Expresión transitoria y localización celular de proteínas recombinantes en células cultivadas de insectos

Resumen

Nonlytic sistemas de expresión de células de insectos están infrautilizados para la producción, celular tráfico / localización, y el análisis funcional de proteínas recombinantes. A continuación, describimos métodos para generar vectores de expresión y la expresión de proteína transitoria posterior en líneas celulares de lepidópteros disponibles comercialmente. También se presenta la co-localización de las acuaporinas de Bemisia tabaci con proteínas marcadoras fluorescentes subcelulares.

Resumen

sistemas de expresión de proteína heteróloga se utilizan para la producción de proteínas recombinantes, la interpretación de celular tráfico / localización, y la determinación de la función bioquímica de las proteínas a nivel de sub-organismo. Aunque los sistemas de expresión de baculovirus se utilizan cada vez más para la producción de proteínas en numerosos biotecnológica, farmacéutica y aplicaciones industriales, sistemas nonlytic que no implican infección viral tiene evidentes ventajas, pero a menudo se pasa por alto y poco utilizados. A continuación, describimos un método para generar vectores de expresión nonlytic y expresión de la proteína recombinante transitoria. Este protocolo permite la localización celular eficiente de proteínas recombinantes y se puede utilizar para discernir rápidamente el tráfico de proteínas dentro de la célula. Mostramos la expresión de cuatro proteínas recombinantes en una línea de células de insecto disponibles comercialmente, incluyendo dos proteínas de acuaporina del insecto Bemisia tabaci, asícomo proteínas marcadoras subcelulares específicos para la membrana plasmática de la célula y para lisosomas intracelulares. Todas las proteínas recombinantes se produjeron como quimeras con marcadores de proteínas fluorescentes en sus extremos carboxilo, que permite la detección directa de las proteínas recombinantes. La doble transfección de células con plásmidos que albergan construcciones de los genes de interés y un marcador subcelular conocido permite para imágenes de células vivas y la mejora de validación de localización de la proteína celular.

Introducción

La producción de proteínas recombinantes utilizando sistemas de expresión de células de insectos ofrece numerosos beneficios para el estudio de proteínas eucarióticas. A saber, células de insectos poseen modificaciones similares después de la traducción, procesamiento, y los mecanismos de clasificación como los presentes en células de mamífero, lo que es ventajoso para la producción de proteínas correctamente plegadas ^{1, 2, 3.} Sistemas de células de insectos también típicamente requieren menos recursos y menos tiempo y esfuerzo para el mantenimiento de líneas celulares de mamífero ^{4, 5.} El sistema de expresión de baculovirus es un sistema basado en células de insectos de tal manera que ahora se utiliza ampliamente en muchas disciplinas, incluyendo la producción de proteínas recombinantes para la caracterización de proteínas y la terapéutica, la presentación inmunogénico de péptidos extraños y las proteínas virales para la producción de vacunas, la síntesis de múltiples complejos proteínicas, La producción de proteínas glicosiladas, etc. ^{1, 2, 4, 6.} Hay, sin embargo, situaciones en las que la expresión de baculovirus puede no ser aplicable ^{3, 7,} y el uso de sistemas de expresión de insectos nonlytic y transitorios pueden ser más apropiados. Específicamente, la expresión de células de insecto transitoria ofrece la posibilidad para la rápida síntesis de proteína recombinante, requiere menos desarrollo y mantenimiento, no implica la lisis celular viral impuesta, y proporciona un medio para estudiar mejor tráfico celular durante la síntesis de ^{7, 8, 9 proteínas, 10.}

Este protocolo describe la rápida generación de vectores de expresión utilizando extensión de solapamiento de dos etapas de PCR (OE-PCR) ^{11 y el estándar de clonación de ADN de plásmido en Escherichia coli. Los plásmidos se utilizan para doble transfectar células de insecto cultivadas comercialmente disponibles y para producir proteínas representativas. El protocolo describe la producción y el uso de dos proteínas marcadoras subcelular marcados con fluorescencia diferentes y demuestra colocalización con dos proteínas de acuaporina del insecto Bemisia tabaci. El siguiente protocolo proporciona la metodología básica para OE-PCR, insecto mantenimiento de las células y la transfección, y microscopía de fluorescencia para la localización celular de proteínas diana.}

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Protocolo

1. OE-PCR para la construcción de plásmidos de expresión

Nota: Véase la Tabla 1 para todos los cebadores utilizados en OE-PCR. El uso de una ADN polimerasa de alta fidelidad se recomienda para todas las amplificaciones. Sin embargo, debido a que estas enzimas con frecuencia no dejan un 3' A, es necesario realizar una breve no amplificar-incubación, con una ADN polimerasa Taq a productos 'A-cola' de la PCR antes de la clonación ellos en una expresión de células de insecto TA vector. Este protocolo demuestra un método para generar insectos plásmidos de expresión que alberga proteínas quiméricas, con las proteínas fluorescentes fusionados en marco al extremo carboxilo terminal de los genes de interés (en este caso, a dos tabaci acuaporina proteínas Bemisia) o a proteínas marcadoras subcelulares (Figura 1).

1. Utilice OE-PCR, que consta de dos rondas independientes de amplificación, para generar: (1) las secuencias que codifican los genes de interés (B. tabaciacuaporina 1: BtDrip1; B. tabaci acuaporina 2: BtDrip2_v1) fusionada en marco con una variante de proteína verde fluorescente llamado EGFP o (2) los marcadores subcelulares (Drosophila melanogaster sexo péptido receptor: DmSPR; Homo sapiens fosfolipasa A2: HsPLA2) con la secuencia de codificación mCherry. Directamente ligar los productos finales OE-PCR en el plásmido pIB / V5-His-TA.
   1. Para la primera ronda de OE-PCR (indicado por AD y A'-D' en la Figura 1), utilizar una imprimación de genes específicos de sentido (mostrado en negrita en la Tabla 1) y un cebador antisentido quimérico (en cursiva en la Tabla 1) que corresponde al 15 pb final (sin el codón de parada) del gen de interés / marcador subcelular y a 15 pb del extremo 5 'de la proteína fluorescente deseado (EGFP o mCherry) para generar un producto con un saliente 3' .
      Nota: Véase la Tabla 2 para las condiciones de PCR.
   2. En un tubo separado, utilice un gen-specific cebador antisentido proteína fluorescente (se muestra con un subrayado en la Tabla 1) y un cebador sentido quimérico que contiene 15 pb del extremo 3 'del gen de interés / marcador subcelular y 15 pb desde el extremo 5' de la fluorescente deseado proteína para generar un producto con una proyección en 5' .
      Nota: Véase la Tabla 2 para las condiciones de la PCR. La plantilla de PCR puede ser o bien un producto de PCR de secuencia validado o, más preferiblemente, el ADN plásmido que alberga la secuencia deseada. El estudio descrito aquí utiliza plásmidos de secuencia validada.
   3. Separar los productos de PCR con electroforesis en gel de agarosa al 1% (utilizando agarosa estándar de grado molecular).
   4. Impuestos Especiales y purificar los productos de los tamaños esperados (véase la Tabla 2) utilizando un kit de extracción en gel de ADN disponible comercialmente (ver la tabla de materiales para el kit específico utilizado en este protocolo).
   5. Usar los productos de PCR purificados en gel de la etapa 1.1.4 para generar la superposición e finalproductos XTension (indicadas por A '' - D '' en la Figura 1). Use un cebador sentido específico de gen para el gen de interés / marcador subcelular y el correspondiente cebador antisentido específico de gen para la proteína fluorescente para generar la secuencia quimérica deseada.
      Nota: Véase la Tabla 2 para las condiciones de la PCR. Puede ser necesario determinar empíricamente las cantidades óptimas de la primera ronda productos de extensión de solapamiento para añadir a la mezcla de reacción para producir el, quiméricos producto final de longitud completa por PCR.
   6. Separar las de segunda ronda productos OE-PCR mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%. Impuestos Especiales y purificar los productos usando un kit de extracción en gel de ADN disponible en el mercado.
   7. Incubar de segunda ronda productos OE-PCR purificados en gel con 1 unidad de Taq ADN polimerasa mezcla maestra durante 10 min a 72 ° C para generar los 3' productos adenilado (es decir, A-tailed) necesarios para clonación TA.
   8. Ligar los productos resultantes adeniladosen el vector de expresión pIB y usar técnicas de clonación molecular estándar para transformar células de Escherichia coli químicamente competentes (choque térmico) o electrocompetentes (electroporación). Durante la noche de la placa en medio que contiene el marcador de selección apropiado (es decir, la ampicilina o carbenicilina).
   9. Realizar colonia PCR ¹² usando un cebador específico de vector y un cebador específico de inserción para identificar colonias de inserción positiva que han sido transformadas con plásmidos de expresión que alberga un inserto en la orientación 5'-3' . Preparar cultivos de una noche de colonias que generan productos de PCR de los tamaños esperados.
   10. Aislar el ADN plásmido usando un kit de purificación de ADN disponible en el mercado de acuerdo con las instrucciones del fabricante (véase la Tabla de Materiales para el kit específico utilizado en este protocolo). Validar la integridad de la secuencia de cada inserto mediante secuenciación de ADN directa.

2. Células de insecto cultivo de mantenimiento

Nota: Para mantener condiciones estériles, realizar todas las manipulaciones celulares que requieren la abertura del frasco de cultivo de tejidos dentro de una campana de flujo laminar. Encender la lámpara germicida campana UV de flujo laminar al menos 1 h antes de manipulaciones celulares. Use guantes de nitrilo y descontaminar la superficie de la banqueta, pipetas, utensilios, tubos y frascos con 70% de etanol antes de su uso. Familiaridad con las técnicas básicas de cultivo celular se recomienda ^13.

1. Utilice células TnI (una línea de cultivo celular establecida derivada de Trichoplusia tejido ovárico ni) que están adaptados a medio libre de suero y mantenerlas como un cultivo en monocapa adherente en medio de insecto libre de suero a 28 ° C en matraces de cultivo tisular T25.
2. Mantener las células Sf9 (una línea de cultivo celular establecida derivada de Spodoptera frugiperda tejido ovárico) De manera similar pero usando suplemento de medio de cultivo de insecto TNM-FHed con 10% de suero bovino fetal (FBS).
3. Sembrar el cultivo inicial de Sf9 congelados o células TNI mediante la eliminación de los viales del stock de -80 ° C y permitiendo que se descongelen en un baño de agua a 37 ° C. Descontaminar los viales con 70% de etanol después de la descongelación y colocarlos en hielo.
4. Añadir 4 ml de medio de células de insecto a un nuevo matraz T25 y la transferencia de 1 ml de la suspensión de células de insecto descongelado. Colocar el matraz en un 28 ° C, incubadora no humidificado y permitir que las células se unieran durante 30-45 min.
5. Reemplazar el medio de siembra con 5 ml del medio apropiado y transferir los matraces a una incubadora de 28 ° C no humidificado. Monitorear la confluencia celular todos los días. Passage las células cuando alcanzan el 90% de confluencia.
   Nota: La cobertura completa del frasco T25 corresponde a ~ 5 x 10 ⁶ células.
6. Paso célula de insecto.
   1. Para el paso de las células, eliminar primero el medio agotado de la matraz que contenía células confluentes utilizando una pipeta serológica estéril 5 ml.Incline el frasco de forma que el medio fluye a una esquina, lejos de la monocapa de células. Retirar con cuidado el medio utilizando una pipeta sin perturbar las células.
   2. Desalojar las células TNI enjuagando suavemente los matraces T25 que contienen el monocapa confluente con 4 ml de medio de insecto libre de suero usando nuevo,, 5 ml pipeta serológica estéril. Mueva la punta de pipeta a través del matraz y lentamente irrigar para eliminar las células poco adheridas a la parte inferior del matraz.
      1. Compruebe que la separación adecuada de las células mediante la eliminación de todos los medios, al girar el matraz durante, y la observación de que el fondo del matraz está clara.
   3. Para las células Sf9, que se adhieren más fuertemente, añadir 4 ml de medio fresco TNM-FH y usar un raspador celular para desprender las células unidas. Utilizar una pipeta serológica de 5 ml de mezclar y reducir la formación de grumos de células suavemente.
   4. Utilice un contador de células automatizado para estimar el número de células de insectos viables por volumen de medio. Transferir 0,1 ml de células mezcla / medio a un 1,5 mLtubo de microcentrífuga. En un tubo de microcentrífuga separado 0,5 ml, añadir 10 l de células mezcla / medio a 10 l de azul de tripano.
   5. Retirar un cámara de deslizamiento contador de células de su embalaje y añadir 10 l de la / media mezcla azul célula / tripano a cada lado de la corredera de recuento. Insertar la diapositiva en el contador de células y determinar la densidad celular y viabilidad.
   6. Utilizando la densidad celular, calcular y añadir el volumen apropiado de medio de células de insecto (hasta 5 ml) a nuevos matraces T25 estériles.
   7. Transferir aproximadamente 1-1,5 x 10 ⁶ células a matraces T25 con medio fresco; etiquetar los frascos con la línea celular, la fecha, medio utilizado, el número de células añadido, y el número de paso (P _n + 1 generación, donde P _n es el número de paso para la generación anterior de las células); y colocar los matraces en una incubadora a 28 ° para un máximo de 72 h.
      Nota: Las células de insecto pueden ser propagadas de forma continua, aunque las células pueden ser menos receptivos a la transfección y / o heterólogaexpresión de la proteína después de 30 pasajes. Tratar a todo el desechado células / media con una solución de lejía al 10% y autoclave artículos de plástico desechable antes de su eliminación.

3. Transfección de células de insectos

1. Sembrar un matraz T25 con hasta 1 x 10 ⁶ células TnI o Sf9 en un medio de células de insecto adecuado (medio de insecto libre de suero durante TNI y TNM-FH para Sf9) y crecer hasta la confluencia durante 72 horas a 28 ° C.
2. Quitar y desechar el medio viejo y desalojar las células con 4 ml de medio de insecto fresco libre de suero (consulte los pasos 2.6.2 y 2.6.3, más arriba).
3. Estimar la densidad de células usando un contador de células automatizado (véase el paso 2.6.4, más arriba).
4. Añadir aproximadamente 7 x 10 ⁵ células a platos con fondo de vidrio individuales de 35 mm y permitir que las células se unieran durante 20-25 min a 28 ° C.
5. Para cada transfección, añadir 2 g de ADN plásmido (ya sea de un plásmido para las transfecciones simples o 2 g de cada uno de los dos plásmidos para dotransfecciones üble) a 0,1 ml de medio de insecto libre de suero (sin FBS tanto para Sf9 y transfecciones TnI) en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml.
6. En un tubo separado, mezclar 8 l de reactivo de transfección con 0,1 ml de medio de insecto libre de suero y luego transferir esa solución al tubo que contiene el plásmido de ADN de interés. Ligeramente vórtice y se incuba a TA durante 20 - 30 min.
7. Diluir la mezcla de plásmido de la transfección de los pasos 3,5 y 3,6 con 0,8 ml de medio de insecto libre de suero de manera que el volumen total es igual a 1 ml.
8. Retire cuidadosamente los medios de comunicación de los platos de vidrio que contienen células unidas. Superposición de las células unidas con el medio plásmido-transfección diluida.
9. Se incuban las células a 28 ° C durante 5 h.
   Nota: Las condiciones para la transfección requieren optimización empírica para la eficacia de transfección máxima (por ejemplo, la transfección durante la noche en lugar de 5 h, la cantidad de ADN plásmido utilizado, la química del reactivo de transfecciónusado, etc.).
10. Retirar y desechar el medio de transfección y lavar suavemente las células con 1 ml de medio de insecto libre de suero, teniendo cuidado de no desalojar las células.
11. Añadir 2 ml de medio de células de insecto fresco (medio de insecto libre de suero durante TNI y TNM-FH para Sf9) y se incuba a 28 ° C durante 48-72 h.
    Nota: Una vez más, las condiciones lo requieren optimización empírica para la expresión de proteínas heterólogas máxima.

4. confocal de microscopía de fluorescencia

1. En 48-72 h después de la transfección, se lavan las células una vez con 1 ml de IPL-41 medio de insectos y luego cubrir con 2 ml de IPL-41 para formación de imágenes.
   Nota: Esta etapa de lavado reduce el fondo auto-fluorescencia observada con medio de célula de insecto usado en el mantenimiento de células normal.
2. Añadir 4 gotas de reactivo de tinción de células vivas Hoechst (véase la tabla de materiales para la tinción nuclear específico utilizado en este protocolo) al medio y se incuba a 28 ° C durante 20-25 min.
   Nota: Nuc adicionalmanchas Lear puede estar sustituido, aunque el colorante debe tener un perfil de fluorescencia única de EGFP y mCherry.
3. Colocar una placa de 35 mm en el microscopio confocal de barrido láser encerrado en sí mismo (ver la tabla de materiales para el instrumento específico usado en este protocolo).
4. Ajuste el microscopio en busca de condiciones de observación Hoechst, EGFP, y mCherry: Hoechst excitación / emisión - 359/461 nm; EGFP excitación / emisión - 489/510 nm; mCherry excitación / emisión - 580/610 nm.
5. Realizar una exploración inicial utilizando un objetivo de 10x para confirmar la expresión fluorescente y luego cambiar a modo de exploración usando un objetivo de contraste de la inmersión en agua 60X fase.
6. Ajustar la potencia del láser (5-7%), la sensibilidad del detector (47-49%), la velocidad de barrido, la profundidad del eje Z, y zoom digital para optimizar el contraste de imagen y resolución. Imagen de las células en 1,5X zoom digital para dar un total de amplificación de 90X.
   Nota: Los parámetros del microscopio requieren un ajuste empírico para una óptimacolección de imágenes y puede ser específico para el instrumento en uso.
7. Exportar los datos en bruto como archivos de imagen TIFF y modificar (cultivos y la superposición) para la generación de figura.

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Resultados

OE-PCR

OE-PCR permite la síntesis de los productos de ADN quiméricas que, una vez insertado en un vector de expresión, permitir la producción de proteínas quiméricas recombinantes correspondientes a cualquier gen de prueba de interés y la proteína de marcador fluorescente. La figura 1 representa un esquema general para la producción de vectores de expresión que contienen PIB B. tabaci acuaporin...

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Discusión

Sistemas de expresión de proteínas heterólogas son herramientas importantes para la producción de proteínas recombinantes utilizadas en numerosas aplicaciones aguas abajo ^4. La elección de los diversos sistemas de expresión disponibles depende del objetivo final de la proteína de interés. Varios sistemas de expresión de células de insecto están disponibles que ofrecen alternativas flexibles para sistemas de expresión de células procariotas y eucariotas ^5,

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
KOD DNA Polymerase	EMD Millipore	71085-3	High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products
ExTaq DNA Polymerase	TaKaRa-Clontech	RR001B	DNA polymerase used for A-tailing of PCR products
EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix	Lucigen	30033-1	DNA polymerase used for bacterial colony PCR
Biometra TProfessional Gradient Thermocycler	Biometra/LABRepCo	070-851
Agarose LE	Benchmark Scientific	A1705
SYBR Safe DNA Gel Stain	ThermoFisher	S33102
Montage DNA Gel Extraction Kit	EMD Millipore	LSKGEL050
pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit	ThermoFisher	K89020	Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution.
QIAprep Spin MiniPrep Kit	Qiagen	27104
QIAcube Robotic Workstation	Qiagen	9001292
Purifier Vertical Clean Bench	Labconco	3970401
Tni cultured insect cell Line	Allele Biotech	ABP-CEL-10005
Sf9 cultured insect cell Line	Allele Biotech	ABP-CEL-10002
Serum-Free Insect Culture Medium	Allele Biotech	ABP-MED-10002
TNM-FH Insect Culture Medium	Allele Biotech	ABP-MED-10001
IPL-41 Insect Medium	ThermoFisher	11405081
Cellfectin II Transfection Reagent	ThermoFisher	10362100
16 cm Disposable Cell Scrapers	Sarstedt	83.1832	Cell scrapers with two-position blade
25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps	Life Science Products	CT-229331
Transfer Pipets	Fisher	1371120
Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes	Life Science Products	CT-229475
PipetteBoy	VWR	14222-180
5 mL Serological Pipettes	Sarstedt	86.1253.001
0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes	Fisher	14230200
Polypropylene Biohazard Autoclave Bags	Fisher	01828C
35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes	Matsunami Glass	D35-14-1.5-U	35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated
Incubator, Model 1510E	VWR	35823-961
Countess II FL Cell Counter	ThermoFisher	AMQAF1000
Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent	ThermoFisher	C10228
Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope	Olympus	FV10i-LIV
HsPLA2/pCS6 plasmid DNA	transOMIC Technologies	TCH1303
pmCherry Vector	Clontech	632522
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)	ThermoFisher	R37605