JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מערכות Nonlytic ביטוי תא חרקים הם מנוצלים לייצור, סחר / לוקליזציה הסלולר, וניתוח פונקציונלי חלבון רקומביננטי. כאן, אנו מתארים שיטות ליצירת וקטורי ביטוי והבעת חלבון חולפת עוקבת בשורות תא פרפראים זמינות מסחרי. שיתוף הלוקליזציה של aquaporins tabaci Bemisia עם חלבונים בסמן פלורסנטי התת-תאי מוצגת גם.

Abstract

מערכות חלבון ביטוי Heterologous משמשות לייצור חלבונים רקומביננטיים, הפרשנות של סחר / לוקליזציה הסלולר, ואת הנחישות של הפונקציה ביוכימית של חלבונים ברמה תת-אורגניזמים. למרות שמערכות ביטוי baculovirus משמשות יותר ויותר לייצור חלבון ביוטכנולוגית רבה, תרופות, ויישומים תעשייתיים, מערכות nonlytic שאינו כרוכות זיהום ויראלי יש יתרונות ברורים, אבל הם לעתים קרובות התעלמו ו מנוצלים. כאן, אנו מתארים שיטה ליצירת וקטורי ביטוי nonlytic וביטוי חלבונים רקומביננטיים חולף. פרוטוקול זה מאפשר לוקליזציה הסלולר היעילה של חלבונים רקומביננטיים וניתן להשתמש בו כדי להבחין סחר חלבון במהירות בתוך התא. אנחנו מראים את הביטוי של ארבעה חלבונים רקומביננטיים בקו תא חרק זמין מסחרי, לרבות שני חלבוני aquaporin מן tabaci Bemisia החרקים, כמו גםכמו חלבוני סמן התת-תאי ספציפיים עבור הממברנה תא עבור lysosomes התאי. כל החלבונים רקומביננטי הופקו כמו מפלצות עם סמנים חלבון פלואורסצנטי ב Termini carboxyl שלהם, המאפשר זיהוי ישיר של חלבונים רקומביננטיים. Transfection הכפול של תאים עם פלסמידים מחסה בונים עבור הגנים של ריבית סמן התת-תאי ידוע מאפשר הדמית תא חייה ואימות משופרת של לוקליזציה חלבון הסלולר.

Introduction

ייצור חלבונים רקומביננטיים באמצעות מערכות ביטוי תא חרק מציע יתרונות רבים ללימוד חלבונים איקריוטיים. כלומר, תאי חרקים בעלי שלאחר translational שינויים דומים, עיבוד, ומנגנוני מיון כמו הנוכחים בתאי יונקים, המהווה יתרון לייצור חלבוני 1 מקופל כראוי, 2, 3. גם מערכות תא חרקים בדרך כלל דורשים פחות משאבים ופחות זמן ומאמץ לצורך תחזוקה מ שורות תאים יונקים 4, 5. מערכת ביטוי baculovirus היא מערכת מבוססת תא חרק אחד כזה, כי הוא עכשיו בשימוש נרחב בתחומים רבים, כוללים הייצור של חלבונים רקומביננטיים עבור ואפיון חלבונים ותרופות, מצגת immunogenic של פפטידים זרים וחלבונים נגיפיים לייצור חיסון, הסינתזה של רב מתחמי -protein, ייצור של חלבונים glycosylated, וכו. 1, 2, 4, 6. יש, עם זאת, במצבים בהם ביטוי baculovirus לא יכול להיות ישים 3, 7, ושימוש במערכות ביטוי חרקים nonlytic וחולפת עשוי להיות מתאים יותר. באופן ספציפי, ביטוי תא חרק חולף מציע את האפשרות לסינתזה המהירה של חלבון רקומביננטי, דורש פחות פיתוח ותחזוקה, אינו כרוכות ימסו תא ויראלי שהוטל, ומספק אמצעי ללמוד סחר הסלולר טוב יותר במהלך חלבון סינתזה 7, 8, 9, 10.

פרוטוקול זה מתאר את הדור המהיר של וקטורי ביטוי באמצעות הארכת חפיפת שני שלבי PCR (OE-PCR) 11 ואת שיבוט רמת DNA פלסמיד coli Escherichia. פלסמידים משמשים-transfect הכפול זמינים מסחרי תאי חרק מתורבתים כדי לייצר חלבוני נציג. הפרוטוקול מתאר את ייצור ושימוש שני חלבונים שונים fluorescently שכותרתו התת-תאי סמן ומדגים colocalization עם שני חלבונים aquaporin מן tabaci Bemisia חרקים. הפרוטוקול הבא מספק את המתודולוגיה הבסיסית עבור OE-PCR, תחזוקת תא חרקי transfection, מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור הלוקליזציה של חלבוני יעד.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. OE-PCR עבור בניית פלסמידים ביטוי

הערה: ראה טבלה 1 עבור כל פריימרים המשמשים OE-PCR. שימוש DNA פולימרז באיכות גבוהה מומלץ לכל הרחבות. עם זאת, בגלל אנזימים אלה לעתים קרובות לא להשאיר 3' א ', יש צורך לבצע דגירה קצרה, הלא הגברה עם DNA פולימרז תקי 'א-זנב' את PCR מוצרים לקראת שיבוט אותם לתוך ביטוי תא חרק ת"א וֶקטוֹר. פרוטוקול זה מדגים שיטה להפקת פלסמידים ביטוי חרקים מחסה חלבונים כימרי, עם חלבוני ניאון התמזגו בתוך מסגרת עד למסוף carboxyl של הגנים של עניין (במקרה זה, שני חלבונים aquaporin Bemisia tabaci) או חלבונים סמן התת-תאי (איור 1).

  1. השתמש OE-PCR, אשר מורכב משני סיבובים עצמאיים של הגברה, כדי ליצור: (1) רצפי קידוד הגנים של עניין (B. tabaciaquaporin 1: BtDrip1; ב tabaci aquaporin 2: BtDrip2_v1) התמזגו בתוך מסגרת עם גרסה חלבון פלואורסצנטי ירוק שנקרא EGFP או (2) הסמנים התת-תאי (תסיסנית קולטן פפטיד מין: DmSPR; A2 פוספוליפאז ההומו ספיינס: HsPLA2) עם רצף קידוד mCherry. ישירות ולקשור את מוצרי OE-PCR הסופי לתוך פלסמיד PIB / V5-שלו-ת"א.
    1. לסיבוב הראשון של OE-PCR (מסומנת לספירה ו A'-D" באיור 1), להשתמש פריימר תחושת גן ספציפי (המודגשת בטבלה 1) ו פריימר antisense כימרי (באות נטויה בטבלה 1) המתאים אל 15 נ"ב הסופי (ללא קודון עצירה) של הגן של סמן ריבית / התת-תאי וכדי 15 נ"ב של סוף 5'של חלבון פלואורסצנטי הרצוי (EGFP או mCherry) כדי ליצור מוצר עם הסככה 3' .
      הערה: ראה טבלה 2 תנאי PCR.
    2. בצינור נפרד, להשתמש גן-specifפריימר antisense פלורסנט חלבון IC (מוצג עם קו תחתון בטבלה 1) ו פריימר תחושת כימרי המכיל 15 נ"ב מן הקצה 3'של של הגן של סמן ריבית / התת-תאי ו 15 נ"ב מן הקצה 5'של פלורסנט הרצוי חלבון כדי ליצור מוצר עם צילון 5' .
      הערה: ראה טבלה 2 עבור תנאי PCR. תבנית PCR או יכולה להיות מוצר PCR-תוקף ברצף או, יותר רצוי, פלסמיד דנ"א מחסת הרצף הרצוי. המחקר המתואר כאן משתמש פלסמידים-תוקף ברצף.
    3. הפרד את מוצרי ה- PCR עם 1% ג'ל אלקטרופורזה agarose (באמצעות agarose מולקולרית כיתה רגילה).
    4. ובלו ולטהר את המוצרים גדלים הצפוי (ראה טבלה 2) באמצעות ערכת חילוץ ג'ל DNA זמינה מסחרי (ראה טבלת חומרים עבור הערכה הספציפית להשתמש בפרוטוקול זה).
    5. השתמש במוצרי PCR מטוהר ג'ל משלב 1.1.4 על מנת ליצור את דואר החפיפה הסופימוצרי xtension (מסומן על ידי "" - ד "" באיור 1). השתמש פריימר תחושת גן ספציפי עבור הגן של סמן ריבית / התת-תאי ואת פריימר antisense גן ספציפי המתאים עבור חלבון פלואורסצנטי כדי ליצור רצף כימרי הרצוי.
      הערה: ראה טבלה 2 עבור תנאי PCR. זה עשוי להיות נחוץ כדי לקבוע את הכמות האופטימלית אמפירי של מוצרי המשך חפיפה בסיבוב הראשון להוסיף לתערובת התגובה להניב מוצר PCR כימרי הסופי, באורך מלא.
    6. הפרד את המוצרים בסיבוב השני OE-PCR על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose 1%. ובלו ולטהר את המוצרים באמצעות ערכת חילוץ ג'ל DNA זמינה מסחרי.
    7. דגירה מוצרים OE-PCR בסיבוב השני מטוהרים ג'ל עם 1 יחידה של שילוב הורים פולימראז תקי DNA עבור 10 דקות ב 72 מעלות צלזיוס כדי ליצור את המוצרים 3' adenylated (כלומר A-זנב) הדרושים שיבוט ת"א.
    8. ולקשור שהתקבלו מוצרי adenylated לתוך וקטור ביטוי PIB ולהשתמש בטכניקות שיבוט מולקולרי רגילות להפוך תאי coli Escherichia מוסמך כימי (חום הלם) או electrocompetent (electroporation). פלייט לילה על מדיום המכיל את סמן הבחירה המתאימה (כלומר, אמפיצילין או carbenicillin).
    9. בצעו המושבה PCR 12 באמצעות פריימר וקטור ספציפי פריימר הכנס ספציפי לזהות מושבות הכנס חיובי כי כבר הפך עם פלסמידים ביטוי מחסה אינסרט באוריינטציה 5'-3' . הכן תרבויות לילה של מושבות יצירת מוצרי PCR הגדלים הצפויים.
    10. לבודד פלסמיד דנ"א באמצעות ערכת טיהור DNA זמינה מסחרי בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת החומרים עבור הערכה הספציפית להשתמש בפרוטוקול זה). אמת את יושרת הרצף של כל כנס ידי רצפי DNA ישירים.

= "Jove_title"> 2. תחזוקת תרבית תאי חרקים

הערה: כדי לשמור על תנאים סטריליים, לנהל את כל המניפולציות התא הדורשים פתיחת הבקבוק בתרבית רקמה בתוך ברדס זרימה למינרית. להדליק את מנורת UV קוטל חידקים במנדף זרימה למינרית לפחות 1 שעות לפני מניפולציות סלולריות. יש להשתמש בכפפות ניטריל ו לטהר את השטח של הספסל, טפטפות, כלים, צינורות, צלוחיות עם אתנול 70% לפני השימוש בהם. היכרות עם טכניקות תרבית תאים בסיסיות מומלצת 13.

  1. השתמש בתאי שצבא יהיה (קו תרבית תאים הוקם נגזר Trichoplusia ני רקמת השחלה) מותאם סרום ללא בינוני ולשמור אותם כקובץ תרבות monolayer חסידה במדיום חרקי סרום ללא ב 28 מעלות צלזיוס ב T25 צלוחיות בתרבית רקמה.
  2. שמור על תאי Sf9 (קו תרבית תאים הוקם נגזר רקמת שחלת Spodoptera frugiperda) דומה אך באמצעות תרבות חרקי TNM-FH תוספת בינוניתed עם 10% עובריים שור סרום (FBS).
  3. זרעי התרבות הראשונית מן Sf9 הקפוא או תאים שצבא יהיה על ידי הסרת בקבוקוני מניות מן -80 ° C, ולאפשר להם להפשיר בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לטהר את צלוחיות עם 70% אתנול לאחר ההפשרה ומניחים אותם על הקרח.
  4. להוסיף 4 מ"ל של המדיום הסלולרי חרקים בבקבוק T25 חדש והעברת 1 מ"ל של תרחיף תאים חרקים מופשר. מניחים את הבקבוק בתוך חממה 28 ° C, ללא humidified ולאפשר לתאים לצרף 30-45 דקות.
  5. החלף את המדיום זריעה עם 5 מ"ל של המדיום המתאים ולהעביר את צלוחיות חממה 28 ° C הלא humidified. מעקב אחר תאי מפגש יומי. מעבר התאים כאשר הם מגיעים 90% confluency.
    הערה: סיקור מלא של בקבוק T25 מתאים ~ 5 x 10 6 תאים.
  6. מעבר תאי חרקים.
    1. למעבר התאים, להסיר תחילה את המדיום המותש מן הבקבוק המכיל תאים ומחוברים באמצעות פיפטה סרולוגיות 5 מיליליטר סטרילי.הטה את הבקבוק כך הבינוני זורם בפינה אחת, הרחק בשכבת התא. מוציאים בזהירות את המדיום בעזרת פיפטה מבלי להפריע את התאים.
    2. לסלק את התאים שהצבא יהיה ידי בעדינות שטיפה צלוחיות T25 המכיל בשכבה ומחוברות עם 4 מ"ל של מדיום חרקים סרום ללא שימוש פיפטה סרולוגיות חדש, סטרילי, 5 מ"ל. הזיזו את קצה פיפטה ברחבי הבקבוק לאט להשקות כדי להסיר תאים המחוברים באופן רופף לתחתית הבקבוק.
      1. בדקו הניתוק הנאות של תאים על ידי הסרת כל התקשורת, הפיכת הבקבוק מעל, והתבוננות כי החלק התחתון של הבקבוק הוא ברור.
    3. עבור תאי Sf9, אשר דבקים יותר בחוזקה, להוסיף 4 מיליליטר של מדיום חדש TNM-FH ולהשתמש מגרד תא כדי לסלק את התאים המצורפים. השתמש פיפטה סרולוגיות 5 מ"ל לערבב בעדינות ולהפחית clumping התא.
    4. השתמש נגד תא אוטומטי כדי להעריך את מספר תאי חרק קיימא לכל נפח של מדיום. העבר 0.1 מ"ל של התא / תערובת בינוני עד 1.5 מ"לצינור microfuge. בתוך צינור 0.5 מ"ל microfuge נפרד, להוסיף 10 μL של תאים / תערובת בינוני עד 10 μL של trypan כחול.
    5. הסרת שקף קאמרי תא לדלפק מהאריזה להוסיף 10 μL של התא / בינוני / תערובת trypan הכחולה בכל צד של שקופית הספירה. הכנס את השקופית לתוך דלפק התא ולקבוע את צפיפות כדאי התא.
    6. שימוש צפיפות התאים, לחשב ולהוסיף הנפח הנאות של מדיום סלולארי חרקים (עד 5 מיליליטר) צלוחיות T25 חדשות, סטרילי.
    7. העבר כ 1-1.5 x 10 6 תאי צלוחיות T25 עם תקשורת טריה; התווית צלוחיות עם שורת תאים, תאריך, בינוני בשימוש, מספר תאי הוסיף, ומספר הקטע (P n + 1 דור, כאשר P n הוא מספר המעבר לדור הקודם של תאים); ולמקם את צלוחיות C חממה 28 ° עד 72 h.
      הערה: תאי חרקים עשויים להיות מופצים באופן רציף, למרות תאים עשויים להיות פחות קשוב transfection ו / או Heterologousביטוי חלבון לאחר 30 קטעים. פנק את כל תאים מושלכים / מדיה עם פתרון אקונומיקה 10% ו חיטוי כלי פלסטיק חד פעמים לפני הסילוק.

3. Transfection תא חרקים

  1. הזרע, בקבוק T25 עם עד 1 x 10 6 תאים שהצבא יהיה או Sf9 במדיום הסלולרי חרקים המתאים (מדיום חרקים נטולי סרום עבור שהצבא יהיה ו TNM-FH עבור Sf9) ולגדול confluency עבור 72 שעות ב 28 מעלות צלזיוס.
  2. הסר וזורקים את המדיום הישן לסלק את התאים עם 4 מ"ל של מדיום חרקים סרום ללא טריים (ראה צעדים 2.6.2 ו 2.6.3, לעיל).
  3. הערך את צפיפות התאים באמצעות דלפק תא אוטומטי (ראה שלב 2.6.4, לעיל).
  4. להוסיף כ 7 x 10 5 תאים 35 מ"מ בודדים מנות עם רצפת זכוכית ולאפשר לתאים לצרף עבור 20-25 דקות ב 28 מעלות צלזיוס.
  5. במשך כל transfection, להוסיף 2 מיקרוגרם של ה- DNA פלסמיד (בין פלסמיד אחד עבור transfections בודד או 2 מיקרוגרם מכל אחת משני פלסמידים עבור מטלותtransfections uble) כדי 0.1 מ"ל של מדיום חרקים נטולי סרום (ללא FBS הן Sf9 ו transfections שהצבא יהיה) בצינור 1.5 מ"ל microfuge סטרילית.
  6. בצינור נפרד, לערבב 8 μL של מגיב transfection עם 0.1 מ"ל של מדיום חרקים נטולי סרום ולאחר מכן להעביר פתרון אל צינור המכיל פלסמיד דנ"א של עניין. בעדינות מערבולת לדגור על RT במשך 20 - 30 דקות.
  7. לדלל את התערובת פלסמיד-transfection מן הצעדים 3.5 ו 3.6 עם 0.8 מ"ל של מדיום חרקים סרום ללא כך הנפח הכולל שווה 1 מ"ל.
  8. מוציא בזהירות את התקשורת בין מנות הזכוכית המכילות תאים מצורפים. Overlay התאים המצורפים עם מדיום פלסמיד-transfection המדולל.
  9. דגירת התאים ב 28 מעלות צלזיוס למשך 5 h.
    הערה: התנאים transfection דורש אופטימיזציה אמפירית ליעילות transfection מירבית (למשל, לילה transfection ולא 5 h, כמות ה- DNA פלסמיד המשמש, את הכימיה של מגיב transfectionמשומש, וכו.).
  10. הסר וזורקים את המדיום transfection בעדינות ולשטוף את התאים עם 1 מ"ל של מדיום חרקים נטולי סרום, נזהרים שלא לסלק תאים.
  11. להוסיף 2 מ"ל של המדיום הסלולרי טרי חרקים (מדיום חרקים נטולי סרום עבור שהצבא יהיה ו TNM-FH עבור Sf9) לדגור על 28 מעלות צלזיוס למשך 48-72 שעות.
    הערה: שוב, התנאים דורשים אופטימיזציה אמפירי עבור ביטוי חלבון Heterologous מירבית.

4. מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal

  1. בשעה 48-72-transfection פוסט h, לשטוף את התאים פעם עם 1 מ"ל של מדיום חרקים IPL-41 ואז לכסות עם 2 מ"ל של IPL-41 עבור הדמיה.
    הערה: שלב זה לשטוף מפחית את אוטומט קרינת הרקע שנצפתה עם מדיום סלולארי חרקים המשמש תחזוקת תא נורמלית.
  2. להוסיף 4 טיפות של ריאגנט מכתים לחיות תאי Hoechst (ראה טבלת חומרים עבור הכתם הספציפי הגרעיני להשתמש בפרוטוקול זה) למדיום לדגור 28 מעלות צלזיוס למשך 20-25 דקות.
    הערה: nuc נוסףכתמי ליר ניתן להחליף, אם כי הצבע צריך להיות פרופיל קרינה ייחודי מן EGFP ו mCherry.
  3. מניחים בצלחת 35 מ"מ לתוך מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר סגור בתוך עצמו (ראו טבלה של חומרים עבור המכשיר הספציפי בשימוש בפרוטוקול זה).
  4. התאם את מיקרוסקופ עבור Hoechst, EGFP, ותנאי תצפית mCherry: עירור Hoechst / פליטה - 359/461 ננומטר; EGFP עירור / פליטה - 489/510 ננומטר; mCherry עירור / פליטה - 580/610 ננומטר.
  5. בצע סריקה ראשונית באמצעות מטרת 10x כדי לאשר ביטוי פלורסנט ולאחר מכן לעבור למצב סריקה באמצעות מטרת 60X לעומת שלב מי טבילה.
  6. התאם את עוצמת הלייזר (5-7%), רגישות גלאי (47-49%), מהירות סריקה, עומק Z ציר, וזום דיגיטלי כדי לייעל את הניגוד התמונה והרזולוציה. תמונת התאים ב זום דיגיטלי 1.5x לתת סך של הגברת 90X.
    הערה: הפרמטרים מיקרוסקופ דורשים התאמה אמפירית אופטימליאוסף תמונה יכול להיות ספציפי המכשיר בשימוש.
  7. יצוא הנתונים הגולמיים כמו קבצי תמונת TIFF ולשנות (יבול ואת כיסוי) לצורך יצירת דמות.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

OE-PCR

OE-PCR מאפשר לסינתזה של מוצרי ה- DNA כימרי כי, להכניס פעם לתוך וקטור ביטוי, לאפשר ייצור של חלבונים רקומביננטיים כימרי המתאים לכל גן המבחן של עניין וחלבון בסמן פלורסנטי. איור 1 מייצג תוכני?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מערכות ביטוי חלבון Heterologous הם כלים חשובים לייצור חלבונים רקומביננטיים בשימוש ביישומים במורד הזרם רבים 4. בחירה ממערכות ביטוי המגוונות הזמינות תלוי בסופו של דבר המטרה של החלבון של עניין. כמה מערכות תא ביטוי חרק זמינות המציעים חלופות גמישות למערכות ביטוי ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

אנו מודים לין Forlow-Jech ו Dannialle לירוי לקבלת סיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי מימון שקריס הבסיס USDA ARS, התכנית הלאומית 304 - להגנת הצומח ההסגר [פרויקט # 2020-22620-022-00D] להזכיר JAF ו JJH של שמות מסחריים או מוצרים מסחריים במאמר זה הוא אך ורק לשם מתן מידע ספציפי ואינו משתמע המלצה או תמיכה על ידי משרד החקלאות האמריקני. USDA היא ספקית הזדמנות שווה מעסיק.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
KOD DNA PolymeraseEMD Millipore71085-3High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products
ExTaq DNA PolymeraseTaKaRa-ClontechRR001BDNA polymerase used for A-tailing of PCR products
EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master MixLucigen30033-1DNA polymerase used for bacterial colony PCR
Biometra TProfessional Gradient ThermocyclerBiometra/LABRepCo070-851
Agarose LEBenchmark ScientificA1705
SYBR Safe DNA Gel StainThermoFisherS33102
Montage DNA Gel Extraction KitEMD MilliporeLSKGEL050
pIB/V5-His TOPO TA Expression KitThermoFisherK89020Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution.
QIAprep Spin MiniPrep KitQiagen27104
QIAcube Robotic WorkstationQiagen9001292
Purifier Vertical Clean BenchLabconco3970401
Tni cultured insect cell LineAllele BiotechABP-CEL-10005
Sf9 cultured insect cell LineAllele BiotechABP-CEL-10002
Serum-Free Insect Culture MediumAllele BiotechABP-MED-10002
TNM-FH Insect Culture MediumAllele BiotechABP-MED-10001
IPL-41 Insect MediumThermoFisher11405081
Cellfectin II Transfection ReagentThermoFisher10362100
16 cm Disposable Cell ScrapersSarstedt83.1832Cell scrapers with two-position blade
25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter CapsLife Science ProductsCT-229331
Transfer PipetsFisher1371120
Sterile, 50 mL Bio-Reaction TubesLife Science ProductsCT-229475
PipetteBoyVWR14222-180
5 mL Serological PipettesSarstedt86.1253.001
0.5 mL Flat-Cap PCR TubesFisher14230200
Polypropylene Biohazard Autoclave BagsFisher01828C
35 mm #1.5 Glass Bottom DishesMatsunami GlassD35-14-1.5-U35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated
Incubator, Model 1510EVWR35823-961
Countess II FL Cell CounterThermoFisherAMQAF1000
Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue ReagentThermoFisherC10228
Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal MicroscopeOlympusFV10i-LIV
HsPLA2/pCS6 plasmid DNAtransOMIC TechnologiesTCH1303
pmCherry VectorClontech632522
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)ThermoFisherR37605

References

  1. Kost, T. A., et al. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).
  2. van Oers, M. M., et al. Thirty years of baculovirus-insect cell protein expression: from dark horse to mainstream technology. J. Gen. Virol. 96 (1), 6-23 (2015).
  3. Contreras-Gòmez, A., et al. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol. Progr. 30 (1), 1-18 (2014).
  4. Hunt, I. From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression. Protein Expres. Purif. 40 (1), 1-22 (2005).
  5. Kollewe, C., Vilcinskas, A. Production of recombinant proteins in insect cells. Am. J. Biochem. Biotechnol. 9 (3), 255-271 (2013).
  6. Altmann, F., et al. Insect cells as hosts for the expression of recombinant glycoproteins. Glycotechnology. Berger, E. G., Clausen, H., Cummings, R. D. , Springer. Boston, MA. 29-43 (1999).
  7. Shen, X., et al. A simple plasmid-based transient gene expression method using High Five cells. J. Biotechnol. 216, 67-75 (2015).
  8. Chen, H., et al. Rapid screening of membrane protein expression in transiently transfected insect cells. Protein Expres. Purif. 88 (1), 134-142 (2013).
  9. Shen, X., et al. Virus-free transient protein production in Sf9 cells. J. Biotechnol. 171, 61-70 (2014).
  10. Loomis, K. H., et al. InsectDirect System: rapid, high-level protein expression and purification from insect cells. J. Struct. Funct. Genomics. 6 (2), 189-194 (2005).
  11. Wurch, T., et al. A modified overlap extension PCR method to create chimeric genes in the absence of restriction enzymes. Biotechnol. Tech. 12 (9), 653-657 (1998).
  12. Woodman, M. E. Direct PCR of intact bacteria (colony PCR). Curr. Protoc. Microbiol. 9 (3), 1-6 (2008).
  13. Cell Culture Basics Handbook. , ThermoFisher Scientific. Available from: http://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics.html?cid=fl-cellculturebasics, Pub. no. MAN0002734 Rev A.0 (2014).
  14. Mathew, L. G., et al. Identification and characterization of functional aquaporin water channel protein from alimentary tract of whitefly, Bemisia tabaci. Insect Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 178-190 (2011).
  15. Van Ekert, E., et al. Molecular and functional characterization of Bemisia tabaci aquaporins reveals the water channel diversity of hemipteran insects. Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 39-51 (2016).
  16. Hull, J. J., Brent, C. S. Identification and characterization of a sex peptide receptor-like transcript from the western tarnished plant bug Lygus hesperus. Insect Mol. Biol. 23 (3), 301-319 (2014).
  17. Maroniche, G. A., et al. Development of a novel set of Gateway-compatible vectors for live imaging in insect cells. Insect Mol. Biol. 20 (5), 675-685 (2011).
  18. Hull, J. J., et al. Identification of the western tarnished plant but (Lygus hesperus) olfactory co-receptor ORCO: Expression profile and confirmation of atypical membrane topology. Arch. Insect Biochem. 81 (4), 179-198 (2012).
  19. Lee, J. M., et al. Re-evaluation of the PBAN receptor molecule: Characterization of PBANR variants expressed in the pheromone glands of moths. Front. Endocrinol. 3 (6), 1-12 (2012).
  20. Fabrick, J. A., et al. Molecular and functional characterization of multiple aquaporin water channel proteins from the western tarnished plant bug, Lygus hesperus. Insect Biochem. Mol. Biol. 45, 125-140 (2014).
  21. Lu, M., et al. A baculovirus (Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus) repeat element functions as a powerful constitutive enhancer in transfected insect cells. J. Biol. Chem. 272, 30724-30728 (1997).
  22. Ren, L., et al. Comparative analysis of the activity of two promoters in insect cells. African J. Biotechnol. 10, 8930-8941 (2011).
  23. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
  24. Kohnhorst, C. L., et al. Subcellular functions of proteins under fluorescence single-cell microscopy. Biochim. Biophys. Acta. 1864, 77-84 (2016).
  25. Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. Recent advances in quantitative colocalization analysis: focus on neuroscience. Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).
  26. Shaner, N. C., et al. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  27. Chalfie, M., et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  28. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotech. 22 (12), 1567-1572 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

122HeterologousTrichoplusiaSpodoptera frugiperdaSf9transfectionconfocalBemisia tabaciAquaporin

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved