Expressão transitória e Celular Localização de proteínas recombinantes em células de cultura de insectos

Resumo

sistemas de expressão em células de insecto Nonlytic são pouco utilizados para a produção, o tráfico celular / localização, e a análise funcional da proteína recombinante. Aqui, nós descrevemos métodos para gerar vectores de express e subsequente expressão da proteína transiente em linhas de células de lepidópteros disponíveis comercialmente. A co-localizao de aquaporinas de Bemisia tabaci com proteínas marcadoras fluorescentes subcelulares também é apresentada.

Resumo

sistemas de expressão de proteínas heterólogas são utilizados para a produção de proteínas recombinantes, a interpretação de tráfico celular / localização, e a determinação da função bioquímica de proteínas ao nível sub-organismos. Embora os sistemas de baculovírus de expressão são cada vez mais utilizados para a produção de proteína em numerosos biotecnológica, farmacêutica e aplicações industriais, sistemas nonlytic que não envolvem infecção viral tem benefícios claros, mas muitas vezes são esquecidos e subutilizados. Aqui, descrevemos um método para a geração de vectores de expressão nonlytic e a expressão da proteína recombinante transiente. Este protocolo permite a localização celular eficiente de proteínas recombinantes e pode ser utilizado para discernir rapidamente proteína tráfico dentro da célula. Mostramos a expressão de quatro proteínas recombinantes em uma linha celular de insecto disponível comercialmente, incluindo duas proteínas aquaporina do Bemisia tabaci insectos, bemcomo proteínas marcadoras subcelulares específicos para a membrana plasmática da célula e para os lisossomas intracelulares. Todas as proteínas recombinantes foram produzidas como quimeras com marcadores de proteínas fluorescentes nas suas extremidades carboxilo, que permite a detecção directa das proteínas recombinantes. A dupla transfecção das células com plasmeos albergando construes para os genes de interesse e um marcador subcelular conhecido permite imagens de células vivas e melhorada validação de localização da proteína celular.

Introdução

A produção de proteínas recombinantes, utilizando sistemas de expressão de células de insecto oferece numerosos benefícios para o estudo de proteínas eucarióticas. Ou seja, as células de insectos possuir modificações semelhantes pós-tradução, processamento, e os mecanismos de triagem como os presentes em células de mamíferos, o que é vantajoso para a produção de proteínas correctamente dobradas ^{1, 2, 3.} Sistemas de células de insectos também tipicamente requerem menos recursos e menos tempo e esforço para manutenção de linhas celulares de mamíferos ^{4, 5.} O sistema de expressão de baculovírus é um tal sistema baseado em células de insecto que é agora amplamente utilizados em muitas disciplinas, incluindo a produção de proteínas recombinantes para caracterização da proteína e terapêutica, a apresentação imunogénica de peptídeos estranhos e proteínas virais para produção de vacinas, a síntese de múltiplas -proteína complexos, A produção de proteínas glicosiladas, etc. ^{1, 2, 4, 6.} Existem, no entanto, situações em que a expressão de baculovírus pode não ser aplicável ^{3, 7,} e a utilização de sistemas de expressão de insectos e nonlytic transientes podem ser mais apropriados. Especificamente, a expressão de células de insecto transiente oferece a possibilidade para a rápida síntese de proteína recombinante, requer menos desenvolvimento e manutenção, não envolve a lise celular viral-impostas, e fornece um meio para melhor estudar o tráfico celular durante a síntese ^{7, 8, 9, proteína, 10.}

Este protocolo descreve a rápida geração de vectores de expressão utilizando duas etapas de PCR de extensão de sobreposição (OE-PCR) ^{11 e o padrão de clonagem de ADN de plasmídeo em Escherichia coli. Os plasmídeos são usados ​​para transfectar células de duplo de insecto em cultura disponíveis comercialmente e para produzir proteas representativas. O protocolo descreve a produção e utilização de duas proteínas marcadoras subcelular fluorescentemente marcadas diferentes e demonstra uma co-localização com duas proteínas aquaporina do Bemisia tabaci inseto. O protocolo seguinte fornece a metodologia básica para OE-PCR, a manutenção de células de insectos e de transfecção, e a microscopia de fluorescência para a localização celular de proteínas alvo.}

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Protocolo

1. OE-PCR para a construção de plasmídeos de expressão

Nota: Ver Tabela 1 para todos os iniciadores utilizados na OE-PCR. A utilização de uma polimerase de DNA de alta-fidelidade é recomendada para todas as amplificações. No entanto, porque estas enzimas frequentemente não deixe um 3' , é necessário realizar uma breve, a incubação não-amplificação com uma polimerase de ADN de Taq a 'um-cauda' produtos do PCR antes da clonagem-los em uma expressão de célula de insecto TA vetor. Este protocolo demonstra um método para gerar os plasmídeos de expressão de insecto abrigando proteínas quiméricas, com as proteínas fluorescentes fundidos em grelha com o terminal carboxilo dos genes de interesse (neste caso, de duas proteínas tabaci aquaporina Bemisia) ou às proteínas marcadoras subcelulares (Figura 1).

1. Use OE-PCR, que consiste em duas rodadas independentes de amplificação, para gerar: (1) as sequências que codificam os genes de interesse (B. tabaciaquaporina 1: BtDrip1; B. tabaci aquaporina 2: BtDrip2_v1) fundido em grelha com uma variante da proteína fluorescente verde chamado EGFP ou (2) os marcadores subcelulares (receptor do péptido de Drosophila melanogaster sexo: DmSPR; Homo sapiens fosfolipase A2: HsPLA2) com a sequência de codificação mCherry. Directamente ligar os produtos finais OE-PCR no plasmídeo pIB / V5-His-TA.
   1. Para o primeiro ciclo de OE-PCR (indicado por AD e A'-D' na Figura 1), utilizar um iniciador específico do gene sentido (mostrada em negrito na Tabela 1) e um iniciador anti-sentido quimico (em itálico no Quadro 1) que corresponde para o de 15 pb final (sem o codão de terminação) do gene de interesse marcador / subcelular e de 15 pb da extremidade 5 'da proteína fluorescente desejada (EGFP ou mCherry) para gerar um produto com um extremo saliente 3' .
      Nota: Ver Tabela 2 para as condições de PCR.
   2. Num tubo separado, utilizar um gene-especific iniciador anti-sentido da proteína fluorescente (mostrado com um sublinhado na Tabela 1) e um iniciador de sentido quimérico que contém 15 pb da extremidade 3 'do gene de interesse marcador / subcelular e 15 pb a partir da extremidade 5' da desejada fluorescente proteína para gerar um produto com uma saliência 5' .
      Nota: Ver Tabela 2 para as condições de PCR. O molde de PCR pode ser um produto de PCR validado-sequência ou, mais preferencialmente, ADN de plasmídeo que alberga a sequência desejada. O estudo descrito aqui usa plasmídeos validado de sequência.
   3. Separa-se os produtos de PCR por electroforese em gel de agarose a 1% de agarose (utilizando o padrão de grau molecular).
   4. Consumo e purificar os produtos com os tamanhos esperados (ver Tabela 2) utilizando um kit de extraco de gel de DNA comercialmente disponíveis (ver a tabela de materiais para o kit específico utilizado neste protocolo).
   5. Utilizar os produtos de PCR purificados em gel a partir do passo 1.1.4 para gerar a sobreposição final Eprodutos xtension (indicado por A '' - D '' na Figura 1). Utilizar um iniciador com sentido específico para o gene para o gene de interesse marcador / subcelular e o correspondente iniciador anti-sentido específico para o gene para a proteína fluorescente para gerar a sequência quimérica desejado.
      Nota: Ver Tabela 2 para as condições de PCR. Pode ser necessário determinar empiricamente as quantidades óptimas de primeira rodada produtos de extensão de sobreposição para adicionar à mistura de reacção para se obter o comprimento total do produto final, quimérico PCR.
   6. Separa-se os produtos de segunda ordem OE-PCR por electroforese em gel de agarose a 1%. Consumo e purificar os produtos usando um kit de extração de gel de ADN comercialmente disponível.
   7. Incubar de segunda ordem produtos OE-PCR purificados em gel com 1 unidade de ADN polimerase Taq mistura principal durante 10 min a 72 ° C, para gerar os produtos de 3' adenilada (isto é, A-tailed) necessários para a clonagem TA.
   8. Ligadura dos produtos adenilada resultantesno vector de expressão pIB e usar técnicas de clonagem molecular convencionais para transformar células de Escherichia coli quimicamente competentes (choque térmico) ou electrocompetentes (electroporação). Durante a noite placa em meio contendo o marcador de selecção apropriado (isto é, a ampicilina ou a carbenicilina).
   9. Realizar PCR de colias ¹² utilizando um iniciador específico do vector e um iniciador específico do inserto para identificar colónias de inserção-positiva que foram transformadas com os plasmídeos de expressão abrigando uma inserção na orientação 5'-3' . Preparar culturas durante a noite de colónias que geram produtos de PCR com os tamanhos esperados.
   10. Isolar o ADN de plasmídeo utilizando um kit de purificação de ADN disponível comercialmente de acordo com as instruções do fabricante (ver o Quadro Materiais para o kit específico utilizado neste protocolo). Validar a integridade da sequência de cada inserção por sequenciação de ADN directa.

2. Manutenção Cultura de Células de inseto

Nota: Para manter condições estéreis, realizar todas as manipulações de células que requerem a abertura do frasco de cultura de tecido dentro de uma câmara de fluxo laminar. Ligar a lâmpada germicida de UV exaustor de fluxo laminar, pelo menos, 1 h antes de manipulações das células. Usar luvas de borracha nitrílica e descontaminar a superfície da bancada, pipetas, utensílios, tubos e garrafas com etanol a 70% antes da sua utilização. A familiaridade com técnicas básicas de cultura de células é recomendado ^13.

1. Use células TNI (uma linha de cultura celular estabelecida derivada de Trichoplusia ni tecido do ovário) que estão adaptados para meio isento de soro e mantê-los como uma cultura em monocamada aderente em meio de insectos isento de soro a 28 ° C em frascos de cultura de tecidos T25.
2. Manter as células Sf9 (uma linha de cultura celular estabelecida derivada de Spodoptera frugiperda tecido ovariano) Do mesmo modo, mas utilizando TNM-FH de cultura de insectos de suplemento médioed com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS).
3. Semear a cultura inicial de células Sf9 congelado ou TNI removendo frascos de banco de -80 ° C e permitindo-lhes a descongelar em um banho de água a 37 ° C. Descontaminar os frascos com álcool 70% após o descongelamento e colocá-los no gelo.
4. Adicionar 4 ml de meio de células de insectos para um novo frasco T25 e transferir 1 ml da suspensão de células de insecto descongeladas. Colocar o balão em um 28 ° C, incubadora humidificada e não permitem que as células a aderir durante 30-45 min.
5. Substituir o meio de sementeira com 5 mL do meio apropriado e transferir os frascos a 28 ° C uma incubadora não humidificada. Monitorar confluência celular diária. Passagem das células quando atingirem 90% de confluência.
   Nota: A cobertura completa do frasco T25 corresponde a ~ 5 x 10 ⁶ culas.
6. Passagem de células de insecto.
   1. Para passagem, as células, primeiramente remover o meio exausto a partir do frasco contendo as células confluentes utilizando uma pipeta serológica 5 ml estéril.Inclinar o balão de modo a que o fluido passa para um canto, para longe da monocamada de células. Remova cuidadosamente o meio com uma pipeta sem perturbar as células.
   2. Desalojar as células TNI enxaguando suavemente os frascos T25 contendo a monocamada confluente com 4 mL de meio de insectos isento de soro utilizando nova, estéril, 5 mL pipeta serológica. Mover a ponta da pipeta entre o frasco e, lentamente, irrigar para remover as células fracamente ligadas ao balão de fundo.
      1. Entrada para o desprendimento adequado de células, removendo todos os meios, rodando o frasco durante, e observando-se que o fundo do frasco é clara.
   3. Para as células de Sf9, que aderem mais firmemente, adicionar 4 mL de meio TNM-FH fresco e utilizar um raspador de células para desalojar as células ligadas. Usar uma pipeta serológica 5 mL de misturar suavemente e reduzir a aglutinação de células.
   4. Utilizar um contador de células automatizado para estimar o número de células de insecto viáveis ​​por volume de meio. Transferir 0,1 mL da mistura de células / meio de um 1,5-mltubo de microcentrífuga. Num tubo de microcentruga separado de 0,5 ml, adicionar 10 mL de mistura de célula / meio a 10 uL de azul de tripano.
   5. Remover uma lâmina de câmara de contador de células da embalagem e adicionar 10? L do meio de mistura de células / / azul de tripano para cada lado da lâmina de contagem. Inserir a lâmina para o contador de células e determinar a densidade celular e viabilidade.
   6. Usando a densidade celular, calcular e adicionar o volume apropriado de meio de células de insectos (até 5 mL) para novos frascos T25, estéreis.
   7. Transferir cerca de 1-1,5 x 10 ⁶ células para frascos T25 com meio fresco; rotular os frascos com a linha de células, a data, o meio utilizado, o número de células adicionadas, e número de passagens (P _n + 1 geração, onde P _n é o número de passagem para a geração anterior de células); e colocar os frascos em uma incubadora C 28 ° C durante até 72 h.
      Nota: As células de insecto podem ser propagadas continuamente, embora as células podem ser menos receptivo a transfecção e / ou heterólogaexpressão da proteína após 30 passagens. Tratar todos descartados células / meios com uma solução de lixívia a 10% e autoclave utensílios de plástico descartável antes de ser descartado.

3. Insecto Transfecção celular

1. Semente um frasco T25 com até 1 x 10 ⁶ culas Sf9 TNI ou em um meio de células de insecto apropriado (meio de insectos isento de soro para Tni e TNM-FH para Sf9) e crescer até à confluência durante 72 h a 28 ° C.
2. Remover e descartar o meio antigo e desalojar as células com 4 mL de meio de insectos isento de soro fresco (ver passos 2.6.2 e 2.6.3, acima).
3. Estimar a densidade celular utilizando um contador de células automatizado (ver o passo 2.6.4, acima).
4. Adicionar cerca de 7 x 10 ⁵ células a pratos de vidro com fundo de 35 mm individuais e permitir que as células a aderir durante 20-25 min a 28 ° C.
5. Para cada transfeco, adiciona-se 2 ug de ADN de plasmídeo (quer a partir de um plasmídeo para transfecções individuais ou 2? G de cada um dos dois plasmídeos para fazertransfecções uble) a 0,1 mL de meio de insectos isento de soro (sem FBS para ambos Sf9 e transfecções TNI) em um tubo de microcentrifugação esterilizado de 1,5 mL.
6. Num tubo separado, mistura 8 mL de reagente de transfeco com 0,1 mL de meio de insectos isento de soro e, em seguida, transferir essa solução ao tubo contendo o DNA do plasmídeo de interesse. Levemente vortex e incubar à temperatura ambiente durante 20 - 30 min.
7. Dilui-se a mistura de plasmídeo-transfecção dos passos 3,5 e 3,6 com 0,8 mL de meio de insectos isento de soro, de modo que o volume total é igual a 1 mL.
8. Cuidadosamente remover os meios de comunicação a partir dos pratos de vidro contendo as células anexadas. Sobrepor as células anexadas com o meio de transfecção do plasmídeo-diluída.
9. Incubar as células a 28 ° C durante 5 h.
   Nota: As condições de transfecção requerem optimização empírica para a eficiência de transfecção máxima (por exemplo, a transfeco durante a noite, em vez de 5 h, a quantidade de DNA de plasmídeo usado, a química do reagente de transfecçãousados, etc.).
10. Remover e descartar o meio de transfecção e suavemente lavar as células com 1 ml de meio de insectos isento de soro, tendo cuidado para não deslocar células.
11. Adicionar 2 mL de meio de células de insecto fresco (meio de insectos isento de soro para Tni e TNM-FH para Sf9) e incubar a 28 ° C durante 48-72 h.
    Observação: Uma vez mais, as condições requerem optimização empírica para a expressão da proteína heteróloga máxima.

4. confocal microscopia de fluorescência

1. Em 48-72 h pós-transfecção, lavar as células uma vez com 1 mL de IPL-41 meio de insecto e, em seguida cobrir com 2 mL de IPL-41 para geração de imagens.
   Nota: Este passo de lavagem reduz o fundo auto-fluorescência observado com meio de células de insectos utilizada na manutenção de células normais.
2. Adicionar 4 gotas de reagente de coloração de Hoechst-de células vivas (ver a tabela de materiais para o corante nuclear específico utilizado neste protocolo) ao meio e incubar a 28 ° C durante 20-25 min.
   Nota: nuc adicionaismanchas lear pode ser substituído, embora o corante deve ter um perfil de fluorescência único a partir de EGFP e mCherry.
3. Coloque um prato de 35 mm no microscópio confocal de auto-fechado de varrimento a laser (ver a tabela de materiais para o instrumento específico utilizado neste protocolo).
4. Ajustar o microscópio para as condições de observação Hoechst, EGFP, e mCherry: Hoechst excitação / emissão - 359/461 nm; EGFP excitação / emissão - 489/510 nm; mCherry excitação / emissão - 580/610 nm.
5. Realizar uma verificação inicial utilizando uma objectiva de 10x para confirmar a expressão fluorescente e em seguida mudar para o modo de varrimento usando uma objectiva de contraste de imersão em água 60X fase.
6. Ajustar a potência do laser (5-7%), a sensibilidade do detector (47-49%), velocidade de varrimento, a profundidade do eixo Z, e zoom digital para optimizar o contraste de imagem e resolução. Imagem as células na 1.5X zoom digital para dar um total de amplificação de 90X.
   Nota: Os parâmetros Microscópio necessitar de ajuste empírico para optimalcoleção de imagens e pode ser específica para o instrumento em uso.
7. Exportar os dados brutos como arquivos de imagem TIFF e modificar (colheita e de sobreposição) para a figura geração.

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Resultados

OE-PCR

OE-PCR permite a síntese de produtos de ADN quiméricas que, uma vez inserida num vector de expressão, para permitir a produção de proteínas quiméricas recombinantes correspondentes a qualquer gene de teste de interesse e proteína marcador fluorescente. A Figura 1 representa um esquema geral para a produção de vectores de expressão contendo PIB B. sequências de codificação (BtDrip1 e ...

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Discussão

Sistemas de expressão de proteínas heterólogas são ferramentas importantes para a produção de proteínas recombinantes utilizadas em numerosas aplicações a jusante ^4. Escolhendo a partir de diversos sistemas de expressão disponíveis depende do objectivo final para a proteína de interesse. Vários sistemas de expressão em células de insecto estão disponíveis que oferecem alternativas flexíveis para sistemas de expressão de células procariotas e eucariotas ^5...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
KOD DNA Polymerase	EMD Millipore	71085-3	High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products
ExTaq DNA Polymerase	TaKaRa-Clontech	RR001B	DNA polymerase used for A-tailing of PCR products
EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix	Lucigen	30033-1	DNA polymerase used for bacterial colony PCR
Biometra TProfessional Gradient Thermocycler	Biometra/LABRepCo	070-851
Agarose LE	Benchmark Scientific	A1705
SYBR Safe DNA Gel Stain	ThermoFisher	S33102
Montage DNA Gel Extraction Kit	EMD Millipore	LSKGEL050
pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit	ThermoFisher	K89020	Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution.
QIAprep Spin MiniPrep Kit	Qiagen	27104
QIAcube Robotic Workstation	Qiagen	9001292
Purifier Vertical Clean Bench	Labconco	3970401
Tni cultured insect cell Line	Allele Biotech	ABP-CEL-10005
Sf9 cultured insect cell Line	Allele Biotech	ABP-CEL-10002
Serum-Free Insect Culture Medium	Allele Biotech	ABP-MED-10002
TNM-FH Insect Culture Medium	Allele Biotech	ABP-MED-10001
IPL-41 Insect Medium	ThermoFisher	11405081
Cellfectin II Transfection Reagent	ThermoFisher	10362100
16 cm Disposable Cell Scrapers	Sarstedt	83.1832	Cell scrapers with two-position blade
25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps	Life Science Products	CT-229331
Transfer Pipets	Fisher	1371120
Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes	Life Science Products	CT-229475
PipetteBoy	VWR	14222-180
5 mL Serological Pipettes	Sarstedt	86.1253.001
0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes	Fisher	14230200
Polypropylene Biohazard Autoclave Bags	Fisher	01828C
35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes	Matsunami Glass	D35-14-1.5-U	35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated
Incubator, Model 1510E	VWR	35823-961
Countess II FL Cell Counter	ThermoFisher	AMQAF1000
Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent	ThermoFisher	C10228
Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope	Olympus	FV10i-LIV
HsPLA2/pCS6 plasmid DNA	transOMIC Technologies	TCH1303
pmCherry Vector	Clontech	632522
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)	ThermoFisher	R37605