستخدام نظم التعبير خلية الحشرات يقدم العديد من الفوائد لدراسة البروتينات حقيقية النواة. وهي خلايا الحشرات تمتلك تعديلات مماثلة بعد متعدية، وتجهيز، وآليات فرز مثل تلك الموجودة في خلايا الثدييات، وهو مفيد لإنتاج البروتينات مطوية بشكل صحيح 1 و 2 و 3. كما تتطلب نظم خلايا الحشرات عادة موارد أقل وأقل وقت وجهد للصيانة من خطوط الخلايا الثديية 4 و 5. نظام التعبير الفيروسة العصوية هو واحد مثل هذا النظام القائم على خلية الحشرات التي تستخدم الآن على نطاق واسع في العديد من التخصصات، بما في ذلك إنتاج البروتينات المؤتلف لتوصيف البروتين والعلاجات، وعرض مناعة من الببتيدات الخارجية والبروتينات الفيروسية لإنتاج اللقاحات، تركيب متعددة المجمعات -protein، وإنتاج البروتينات الغليكوزيلاتي، الخ. 1، 2، 4، 6. هناك، ومع ذلك، الحالات التي قد لا يكون التعبير الفيروسة العصوية ينطبق 3 و 7، واستخدام نظم التعبير الحشرات nonlytic وعابرة قد تكون أكثر ملاءمة. على وجه التحديد، عابرة التعبير خلية الحشرات توفر إمكانية لتركيب السريع للبروتين المؤتلف، ويتطلب أقل تطوير وصيانة، لا تنطوي على الفيروسية التي فرضتها تحلل الخلية، ويوفر وسيلة لدراسة أفضل الاتجار الخلوي أثناء تخليق البروتين 7، 8، 9، 10.

يصف هذا البروتوكول الجيل السريع للناقلات التعبير باستخدام خطوتين تمديد تداخل PCR (OE-PCR) (11) والاستنساخ القياسية من DNA البلازميد في القولونية. يتم استخدام البلازميدات إلى المزدوج transfect خلايا الحشرات مثقف المتاحة تجاريا وتنتج البروتينات التمثيلية. يصف بروتوكول إنتاج واستخدام اثنين من البروتينات المختلفة علامة التحت خلوية fluorescently المسمى ويوضح colocalization مع اثنين من البروتينات aquaporin من الذبابة البيضاء Bemisia الحشرات. وينص البروتوكول بعد المنهجية الأساسية لOE-PCR، الحشرات صيانة الخلية وترنسفكأيشن، والفحص المجهري مضان لتوطين الخلوية من البروتينات المستهدفة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. OE-PCR لتشييد البلازميدات التعبير

ملاحظة: انظر الجدول رقم 1 لجميع الاشعال المستخدمة في OE-PCR. فمن المستحسن استخدام عالية الدقة البلمرة DNA لجميع التكبير. ومع ذلك، لأن هذه الإنزيمات في كثير من الأحيان لا يترك 3 "A، فمن الضروري إجراء جيزة، وعدم تضخيم الحضانة مع البلمرة طق DNA إلى" A-ذيل "منتجات PCR قبل استنساخ لهم في التعبير TA خلية الحشرات قوه موجهة. يوضح هذا البروتوكول وسيلة لتوليد البلازميدات التعبير الحشرات إيواء البروتينات خيالية، مع البروتينات الفلورية تنصهر في الإطار إلى محطة الكربوكسيل من الجينات ذات الاهتمام (في هذه الحالة، لاثنين من الذبابة البيضاء aquaporin البروتينات Bemisia) أو البروتينات علامة التحت خلوية (الشكل 1).

  1. استخدام OE-PCR، الذي يتكون من جولتين مستقلة من التضخيم، لتوليد: (1) تسلسل ترميز الجينات ذات الاهتمام (B. الذبابة البيضاءaquaporin 1: BtDrip1. B. aquaporin الذبابة البيضاء 2: BtDrip2_v1) تنصهر في الإطار مع متغير البروتين الفلوري الأخضر تسمى EGFP أو (2) علامات التحت خلوية (ذبابة الفاكهة الجنس الببتيد مستقبلات: DmSPR، الانسان العاقل فسفوليباز A2: HsPLA2) مع الترميز تسلسل mCherry. مباشرة ligate النهائية المنتجات OE-PCR في البلازميد PIB / V5-صاحب-TA.
    1. للجولة الأولى من OE-PCR (المشار إليها AD وA'-D 'في الشكل 1)، واستخدام الحس التمهيدي جين معين (كما هو موضح بالخط العريض في الجدول 1) والتمهيدي العقاقير خيالية (مائل في الجدول 1) المقابلة إلى 15 نقطة أساس النهائي (بدون توقف كودون) من الجين / علامة التحت خلوية وإلى 15 سنة مضت من نهاية 5'من البروتين الفلوري المطلوب (EGFP أو mCherry) لإنشاء المنتج مع 'عبء 3.
      ملاحظة: انظر الجدول رقم 2 للظروف PCR.
    2. في أنبوب منفصل، واستخدام الجينات specifجيم الفلورسنت التمهيدي بروتين العقاقير (كما هو موضح مع تسطير في الجدول 1) والتمهيدي شعور وهمي أن يحتوي على 15 سنة مضت من نهاية 3'من الجينات في المصالح / علامة التحت خلوية و 15 نقطة أساس من نهاية 5'من الفلورسنت المطلوب البروتين لتوليد منتج مع 'عبء 5.
      ملاحظة: انظر الجدول رقم 2 لظروف PCR. القالب PCR يمكن أن تكون إما منتج PCR-التحقق من صحة تسلسل أو أكثر ويفضل، DNA البلازميد إيواء التسلسل المطلوب. دراسة الموصوفة هنا يستخدم البلازميدات-التحقق من صحة التسلسل.
    3. فصل المنتجات PCR مع 1٪ الاغاروز الكهربائي للهلام (باستخدام معيار الاغاروز الصف الجزيئية).
    4. المكوس وتنقية المنتجات من أحجام المتوقعة (انظر الجدول 2) باستخدام المتاحة تجاريا عدة استخراج الهلام DNA (انظر جدول المواد لعدة المحددة المستخدمة في هذا البروتوكول).
    5. استخدام المنتجات PCR هلام تنقية من الخطوة 1.1.4 لتوليد تداخل ه النهائيمنتجات XTENSION (المشار إليها A '' - D '' في الشكل 1). استخدام الحس التمهيدي الجينات المحددة للالجين / علامة التحت خلوية والمقابلة الجينات المحددة العقاقير التمهيدي للبروتين فلوري لتوليد تسلسل خيالية المطلوب.
      ملاحظة: انظر الجدول رقم 2 لظروف PCR. قد يكون من الضروري لتحديد تجريبيا المبالغ المثلى من الدور الاول لمنتجات تمديد التداخل إضافة إلى خليط التفاعل لانتاج النهائي، كامل طول المنتج PCR خيالية.
    6. فصل الدور الثاني المنتجات OE-PCR بنسبة 1٪ الاغاروز الكهربائي للهلام. المكوس وتنقية المنتجات باستخدام المتاحة تجاريا هلام DNA عدة الاستخراج.
    7. احتضان الجولة الثانية من المنتجات OE-PCR هلام تنقية مع 1 وحدة من طق DNA مزيج الرئيسي البلمرة لمدة 10 دقيقة في 72 درجة مئوية لتوليد "adenylated (أي والذيل) منتجات 3 اللازمة لTA الاستنساخ.
    8. Ligate المنتجات adenylated الناتجة في ناقلات التعبير PIB واستخدام تقنيات الاستنساخ الجزيئي القياسية لتحويل (الصدمة الحرارية) أو electrocompetent (Electroporation لل) خلايا القولونية المختصة كيميائيا. بين عشية وضحاها لوحة في المتوسط تحتوي على علامة الاختيار المناسب (أي الأمبيسلين أو كربنيسيلين).
    9. أداء مستعمرة PCR 12 باستخدام التمهيدي ناقلات محددة والتمهيدي إدراج محددة لتحديد المستعمرات إدراج الإيجابية التي تم تحويلها مع البلازميدات التعبير إيواء إدراج في الاتجاه 5'-3. إعداد الثقافات بين عشية وضحاها من المستعمرات توليد منتجات PCR من أحجام المتوقع.
    10. عزل DNA البلازميد باستخدام المتاحة تجاريا عدة تنقية الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (انظر الجدول مواد لعدة المحددة المستخدمة في هذا البروتوكول). التحقق من سلامة تسلسل إدراج كل من تسلسل الحمض النووي المباشر.

= "jove_title"> 2. صيانة زراعة الخلايا الحشرات

ملاحظة: للحفاظ على ظروف معقمة، وإجراء جميع التلاعب الخلية التي تتطلب فتح قارورة زراعة الأنسجة داخل غطاء تدفق الصفحي. بدوره على تدفق الصفحي غطاء مصباح الأشعة فوق البنفسجية مبيد للجراثيم لا يقل عن 1 ساعة قبل التلاعب الخلية. ارتداء قفازات النتريل وتطهير السطح من على مقاعد البدلاء، الماصات، والأواني، وأنابيب، وقوارير مع الايثانول 70٪ قبل استخدامها. ويوصى الألفة مع تقنيات زراعة الخلايا الأساسية (13).

  1. استخدام الخلايا المستثمر الوطني (خط زراعة الخلايا أنشئت المستمدة من Trichoplusia أنسجة المبيض ني) التي يتم تكييفها والمتوسطة خالية من المصل والمحافظة عليها باعتبارها ثقافة أحادي الطبقة ملتصقة في وسط الحشرات خالية من المصل عند 28 درجة مئوية في T25 قوارير زراعة الأنسجة.
  2. الحفاظ على خلايا Sf9 (خط زراعة الخلايا أنشئت المستمدة من ورق القطن frugiperda أنسجة المبيض) بالمثل ولكن باستخدام تنم-FH الثقافة الحشرات ملحق المتوسطإد مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS).
  3. البذور ثقافة الأولية من Sf9 المجمدة أو خلايا القوات المسلحة عن طريق إزالة قارورة الأسهم من -80 ° C والسماح لهم لذوبان الجليد في حمام مائي 37 ° C. تطهير قوارير مع الايثانول 70٪ بعد ذوبان الجليد ووضعها على الجليد.
  4. إضافة 4 مل من المتوسط ​​خلية الحشرات إلى قارورة T25 الجديدة ونقل 1 مل من تعليق خلية الحشرات إذابة. ضع قارورة في 28 ° C، حاضنة غير ترطيب وتسمح للخلايا لنعلق ل30-45 دقيقة.
  5. استبدال المتوسطة البذر مع 5 مل من المتوسط ​​المناسب ونقل قوارير إلى 28 درجة مئوية الحاضنة غير مرطب. مراقبة التقاء خلية يوميا. مرور الخلايا عندما تصل إلى 90٪ confluency.
    ملاحظة: تغطية كاملة للT25 قارورة يناظر ~ 5 × 10 6 خلايا.
  6. مرور خلية الحشرات.
    1. لمرور الخلايا، أولا إزالة المتوسطة استنفدت من القارورة التي تحتوي على خلايا متكدسة باستخدام معقمة 5 مل ماصة المصلية.إمالة قارورة بحيث يتدفق على المديين المتوسط ​​وزاوية واحدة، بعيدا عن أحادي الطبقة الخلية. بعناية إزالة المتوسطة باستخدام ماصة دون إزعاج الخلايا.
    2. إزاحة الخلايا القوات المسلحة من قبل الشطف بلطف قوارير T25 التي تحتوي على أحادي الطبقة متموجة مع 4 مل من مصل الدم خالية من الحشرات متوسطة باستخدام جديدة، عقيمة، 5 مل ماصة المصلية. نقل معلومات سرية ماصة عبر قارورة وري ببطء لإزالة الخلايا فضفاضة يعلق إلى أسفل القارورة.
      1. التحقق من وجود مفرزة كافية من الخلايا عن طريق إزالة جميع وسائل الإعلام، وتحول القارورة أكثر، وأشار إلى أن الجزء السفلي من القارورة واضح.
    3. لخلايا Sf9، التي تلتزم أكثر إحكاما، إضافة 4 مل من الطازجة المتوسطة تنم-FH واستخدام مكشطة خلية لطرد الخلايا المرفقة. استخدام ماصة المصلية 5 مل إلى المزيج بلطف والحد من تراكمها الخلية.
    4. استخدام عداد الخلايا الآلي لتقدير عدد الخلايا الحشرات قابلة للحياة في حجم متوسط. نقل 0.1 مل من خلية / خليط المتوسط ​​إلى 1.5 ملmicrofuge أنبوب. في 0.5 مل microfuge أنبوب منفصل، إضافة 10 ميكرولتر من خلية / خليط المتوسط ​​إلى 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق.
    5. إزالة خلية مكافحة غرفة شريحة من التعبئة والتغليف، وإضافة 10 ميكرولتر من خلية / متوسطة / خليط الأزرق التريبان على كل جانب من الشريحة العد. إدراج الشريحة في مكافحة الخلايا وتحديد كثافة الخلايا وقدرتها على البقاء.
    6. باستخدام كثافة الخلايا، وحساب وإضافة الحجم المناسب المتوسطة خلية الحشرات (حتى 5 مل) ل، قوارير T25 جديدة معقمة.
    7. نقل حوالي 1-1.5 × 10 6 خلايا لقوارير T25 مع وسائل الاعلام العذبة؛ تسمية قوارير مع خط الخلية والتاريخ والوسيلة المستخدمة، وعدد من خلايا المضافة، وعدد مرور (P ن + 1 جيل، حيث P n هو رقم مرور للجيل السابق من الخلايا). ووضع قوارير في 28 ° C حاضنة لمدة تصل إلى 72 ساعة.
      ملاحظة: خلايا الحشرات يمكن نشر بشكل مستمر، على الرغم من أن الخلايا قد تكون أقل تقبلا لترنسفكأيشن و / أو أجنبي المنشأتعبير البروتين بعد 30 الممرات. علاج جميع التخلص منها خلايا / وسائل الإعلام مع 10٪ من محلول التبييض وتعقيم الأدوات البلاستيكية قبل التخلص منها.

3. الحشرات ترنسفكأيشن الخلية

  1. البذور قارورة T25 مع ما يصل إلى 1 × 10 6 القوات المسلحة أو Sf9 الخلايا في وسيلة خلية الحشرات المناسب (المصل خالية المتوسطة الحشرات عن القوات المسلحة وتنم-FH لSf9) وتنمو لconfluency لمدة 72 ساعة عند 28 ° C.
  2. إزالة والتخلص من متوسط ​​العمر وطرد الخلايا مع 4 مل من الطازجة المتوسطة الحشرات خالية من المصل (انظر الخطوات 2.6.2 و2.6.3 أعلاه).
  3. تقدير كثافة الخلية باستخدام عداد الخلية الآلي (راجع الخطوة 2.6.4 أعلاه).
  4. أضف حوالي 7 × 10 5 الخلايا لأطباق الزجاج السفلي 35 مم الفردية وتسمح للخلايا لنعلق لمدة 20-25 دقيقة في 28 ° C.
  5. لكل ترنسفكأيشن، إضافة 2 ميكروغرام من البلازميد (إما من البلازميد واحد لتعداء واحد أو 2 ميكروغرام من كل اثنين من البلازميدات للتأليفتعداء uble) إلى 0.1 مل من المصل خالية المتوسطة الحشرات (بدون FBS لكلا Sf9 وتعداء القوات المسلحة) في العقيمة 1.5 مل microfuge أنبوب.
  6. في أنبوب منفصل، مزيج 8 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن مع 0.1 مل من المتوسط ​​الحشرات خالية من المصل ومن ثم نقل هذا الحل إلى الأنبوب الذي يحتوي على DNA البلازميد من الاهتمام. بخفة دوامة واحتضانها في RT ل20 - 30 دقيقة.
  7. تمييع الخليط البلازميد ترنسفكأيشن من الخطوات 3.5 و 3.6 مع 0.8 مل من مصل الدم خالية من الحشرات متوسطة بحيث يساوي مجموع حجم 1 مل.
  8. إزالة بعناية وسائل الإعلام من الأطباق الزجاجية التي تحتوي على خلايا المرفقة. تراكب الخلايا المرفقة مع المتوسط ​​البلازميد ترنسفكأيشن المخفف.
  9. احتضان الخلايا عند 28 درجة مئوية لمدة 5 ساعات.
    ملاحظة: تتطلب شروط ترنسفكأيشن الأمثل التجريبية لكفاءة ترنسفكأيشن القصوى (على سبيل المثال، بين عشية وضحاها ترنسفكأيشن بدلا من 5 ساعات، وكمية DNA البلازميد المستخدمة، والكيمياء كاشف ترنسفكأيشنوتستخدم، الخ.).
  10. إزالة والتخلص من المتوسطة ترنسفكأيشن وغسل بلطف الخلايا مع 1 مل من المتوسط ​​الحشرات خالية من المصل، والحرص على عدم طرد الخلايا.
  11. إضافة 2 مل من المتوسط ​​خلية الحشرات الطازجة (المصل خالية المتوسطة الحشرات عن القوات المسلحة وتنم-FH لSf9)، واحتضان عند 28 درجة مئوية لمدة 48-72 ساعة.
    ملاحظة: مرة أخرى، وظروف تتطلب التحسين التجريبية للتعبير البروتين مغاير القصوى.

4. متحد البؤر مضان المجهر

  1. في 48-72 ساعة بعد ترنسفكأيشن، وغسل خلايا مرة واحدة مع 1 مل من IPL-41 متوسطة الحشرات ومن ثم تغطية مع 2 مل من IPL-41 للتصوير.
    ملاحظة: هذه الخطوة غسل يقلل الخلفية لصناعة السيارات في مضان احظ مع المتوسط ​​خلية الحشرات المستخدمة في صيانة الخلايا العادية.
  2. إضافة 4 قطرات من هويشت الخلية الحية تلطيخ كاشف (انظر جدول المواد للوصمة عار النووية المحددة المستخدمة في هذا البروتوكول) إلى المتوسطة واحتضان عند 28 درجة مئوية لمدة 20-25 دقيقة.
    ملاحظة: مجلس التوحيد الوطنى إضافيةقد تكون بديلا البقع لير، على الرغم من الصبغة يجب أن يكون لمحة مضان فريد من EGFP وmCherry.
  3. وضع طبق 35 مم في المغلقة النفس المسح بالليزر المجهر متحد البؤر (انظر جدول المواد للأداة المحددة المستخدمة في هذا البروتوكول).
  4. ضبط المجهر لشروط المراقبة هويشت، EGFP، وmCherry: هويشت الإثارة / الانبعاث - 359/461 نانومتر. EGFP الإثارة / الانبعاث - 489/510 نانومتر. mCherry الإثارة / الانبعاث - 580/610 نانومتر.
  5. إجراء المسح الأولي باستخدام الهدف 10X لتأكيد التعبير الفلورسنت ومن ثم التبديل إلى طريقة المسح الضوئي باستخدام الهدف النقيض الغمر بالمياه 60X المرحلة.
  6. ضبط قوة الليزر (5-7٪)، للكشف عن حساسية (47-49٪)، سرعة المسح الضوئي، وعمق Z المحور، وتقريب رقمي لتحسين تباين الصورة والقرار. صورة الخلايا في 1.5X تقريب رقمي لإعطاء مجموعه 90X التضخيم.
    ملاحظة: المعلمات مجهر تتطلب تعديل التجريبية لأفضلقد يكون جمع الصور ومحددة في الصك قيد الاستخدام.
  7. تصدير البيانات الخام وملفات الصور TIFF وتعديل (المحاصيل وتراكب) لتوليد الرقم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

OE-PCR

OE-PCR يسمح لتركيب المنتجات DNA خيالية ذلك، إدراج مرة واحدة في ناقلات التعبير، والسماح لإنتاج البروتينات خيالية المؤتلف الموافق أي الجينات اختبار المصالح والفلورسنت البروتين علامة. يمثل ا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

نظم بروتين تعبير مغاير هي أدوات هامة لإنتاج البروتينات المؤتلف استخدامها في العديد من التطبيقات المصب 4. اختيار من الأنظمة التعبير المتنوعة المتاحة يعتمد على الهدف النهائي للبروتين من الفائدة. تتوفر التي تقدم بدائل مرنة لأنظمة التعبير خلية بدائية النو?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgements

نشكر لين Forlow-JECH ودانيال ليري للحصول على المساعدة الفنية. وأيد هذا العمل من خلال تمويل قاعدة CRIS إلى USDA ARS، البرنامج الوطني 304 - حماية المحاصيل والحجر [مشروع # 2020-22620-022-00D] إلى JAF وJJH ذكر الأسماء التجارية أو المنتجات التجارية في هذه المقالة هي فقط لغرض توفير معلومات محددة ولا يعني توصية أو تأييد من وزارة الزراعة الأمريكية. USDA يساوي مزود الفرصة وصاحب العمل.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
KOD DNA PolymeraseEMD Millipore71085-3High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products
ExTaq DNA PolymeraseTaKaRa-ClontechRR001BDNA polymerase used for A-tailing of PCR products
EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master MixLucigen30033-1DNA polymerase used for bacterial colony PCR
Biometra TProfessional Gradient ThermocyclerBiometra/LABRepCo070-851
Agarose LEBenchmark ScientificA1705
SYBR Safe DNA Gel StainThermoFisherS33102
Montage DNA Gel Extraction KitEMD MilliporeLSKGEL050
pIB/V5-His TOPO TA Expression KitThermoFisherK89020Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution.
QIAprep Spin MiniPrep KitQiagen27104
QIAcube Robotic WorkstationQiagen9001292
Purifier Vertical Clean BenchLabconco3970401
Tni cultured insect cell LineAllele BiotechABP-CEL-10005
Sf9 cultured insect cell LineAllele BiotechABP-CEL-10002
Serum-Free Insect Culture MediumAllele BiotechABP-MED-10002
TNM-FH Insect Culture MediumAllele BiotechABP-MED-10001
IPL-41 Insect MediumThermoFisher11405081
Cellfectin II Transfection ReagentThermoFisher10362100
16 cm Disposable Cell ScrapersSarstedt83.1832Cell scrapers with two-position blade
25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter CapsLife Science ProductsCT-229331
Transfer PipetsFisher1371120
Sterile, 50 mL Bio-Reaction TubesLife Science ProductsCT-229475
PipetteBoyVWR14222-180
5 mL Serological PipettesSarstedt86.1253.001
0.5 mL Flat-Cap PCR TubesFisher14230200
Polypropylene Biohazard Autoclave BagsFisher01828C
35 mm #1.5 Glass Bottom DishesMatsunami GlassD35-14-1.5-U35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated
Incubator, Model 1510EVWR35823-961
Countess II FL Cell CounterThermoFisherAMQAF1000
Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue ReagentThermoFisherC10228
Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal MicroscopeOlympusFV10i-LIV
HsPLA2/pCS6 plasmid DNAtransOMIC TechnologiesTCH1303
pmCherry VectorClontech632522
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)ThermoFisherR37605

References

  1. Kost, T. A., et al. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).
  2. van Oers, M. M., et al. Thirty years of baculovirus-insect cell protein expression: from dark horse to mainstream technology. J. Gen. Virol. 96 (1), 6-23 (2015).
  3. Contreras-Gòmez, A., et al. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol. Progr. 30 (1), 1-18 (2014).
  4. Hunt, I. From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression. Protein Expres. Purif. 40 (1), 1-22 (2005).
  5. Kollewe, C., Vilcinskas, A. Production of recombinant proteins in insect cells. Am. J. Biochem. Biotechnol. 9 (3), 255-271 (2013).
  6. Altmann, F., et al. Insect cells as hosts for the expression of recombinant glycoproteins. Glycotechnology. Berger, E. G., Clausen, H., Cummings, R. D. , Springer. Boston, MA. 29-43 (1999).
  7. Shen, X., et al. A simple plasmid-based transient gene expression method using High Five cells. J. Biotechnol. 216, 67-75 (2015).
  8. Chen, H., et al. Rapid screening of membrane protein expression in transiently transfected insect cells. Protein Expres. Purif. 88 (1), 134-142 (2013).
  9. Shen, X., et al. Virus-free transient protein production in Sf9 cells. J. Biotechnol. 171, 61-70 (2014).
  10. Loomis, K. H., et al. InsectDirect System: rapid, high-level protein expression and purification from insect cells. J. Struct. Funct. Genomics. 6 (2), 189-194 (2005).
  11. Wurch, T., et al. A modified overlap extension PCR method to create chimeric genes in the absence of restriction enzymes. Biotechnol. Tech. 12 (9), 653-657 (1998).
  12. Woodman, M. E. Direct PCR of intact bacteria (colony PCR). Curr. Protoc. Microbiol. 9 (3), 1-6 (2008).
  13. Cell Culture Basics Handbook. , ThermoFisher Scientific. Available from: http://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics.html?cid=fl-cellculturebasics, Pub. no. MAN0002734 Rev A.0 (2014).
  14. Mathew, L. G., et al. Identification and characterization of functional aquaporin water channel protein from alimentary tract of whitefly, Bemisia tabaci. Insect Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 178-190 (2011).
  15. Van Ekert, E., et al. Molecular and functional characterization of Bemisia tabaci aquaporins reveals the water channel diversity of hemipteran insects. Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 39-51 (2016).
  16. Hull, J. J., Brent, C. S. Identification and characterization of a sex peptide receptor-like transcript from the western tarnished plant bug Lygus hesperus. Insect Mol. Biol. 23 (3), 301-319 (2014).
  17. Maroniche, G. A., et al. Development of a novel set of Gateway-compatible vectors for live imaging in insect cells. Insect Mol. Biol. 20 (5), 675-685 (2011).
  18. Hull, J. J., et al. Identification of the western tarnished plant but (Lygus hesperus) olfactory co-receptor ORCO: Expression profile and confirmation of atypical membrane topology. Arch. Insect Biochem. 81 (4), 179-198 (2012).
  19. Lee, J. M., et al. Re-evaluation of the PBAN receptor molecule: Characterization of PBANR variants expressed in the pheromone glands of moths. Front. Endocrinol. 3 (6), 1-12 (2012).
  20. Fabrick, J. A., et al. Molecular and functional characterization of multiple aquaporin water channel proteins from the western tarnished plant bug, Lygus hesperus. Insect Biochem. Mol. Biol. 45, 125-140 (2014).
  21. Lu, M., et al. A baculovirus (Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus) repeat element functions as a powerful constitutive enhancer in transfected insect cells. J. Biol. Chem. 272, 30724-30728 (1997).
  22. Ren, L., et al. Comparative analysis of the activity of two promoters in insect cells. African J. Biotechnol. 10, 8930-8941 (2011).
  23. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
  24. Kohnhorst, C. L., et al. Subcellular functions of proteins under fluorescence single-cell microscopy. Biochim. Biophys. Acta. 1864, 77-84 (2016).
  25. Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. Recent advances in quantitative colocalization analysis: focus on neuroscience. Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).
  26. Shaner, N. C., et al. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  27. Chalfie, M., et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  28. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotech. 22 (12), 1567-1572 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

122 Trichoplusia frugiperda Sf9 Bemisia aquaporin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved