Kültürlü Böcek Hücrelerinde Geçici İfade ve Rekombinant Proteinlerin Hücresel Yerelleştirme

Özet

Nonlytic böcek hücresi ifade sistemleri üretim, selüler trafik / lokalizasyonu ve rekombinant protein, fonksiyonel analiz için atıl edilir. Burada, ticari olarak temin edilebilen bir lepidopteran hücresi çizgilerinde ifade vektörleri ve daha sonra geçici protein sentezlenmesinin üretilmesi için yöntemleri tarif eder. Hücre içi fluoresan işaretleyici proteinleri ile Bemisia tabaci aquaporins eş yerleşimi de sunulmuştur.

Özet

Heterolog protein ekspresyon sistemler, rekombinant proteinlerin üretimi için kullanılan, selüler trafik / lokalizasyonu yorumlanması ve alt organizma seviyesinde protein biyokimyasal fonksiyonunun belirlenmesi. bakulovirüs ifade sistemleri giderek sayısız biyoteknolojik, ilaç ve endüstriyel uygulamalar, var açık yararlar viral enfeksiyon içermeyen ama çoğu zaman göz ardı ve kullanılamayan ama nonlytic sistemlerde protein üretimi için kullanılmasına rağmen. Burada, nonlytic ekspresyon vektörleri ve geçici rekombinant protein ekspresyonunu oluşturmak için bir yöntem tarif eder. Bu protokol, rekombinant proteinlerin etkin hücresel lokalizasyonu için izin verir ve hızlı bir şekilde hücre içinde protein trafiğini ayırt etmek için kullanılabilir. Biz de, böcek Bemisia tabaci iki aquaporin proteinler de dahil olmak üzere, ticari olarak mevcut böcek hücresi hattı dört rekombinant proteinlerin ekspresyonu gösterirHücre plazma zarının spesifik hücre içi markör proteinler olarak ve hücre içi lizozomlar için. Yeniden birleştirici tüm proteinler rekombinant proteinlerin doğrudan teşhis edilmesine izin verir, karboksil terminallerinde, floresan protein işaretleri ile kimeraları üretildi. plazmidler ilgi ve bilinen bir alt hücresel markör genler için konstruktlarını barındıran hücrelerin çift transfeksiyon canlı hücre görüntüleme ve hücresel protein lokalizasyonu geliştirilmiş doğrulama sağlar.

Giriş

böcek hücresi ifade sistemleri kullanılarak, rekombinant proteinlerin üretimi ökaryotik proteinlerin çalışma için sayısız avantajlar sunmaktadır. Yani, böcek hücreleri de benzer post-translasyonel modifikasyonları, işleme ve uygun biçimde katlanmış ^{proteinler, 1, 2, 3} üretilmesi için avantajlı olan memeli hücrelerinde mevcut olanlar gibi ayırma mekanizmalara sahiptirler. Böcek hücre sistemleri, aynı zamanda, tipik olarak memeli hücre çizgileri ^{4, 5} den bakım için daha az kaynak ve daha az zaman ve çaba gerektirir. bakulovirüs ekspresyon sistemi, protein karakterizasyonu ve terapötik, yabancı peptidler ve aşı üretimi için viral proteinlerin imünojenik sunumu, çok sentezi için rekombinant proteinlerin üretimi de dahil olmak üzere artık birçok disiplinlerde kullanılan bir böcek hücre bazlı bir sistem, bir proteini kompleksleriVb glikosile proteinlerin üretimi. ^{1, 2, 4, 6.} Bununla birlikte, çeşitli durum da baculovirüs ifade ^{3, 7} uygulanabilir olmayabilir ve nonlytic ve geçici böcek ifade sistemlerinin kullanılması daha uygun olabilir. Özellikle, geçici böcek hücresi ekspresyon rekombinant proteinin hızlı sentezi için imkanı sunar, viral-uygulanan hücre lizizi içermeyen az gelişim ve bakım gerektirir ve daha iyi bir protein sentezi ^{7, 8, 9} boyunca hücre hareketini incelemek için bir araç ^{sağlar, 10.}

Bu protokol kullanılarak ekspresyon vektörlerinin hızla oluşturulmasını tarif etmektedir, iki aşamalı üst üste gelen uzatma PCR ile (OE-PCR) ^{11 ve Escherichia coli içinde plazmid DNA standart klonlama. Plazmidler, çift transfekte ticari olarak temin edilebilen Kültürlenmiş böcek hücreleri kullanılır ve temsili proteinleri üretmek için. Protokol, iki farklı floresan etiketli hücre içi işaretleme proteinleri üretim ve kullanımını tarif eder ve böcek Bemisia tabaci iki aquaporin proteinleri ile ko göstermektedir. Aşağıdaki protokol, OE-PCR, hedef proteinlerin hücresel lokalizasyon amacıyla böcek hücre bakım ve transfeksiyon, ve floresan mikroskobu için temel bir yöntem sağlar.}

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Ifade plazmitlerinin yapımı 1. OE-PCR,

Not: OE-PCR kullanılan tüm primerler için Tablo 1'e bakınız. yüksek doğrulukta bir DNA polimerazı kullanımı bütün amplifikasyonlar için tavsiye edilir. Bununla birlikte, bu enzimler, genellikle bırakmak çünkü bir 3' A, bir Taq DNA polimeraz ile kısa olmayan amplifiye inkübasyon gerçekleştirmek için gerekli olan 'A-kuyruk' PCR ürünleri bir TA böcek hücresi ekspresyon içerisine klonlanması önce vektör. Bu protokol, böcek sentezleme plasmidleri hücre içi protein işaretleyicileri (iki Bemisia tabaci aquaporin proteinlere, bu durumda) veya ilgilenilen genlerin karboksil terminine çerçeve içinde kaynaşmış floresan proteinleri ile, kimerik proteinleri barındıran oluşturmak için bir yöntemi gösterir (Şekil 1).

1. Amplifikasyon iki bağımsız tur oluşur OE-PCR, kullanın oluşturmak için: (1) ilgi konusu genlerin kodlayan dizileri (B. tabaciaquaporin 1: BtDrip1; B. tabaci aquaporin 2: BtDrip2_v1) EGFP ya da (2) alt hücresel markerler (Drosophila melanogaster cinsiyet peptid reseptör olarak adlandırılan yeşil floresan protein varyantı ile çerçeve kaynaşık: DmSPR Homo sapiens fosfolipaz A2: HsPLA2) MCherry kodlama dizisi ile. Doğrudan pIB / V5-His-ta plazmidine son OE-PCR ürünlerini bağlayacaktır.
   1. OE-PCR ilk kez için, (Tablo 1 'de kalın karakterlerle gösterilmiştir), gene özgü bir sens primeri ve bir kimerik antisens primeri (AD ve A'-D Şekil 1' de' ile gösterilen), karşılık gelen (Tablo 1' de italik) İlgi / hücre içi işaretleyici genin (durma kodunu ile veya olmaksızın) son 15 bp ve istenen floresan protein ve 5'-ucunun 15 bp (EGFP ya da mCherry) bir 3' çıkıntı ile bir ürün üretmek için.
      Not: PCR, aşağıdaki koşullar için Tablo 2'ye bakın.
   2. Ayrı bir tüp içinde, bir gen-özel kullanımıİstenen floresan 5'-ucundan çıkar / hücre içi işaretleyici genin 3 'ucunda 15 bp, 15 bp içerir ve bir kimerik sens primer (Tablo 1' de, bir alt çizgi ile gösterilir) ic floresan protein antisens primeri protein, bir 5' çıkıntı ile bir ürün üretmek için.
      Not: PCR, aşağıdaki koşullar için Tablo 2'ye bakın. PCR şablonu, daha çok tercihen, plazmid DNA, istenen dizisini barındıran bir dizi-doğrulanmış PCR ürünü, ya da olabilir,. Burada tarif edilen bir çalışma sekansı geçerliliği plazmidler kullanır.
   3. (Standart moleküler dereceli agaroz kullanılarak)% 1 agaroz jel elektroforezi ile PCR ürünleri ayırın.
   4. Tüketim ve ticari olarak mevcut bir DNA jel ekstre etme kiti kullanılarak beklenen boyutları (bakınız Tablo 2) 'de elde saflaştırmak (Bu protokolde kullanılan özel kit için malzeme tabloya bakınız).
   5. Nihai örtüşme e oluşturmak için adım 1.1.4 elde edilen jel-saflaştırılmış PCR ürünleri kullanınxtension ürünleri (A 'ile gösterilen' - D '' Şekil 1 'de). İlgi / hücre içi işaretleyici gen ve istenen kimerik dizisi üretmek için flüoresan protein için karşılık gelen gen-spesifik antisens primer için bir gen spesifik sens primer kullanın.
      Not: PCR, aşağıdaki koşullar için Tablo 2'ye bakın. Deneysel son, tam uzunluktaki kimerik PCR ürünü elde etmek için reaksiyon karışımına ekleyin birinci tur örtüşme uzatma ürünlerinin uygun miktarlarını belirlemek için gerekli olabilir.
   6. % 1 agaroz jel elektroforezi ile ikinci tur OE-PCR ürünleri ayırın. Tüketim bir ticari olarak temin edilebilir DNA jel ekstre etme kiti kullanılarak ürünler arındırmak ve.
   7. TA klonlama için gerekli olan 3' adenillenmiş (yani bir kuyruklu) ürünleri üretmek için 72 ° C 'de 10 dakika boyunca Taq DNA polimeraz ana karışımı 1 birim jel-saflaştırılmış ikinci tur OE-PCR ürünleri inkübe edin.
   8. Elde edilen adenylated ürünlerini bağlayacaktırpIB ekspresyon vektörüne ve kimyasal olarak kompetan (ısı şoku) ya da elektro (elektroporasyon) Escherichia coli hücrelerini dönüştürmek için standart molekül klonlama teknikleri kullanımı. Uygun seçim işaretleyici (örn, ampisilin veya karbenisilin) içeren ortamda Plaka gece boyunca karıştırıldı.
   9. Sentezleme plasmidleri, 5'-3' yönünde bir ek barındıran transforme edilmiş uç pozitif kolonileri tanımlamak için bir vektör-spesifik primer ve bir sokma özgü primer kullanılarak koloni PCR ¹² gerçekleştirin. Beklenen boyuttaki PCR ürünlerini üreten kolonilerin gecelik kültürler hazırlayın.
   10. Üreticinin talimatlarına göre bir ticari olarak temin edilebilir DNA saflaştırma kiti (Bu protokolde kullanılan özel kit için malzemeler Tablo) kullanılarak plazmid DNA izole edilir. doğrudan DNA dizileme ile her bir parçanın dizisi bütünlüğünü doğrulamak.

2. Böcek Hücre Kültürü Bakım

Not: steril koşulların muhafaza bir laminer akış başlığı içinde doku kültürü şişesi açılmasını gerektirmeyen tüm hücre manipülasyonlar yapmak. daha önceki bir hücre manipülasyonlar laminer akış dedantörü UV mikrop öldürücü lambasını en az 1 saat çevirin. nitril eldivenleri giymeli ve kullanılmadan önce% 70 etanol ile tezgah, pipetler, mutfak eşyaları, tüpler, ve şişe yüzeyi dezenfekte. Temel hücre kültürü teknikleri ile aşinalık ¹³ önerilir.

1. Serumsuz ortama uyarlanmıştır TnI hücreleri (Trichoplusia ni yumurtalık dokudan alınan bir yerleşik hücre kültürü hat) kullanarak ve 28 ° C T25 doku kültürü şişelerinde serum içermeyen böcek ortamı içinde yapışkan bir tek tabakalı kültürü olarak muhafaza.
2. Sf9 hücrelerinin (Spodoptera frugiperda yumurtalık dokudan alınan bir yerleşik hücre kültürü hat), benzer fakat TNM-FH böcek kültür ortamı takviyesi bakımı% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ile ed.
3. -80 ° C ila stok şişeler çıkarılması ve bunların 37 ° C sıcaklıkta bir su banyosu içinde erimesine izin dondurulmuş Sf9 veya TnI hücrelerden başlangıç ​​kültürü Seed. çözdürme sonrası% 70 etanol ile şişeleri dekontamine ve buz üzerine koyun.
4. Yeni bir T25 şişesi ve transfer çözülmüş böcek hücre süspansiyonu 1 ml böcek hücresi ortamında 4 mL ekleyin. bir 28 ° C olmayan nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içine yerleştirilir ve hücreler, 30-45 dakika boyunca birleşmeye izin verir.
5. Uygun ortamın 5 mL'si ile tohumlama ortamı yerini ve bir 28 ° C olmayan nemlendirilmiş inkübatör döküm kalıplarının transferi. Günlük hücre izdiham izleyin. Passage hücreleri% 90 birleşik duruma ulaştılar zaman.
   Not: T25 şişesi tam kapsama ~ 5 x 10 ⁶ hücre karşılık gelir.
6. Böcek hücre geçit.
   1. hücrelerin geçişi için, ilk olarak 5 ml steril bir serolojik pipet kullanılarak konfluent hücreler içeren şişeden bitmiş orta çıkarın.orta uzağa hücre tek tabaka, bir köşesinde akar, böylece şişeyi eğin. Dikkatle hücreleri bozmadan pipet kullanarak orta kaldırmak.
   2. hafifçe yeni, steril, 5 ml serolojik pipet kullanarak serumsuz böcek ortamı 4 mL konfluent tek tabaka içeren T25 şişeleri durulanarak TnI hücreleri çıkarmak. şişeye boyunca pipet getirin ve yavaş yavaş gevşek şişe tabanına bağlanmış hücreler uzaklaştırılmıştır yıkayınız.
      1. Tüm medyayı çıkarmadan üzerinde şişeyi çevirerek ve şişenin alt açıktır ki gözlemleyerek hücrelerin yeterli dekolmanı kontrol edin.
   3. daha sıkı bir şekilde yapışır Sf9 hücreleri için, taze TNM-FH ortamında 4 ml eklemek ve ekli hücreleri çıkarmak için bir hücre kazıyıcı kullanılır. nazikçe karıştırın ve hücre topaklanma azaltmak için 5 ml serolojik pipet kullanın.
   4. ortamın hacmi başına canlı böcek hücrelerinin sayısını tahmin etmek için otomatik hücre sayacını kullanın. 1.5 mL hücre / orta karışımı 0.1 mL aktarmamikrofüj tüpü. Ayrı bir 0.5 ml mikrofüj tüpe olarak, tripan mavisi 10 uL hücre / orta karışımın 10 uL ekleyin.
   5. paketinden bir hücre sayacı odasına slayt çıkarın ve sayma sürgünün her iki yanında hücre / orta / tripan mavisi karışımın 10 uL ekleyin. Hücre tezgahın içine slayt takın ve hücre yoğunluğu ve canlılığı belirler.
   6. Hücre yoğunluğu kullanılarak, hesaplamak ve yeni, steril T25 balonlarına böcek hücre ortamında (en fazla 5 mL) uygun hacim ekleyin.
   7. Taze ortam ile T25 şişeleri, yaklaşık 11.5 x 10 ⁶ hücre transferi; _(Pn hücrelerinin, önceki nesil için geçit sayısı _Pn + 1 üretimi,) hücre kullanılan çizgi, tarih, orta, ilave edilen hücrelerin sayısı ve kanal adedi ile şişeler etiket; ve en fazla 72 saat için 28 ° C inkübatör şişeler yerleştirin.
      Not: Böcek hücreleri sürekli olarak yayılabilir hücreler transfeksiyon ve / veya heterolog daha az açık olabilir, ancak30 geçişten sonra protein ekspresyonu. % 10 çamaşır suyu solüsyonu ile çıkartılan tüm hücre / ortamı tedavi ve atılmadan önce tek kullanımlık plastik eşya otoklav.

3. Böcek hücre transfeksiyonu

1. Bir T25 şişesi tohum kadar, 1 x 10 uygun bir böcek hücresi ortamında ⁶ TnI veya Sf9 hücreleri (Sf9 için TnI ve TNM-FH serumsuz böcek ortamı) ve 28 ° C 'de 72 saat boyunca birleşme oluşacak.
2. Çıkarın ve eski orta atmak ve taze serumsuz böcek orta 4 mL hücreleri çıkarmak (adımlar yukarıda 2.6.2 ve 2.6.3, bakınız).
3. otomatik bir hücre sayacı (yukarıdaki adım 2.6.4 bakınız) kullanılarak hücre yoğunluğu tahmin.
4. Tek tek 35 mm cam-alt yemekler için yaklaşık olarak 7 x 10 ⁵ hücre ilave edin ve hücreleri, 28 ° C'de 20-25 dakika boyunca birleşmeye izin verir.
5. Her transfeksiyon için plazmid DNA 2 ug ilave (ya da do iki plazmid her birinden gelen tek Transfeksiyonlar için bir plazmid ya da 2 ug1,5 mL steril bir mikrofüj tüpüne Sf9 ve TnI transfeksiyonlar) her ikisi için de FBS'siz serumsuz böcek ortamı (0.1 mL uble transfeksiyon).
6. Ayrı bir tüp içinde, serumsuz böcek ortamı 0.1 mL transfeksiyon reaktifi 8 uL karıştırmak ve daha sonra ilgilenilen plazmid DNA içeren tüp bu çözümü aktarın. Hafif girdap ve 20 için oda sıcaklığında inkübe edin - 30 dakika.
7. toplam hacim 1 mL eşit olacak şekilde, serum içermeyen böcek ortamı, 0.8 mL plazmid transfeksiyon adımları 3.5 karışımın ve 3.6 seyreltin.
8. Dikkatle ekli hücreleri içeren cam yemekleri medya kaldırmak. seyreltilmiş plazmid transfeksiyon ortamı ile bağlanmış hücreler Yerleşimi.
9. 5 saat boyunca 28 ° C'de inkübe hücreleri.
   Not: Transfeksiyon için koşullar maksimal transfeksiyon verimi (ampirik optimizasyon gerektirebilir, örneğin, bir gece boyunca transfeksiyon yerine 5 saat, kullanılan plazmid DNA'nın miktarı transfeksiyon reaktifi kimyasıikinci, vb.).
10. Çıkarın ve transfeksiyon ortamı atılır ve yavaşça hücreleri çıkarmak için dikkatli olmak, serumsuz böcek orta 1 mL yıkama hücreleri.
11. Taze böcek hücresi ortamı (Sf9 için TnI ve TNM-FH serumsuz böcek ortamı) 2 mL ekleyin ve 48-72 saat boyunca 28 ° C'de inkübe edin.
    Not: Yine, koşullar en fazla heterolog protein ekspresyonu için ampirik optimizasyon gerektirir.

4. Konfokal floresan mikroskobu

1. 48-72 saat sonra, transfeksiyon de IPL-41 böcek ortamın bir kez 1 mL yıkama hücreleri ve daha sonra 2 mL IPL-41 görüntüleme ile kaplayın.
   Not: Bu yıkama aşaması, normal hücre bakımında kullanılan böcek hücre ortam maddesi ile gözlenen arka otomatik floresan azaltır.
2. Hoechst canlı hücre boyama reaktifi 4 damla ekleyin ortamına (Bu protokolde kullanılan spesifik nükleer boya için malzeme tabloya bakınız) ve 20-25 dakika süreyle 28 ° C'de inkübe edin.
   Not: Ek nükboya EGFP ve mCherry benzersiz bir floresan profile sahip olmalıdır, ancak emizle lekeleri, ikame edilebilir.
3. kendi içinde kapalı bir lazer konfokal mikroskop içine 35 mm tabak (Bu protokolde kullanılan özel cihaz için malzeme tabloya bakınız) yerleştirin.
4. Hoechst, EGFP ve MCherry gözlem koşulları için mikroskop ayarlama: Hoechst uyarma / emisyon - 359/461 nm; EGFP uyarım / emisyon - 489/510 nm; MCherry uyarım / emisyon - 580/610 nm.
5. Floresan ifadesini doğrulamak ve daha sonra bir 60X faz kontrast su daldırma objektif kullanarak tarama moduna geçmek için bir 10x objektif kullanarak bir başlangıç ​​tarama gerçekleştirin.
6. Görüntü kontrastı ve çözünürlüğü optimize etmek için lazer gücü (% 5-7), detektör duyarlılık (47-49%), tarama hızı, Z ekseni derinliği ve dijital zum ayarlayın. Görüntü 1.5x dijital zoom hücreler 90X büyütmesi toplam vermek.
   Not: Mikroskop parametreleri optimum için ampirik ayarlama yapılmasıve görüntü toplama kullanımda araca özgü olabilir.
7. TIFF resim dosyaları olarak ham veri aktarın ve şekil nesil için (kırpma ve bindirme) değiştirin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

OE-PCR,

OE-PCR, bir kez çıkar ve floresan markör proteinin herhangi bir test genine karşılık gelen rekombinant kimerik proteinlerin üretimi için izin bir ekspresyon vektörüne yerleştirilir, kimerik DNA ürünleri sentezine izin verir. Şekil 1, floresan protein markör EGFP ile çerçeve dizileri (BtDrip1 ve BtDrip2_v1) kodlama B. tabaci aquaporin içeren pIB ifade vektörlerinin üretimi içi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Heterolog protein ekspresyon sistemleri çok sayıda alt uygulamalarda ^4'te kullanılan rekombinant proteinlerin üretimi için önemli bir araçtır. Mevcut çeşitli ifade sistemlerinden seçme ilgi protein için nihai hedef bağlıdır. Çeşitli böcek hücresi ifade sistemleri prokaryotik ve ökaryotik hücre ekspresyon sistemleri ^{5, 6} esnek alternatifler sunan mevcuttur. Protein ifadesini sürmek için bakulovirüs enfeksiyonu g...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
KOD DNA Polymerase	EMD Millipore	71085-3	High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products
ExTaq DNA Polymerase	TaKaRa-Clontech	RR001B	DNA polymerase used for A-tailing of PCR products
EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix	Lucigen	30033-1	DNA polymerase used for bacterial colony PCR
Biometra TProfessional Gradient Thermocycler	Biometra/LABRepCo	070-851
Agarose LE	Benchmark Scientific	A1705
SYBR Safe DNA Gel Stain	ThermoFisher	S33102
Montage DNA Gel Extraction Kit	EMD Millipore	LSKGEL050
pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit	ThermoFisher	K89020	Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution.
QIAprep Spin MiniPrep Kit	Qiagen	27104
QIAcube Robotic Workstation	Qiagen	9001292
Purifier Vertical Clean Bench	Labconco	3970401
Tni cultured insect cell Line	Allele Biotech	ABP-CEL-10005
Sf9 cultured insect cell Line	Allele Biotech	ABP-CEL-10002
Serum-Free Insect Culture Medium	Allele Biotech	ABP-MED-10002
TNM-FH Insect Culture Medium	Allele Biotech	ABP-MED-10001
IPL-41 Insect Medium	ThermoFisher	11405081
Cellfectin II Transfection Reagent	ThermoFisher	10362100
16 cm Disposable Cell Scrapers	Sarstedt	83.1832	Cell scrapers with two-position blade
25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps	Life Science Products	CT-229331
Transfer Pipets	Fisher	1371120
Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes	Life Science Products	CT-229475
PipetteBoy	VWR	14222-180
5 mL Serological Pipettes	Sarstedt	86.1253.001
0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes	Fisher	14230200
Polypropylene Biohazard Autoclave Bags	Fisher	01828C
35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes	Matsunami Glass	D35-14-1.5-U	35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated
Incubator, Model 1510E	VWR	35823-961
Countess II FL Cell Counter	ThermoFisher	AMQAF1000
Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent	ThermoFisher	C10228
Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope	Olympus	FV10i-LIV
HsPLA2/pCS6 plasmid DNA	transOMIC Technologies	TCH1303
pmCherry Vector	Clontech	632522
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)	ThermoFisher	R37605