Espressione transitoria e Localizzazione cellulare di proteine ​​ricombinanti in cellule in coltura per insetti

Riepilogo

Nonlytic sistemi di espressione di cellule di insetto sono sottoutilizzate per la produzione, il traffico cellulare / localizzazione, e analisi funzionale proteina ricombinante. Qui, descriviamo metodi per generare vettori di espressione e successiva espressione proteica transiente in cellule lepidotteri disponibili in commercio. La co-localizzazione di Bemisia tabaci acquaporine con proteine marker fluorescenti subcellulare è anche presentato.

Abstract

Sistemi di espressione di proteine ​​eterologhi vengono utilizzati per la produzione di proteine ​​ricombinanti, l'interpretazione di cellulari traffico / localizzazione, e la determinazione della funzione biochimica delle proteine ​​a livello sub-organismi. Sebbene i sistemi di espressione baculovirus sono sempre più utilizzati per la produzione di proteine ​​in numerose biotecnologico, farmaceutico e applicazioni industriali, sistemi nonlytic che non coinvolgono infezione virale benefici evidenti ma sono spesso trascurati e sottoutilizzate. Qui, si descrive un metodo per la generazione di vettori di espressione nonlytic e l'espressione della proteina ricombinante transiente. Questo protocollo consente la localizzazione cellulare efficace delle proteine ​​ricombinanti e può essere utilizzato per discernere rapidamente proteina trafficking all'interno della cellula. Mostriamo l'espressione di quattro proteine ricombinanti in cellule di insetto commercialmente disponibile, inclusi due proteine acquaporina dalla insetto Bemisia tabaci, nonchécome proteine ​​marker subcellulari specifici per la membrana plasmatica delle cellule e per lisosomi intracellulari. Tutte le proteine ​​ricombinanti sono state prodotte come chimere con marcatori proteici fluorescenti a loro termini carbossile, che consente la rilevazione diretta delle proteine ​​ricombinanti. La doppia transfezione di cellule con plasmidi ospitare costrutti per i geni di interesse e di un marcatore subcellulare noto consente per l'imaging cellulare dal vivo e una migliore validazione di localizzazione delle proteine ​​cellulari.

Introduzione

La produzione di proteine ​​ricombinanti utilizzando sistemi di espressione di cellule di insetto offre numerosi vantaggi per lo studio delle proteine ​​eucariotiche. Cioè, cellule di insetto possiedono simili modificazioni post-traduzionali, elaborazione e smistamento meccanismi come quelli presenti in cellule di mammifero, che è vantaggioso per la produzione di proteine correttamente ripiegate ^{1, 2, 3.} Sistemi cellulari di insetto anche in genere richiedono meno risorse e meno tempo e fatica per la manutenzione di linee cellulari di mammiferi ^{4, 5.} Il sistema di espressione baculovirus è uno di questi sistemi a base di cellule di insetto che è ora ampiamente utilizzato in molte discipline, compresa la produzione di proteine ​​ricombinanti per la caratterizzazione delle proteine ​​e terapie, la presentazione immunogenico di peptidi esteri e proteine ​​virali per la produzione di vaccini, la sintesi di multi complessi -Concentrati, La produzione di proteine glicosilata, ecc. ^{1, 2, 4, 6.} Esistono, tuttavia, situazioni in cui l'espressione baculovirus possono non essere applicabile ^{3, 7,} e l'uso di sistemi di espressione insetti nonlytic e transitori può essere più appropriato. Specificamente, l'espressione cellulare di insetto transiente offre la possibilità per la rapida sintesi di proteina ricombinante, richiede meno sviluppo e manutenzione, non comporta lisi cellulare virale imposto, e fornisce un mezzo per studiare meglio il traffico cellulare durante la sintesi proteica ^{7, 8, 9, 10.}

Questo protocollo descrive la rapida generazione di vettori di espressione usando due passaggi overlap extension PCR (OE-PCR) ^{11 e la clonazione standard DNA plasmidico in Escherichia coli. I plasmidi sono utilizzati per doppio trasfezione disponibili in commercio cellule di insetto coltivate e producono proteine ​​rappresentativi. Il protocollo descrive la produzione e l'uso di due differenti proteine marker subcellulare fluorescenza marcata e dimostra colocalizzazione con due proteine acquaporina dalla insetto tabaci Bemisia. Il protocollo che segue fornisce la metodologia di base per OE-PCR, manutenzione insetto cellulare e trasfezione, e microscopia a fluorescenza per la localizzazione cellulare delle proteine ​​target.}

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Protocollo

1. OE-PCR per la costruzione di plasmidi di espressione

Nota: Vedi Tabella 1 per tutti i primer utilizzati in OE-PCR. L'uso di un DNA polimerasi ad alta fedeltà è consigliato per tutte le amplificazioni. Tuttavia, poiché questi enzimi spesso non lasciano 3' A, è necessario effettuare una breve non amplificando incubazione, con una polimerasi Taq DNA a 'A-coda' della PCR prodotti prima loro clonaggio in un'espressione TA cellula di insetto vettore. Questo protocollo illustra un metodo per generare i plasmidi di espressione insetti ospitare proteine chimeriche, con le proteine fluorescenti fuse in-frame al terminale carbossilico dei geni di interesse (in questo caso, a due tabaci acquaporina proteine Bemisia) o proteine marker subcellulari (Figura 1).

1. Utilizzare OE-PCR, che consiste di due cicli di amplificazione indipendenti, per generare: (1) sequenze codificanti i geni di interesse (B. tabaciacquaporina 1: BtDrip1; B. tabaci acquaporina 2: BtDrip2_v1) fusa in-frame con una variante proteina fluorescente verde chiamato EGFP o (2) i marcatori subcellulari (peptide recettore Drosophila melanogaster sesso: DmSPR; Homo sapiens fosfolipasi A2: HsPLA2) con la sequenza codificante mCherry. legare direttamente i prodotti finali OE-PCR nel plasmide pIB / V5-His-TA.
   1. Per il primo giro di OE-PCR (indicato da AD e A'-D' in figura 1), utilizzare un primer senso gene-specifico (mostrato in grassetto nella tabella 1) e un primer antisenso chimerico (in corsivo nella tabella 1) corrispondente alla finale 15 bp (senza il codone di stop) del gene di interesse / marcatore subcellulare e 15 bp del 5'-end della proteina fluorescente desiderato (EGFP o mCherry) per generare un prodotto con un sbalzo 3' .
      Nota: Vedere la Tabella 2 per le condizioni di PCR.
   2. In un tubo separato, utilizzare un gene-specific fluorescente innesco antisenso proteina (mostrato con una sottolineatura nella Tabella 1) e un primer senso chimerico contenente 15 bp all'estremità 3 'del gene di interesse / marcatore subcellulare e 15 bp dal 5'-end del fluorescente desiderato proteine ​​per generare un prodotto con un sbalzo 5' .
      Nota: Vedere la Tabella 2 per le condizioni di PCR. Il modello PCR può essere un prodotto di PCR sequenza convalidato o, più preferibilmente, il DNA plasmidico ospitare la sequenza desiderata. Lo studio qui descritto utilizza plasmidi sequenza-convalidato.
   3. Separare i prodotti PCR con 1% gel di agarosio (utilizzando le normali agarosio molecolare-grade).
   4. Accise e purificare i prodotti delle dimensioni attese (vedi Tabella 2) usando un kit di estrazione del DNA gel disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali per il kit specifico utilizzato in questo protocollo).
   5. Utilizzare i prodotti di PCR gel-purificati dal punto 1.1.4 per generare il ricoprimento eprodotti XTension (indicate con A '' - D '' in Figura 1). Utilizzare un primer senso gene-specifico per il gene di interesse / marcatore subcellulare e il corrispondente gene-specifico primer antisenso per la proteina fluorescente per generare la sequenza chimerica desiderata.
      Nota: Vedere la Tabella 2 per le condizioni di PCR. Può essere necessario determinare empiricamente la quantità ottimale di primo turno prodotti di estensione sovrapposizione aggiungere alla miscela di reazione per ottenere il pieno-lunghezza del prodotto finale chimerico PCR.
   6. Separare il secondo turno OE-PCR prodotti di 1% gel di agarosio. Accise e purificare i prodotti usando un kit di estrazione del DNA gel disponibile in commercio.
   7. Incubare di secondo OE-PCR prodotti gel-purificata con 1 unità di Taq DNA polimerasi maestro miscela per 10 min a 72 ° C per generare i prodotti (cioè A-code) 3' adenylated necessari per TA clonazione.
   8. Legare i prodotti risultanti adenylatednel vettore di espressione pIB e utilizzando tecniche di clonazione molecolare standard per trasformare chimicamente competenti (shock termico) o elettrocompetenti (elettroporazione) cellule di Escherichia coli. Overnight piastra sul terreno contenente il marcatore di selezione appropriata (cioè, ampicillina o carbenicillina).
   9. Eseguire colonia PCR ¹² utilizzando un primer specifico vettoriale e un primer specifico inserto per identificare colonie insert-positivi che sono state trasformate con i plasmidi di espressione ospitare un inserto nell'orientamento 5'-3' . Preparare colture overnight di colonie generando prodotti PCR delle dimensioni attese.
   10. Isolare DNA plasmidico utilizzando un kit disponibile in commercio purificazione del DNA secondo le istruzioni del produttore (si veda la tabella Materiali per il kit specifico utilizzato in questo protocollo). Convalidare l'integrità sequenza di ciascun inserto mediante sequenziamento diretto del DNA.

2. Insetto coltura cellulare Manutenzione

Nota: Per mantenere condizioni sterili, effettuare tutte le manipolazioni cellulari che richiedono l'apertura del pallone di coltura di tessuto all'interno di una cappa a flusso laminare. Accendere la lampada germicida UV cappa a flusso laminare almeno 1 h prima manipolazioni cellulari. Indossare guanti nitrile e decontaminare la superficie del banco, pipette, utensili, tubi e boccette con etanolo al 70% prima del loro utilizzo. Familiarità con tecniche di base di coltura cellulare è raccomandato ^13.

1. Utilizzare cellule TNI (a linea coltura cellulare stabilito derivante dalla Trichoplusia tessuto ovarico ni) atti a mezzo privo di siero e mantenerli come coltura monostrato aderente in terreno insetto privo di siero a 28 ° C in T25 palloni di coltura tissutale.
2. Mantenere le cellule Sf9 (una linea di coltura cellulare stabilito derivante dalla Spodoptera frugiperda tessuto ovarico) Analogamente ma utilizzando TNM-FH cultura insetto mezzo integratorecato con 10% siero fetale bovino (FBS).
3. Seme della cultura iniziale da Sf9 o cellule TNI congelato rimuovendo azionari fiale da -80 ° C e permettendo loro di scongelare in un bagno d'acqua a 37 ° C. Decontaminare le fiale con il 70% di etanolo dopo lo scongelamento e disporli sul ghiaccio.
4. Aggiungere 4 ml di mezzo cellula di insetto in un pallone T25 e trasferimento 1 ml di sospensione cellulare di insetto scongelati. Porre il pallone in un 28 ° C, incubatore non umidificata e permettono alle cellule di fissare per 30-45 min.
5. Sostituire il mezzo semina con 5 mL del mezzo appropriato e trasferire i flaconi ad un 28 ° C incubatore non umidificato. Monitorare confluenza delle cellule al giorno. Passage le cellule quando raggiungono il 90% di confluenza.
   Nota: Copertura completa di pallone T25 corrisponde a ~ 5 x 10 ⁶ cellule.
6. Passaggio della cella di insetto.
   1. Per il passaggio delle cellule, prima rimuovere il mezzo esausto dal pallone contenente cellule confluenti utilizzando una sterile 5 ml pipetta sierologica.Inclinare il pallone in modo che il fluido scorre verso un angolo, lontano dal monostrato cellulare. Rimuovere con attenzione il supporto con una pipetta senza disturbare le cellule.
   2. Rimuovere le cellule tni risciacquando delicatamente le fiasche T25 contenenti il ​​monostrato confluente con 4 ml di terreno di insetto privo di siero utilizzando nuovo, sterile, 5 mL pipetta sierologica. Spostare la punta della pipetta attraverso il pallone e lentamente l'irrigazione per rimuovere le cellule debolmente attaccati al fondo fiasco.
      1. Verificare l'adeguato distacco delle cellule, eliminando tutti i supporti, ruotando la beuta sopra, ed osservando che il fondo del pallone è chiara.
   3. Per le cellule Sf9, che aderiscono più strettamente, aggiungere 4 mL di terreno TNM-FH fresco e utilizzare un raschietto cella per rimuovere le cellule attaccate. Utilizzare una pipetta sierologica 5 ml a mescolare delicatamente e ridurre aggregazione delle cellule.
   4. Utilizzare un contatore automatico di cellule per stimare il numero di cellule di insetto vitali per volume di terreno. Trasferire 0,1 ml di cellule / medio impasto a 1,5 mLprovetta da microcentrifuga. In una provetta da microcentrifuga da 0,5 mL separato, aggiungere 10 ml di cellule / medio impasto a 10 ml di trypan blu.
   5. Rimuovere un vetrino camera contaglobuli dalla confezione e aggiungere 10 microlitri della / medio impasto blu cellula / trypan a ciascun lato della diapositiva conteggio. Inserire il vetrino nel contatore delle cellule e determinare la densità cellulare e la vitalità.
   6. Utilizzando la densità cellulare, calcolare e aggiungere il corretto volume del mezzo di cellule di insetto (fino a 5 mL) a nuovi, fiasche T25 sterili.
   7. Trasferire circa 1-1,5 x 10 ⁶ cellule per fiaschi T25 con mezzi freschi; etichettare i flaconi con la linea cellulare, data, mezzo utilizzato, il numero di cellule aggiunto e numero di passaggio (P _n + 1 generazione, dove P _n è il numero di passaggio per la precedente generazione di cellule); e posizionare i contenitori in un incubatore a 28 ° fino a 72 h.
      Nota: cellule di insetto possono essere continuamente propagate, sebbene le cellule possono essere meno ricettivo a trasfezione e / o eterologoespressione della proteina dopo 30 passaggi. Trattare tutti scartato cellule / media con soluzione di candeggina al 10% e autoclave ware plastica monouso prima dello smaltimento.

3. Insect cellule trasfezione

1. Inizializzare una beuta T25 con fino a 1 x 10 ⁶ cellule tni o Sf9 in un mezzo appropriato cellula di insetto (mezzo privo di siero per insetti Tni e TNM-FH per Sf9) e crescere per confluenza per 72 ore a 28 ° C.
2. Rimuovere e scartare il vecchio medio e sloggiare le cellule con 4 ml di terreno fresco insetto privo di siero (vedere i passi 2.6.2 e 2.6.3, sopra).
3. Stimare la densità cellulare utilizzando un contatore automatico di cellule (vedere fase 2.6.4, sopra).
4. Aggiungere circa 7 x 10 ⁵ cellule ai piatti fondo di vetro individuali 35 mm e permettono alle cellule di fissare per 20-25 min a 28 ° C.
5. Per ogni trasfezione, aggiungere 2 pg di DNA plasmidico (sia da un plasmide per singoli trasfezioni o 2 ug di ciascuno dei due plasmidi per Dotrasfezioni üble) a 0,1 ml di mezzo di insetto senza siero (senza FBS sia Sf9 e trasfezioni TnI) in una sterile 1,5 mL provetta da microcentrifuga.
6. In un tubo separato, mescolare 8 ml di reagente di trasfezione con 0,1 ml di terreno di insetto senza siero e poi trasferire tale soluzione al tubo contenente il DNA plasmidico di interesse. Leggermente vortice e incubare a temperatura ambiente per 20 - 30 min.
7. Diluire la miscela plasmide-trasfezione dalle fasi 3.5 e 3.6 con 0,8 ml di terreno di insetto senza siero modo che il volume totale equivale a 1 ml.
8. rimuovere accuratamente i supporti dai piatti di vetro contenenti cellule attaccate. Sovrapporre le cellule attaccate con il mezzo-trasfezione plasmide diluito.
9. Incubare le cellule a 28 ° C per 5 h.
   Nota: Le condizioni per la trasfezione richiedono ottimizzazione empirico per efficienza di trasfezione massima (ad esempio, trasfezione overnight anziché 5 h, la quantità di DNA plasmidico utilizzato, la chimica del reagente di trasfezioneusato, ecc.).
10. Rimuovere ed eliminare il mezzo di trasfezione e lavare delicatamente le cellule con 1 ml di mezzo privo di siero insetto, facendo attenzione a non staccare le cellule.
11. Aggiungere 2 ml di mezzo di cellule di insetto fresco (privo di siero medio insetti per Tni e TNM-FH per Sf9) e incubare a 28 ° C per 48-72 ore.
    Nota: Anche in questo caso, le condizioni lo richiedono ottimizzazione empirica per l'espressione della proteina eterologa massima.

4. confocale microscopia a fluorescenza

1. A 48-72 h dopo la trasfezione, le cellule lavare una volta con 1 ml di IPL-41 medio insetto e poi coprire con 2 mL di IPL-41 per l'imaging.
   Nota: Questa fase di lavaggio riduce lo sfondo auto-fluorescenza osservato con mezzo di cellule di insetto utilizzato nella normale manutenzione delle cellule.
2. Aggiungere 4 gocce di reagente Hoechst colorazione live-cell (vedere la tabella di materiali per l'colorazione nucleare specifica utilizzata in questo protocollo) al mezzo e incubare a 28 ° C per 20-25 min.
   Nota: NUC aggiuntivemacchie Lear potranno essere sostituiti, anche se il colorante dovrebbe avere un profilo fluorescenza unico da EGFP e mCherry.
3. Posizionare una piastra da 35 mm nella scansione laser sé racchiuso microscopio confocale (vedere la tabella dei materiali per lo strumento specifico utilizzato in questo protocollo).
4. Regolare il microscopio per condizioni di osservazione Hoechst, EGFP, e mCherry: Hoechst eccitazione / emissione - 359/461 nm; EGFP eccitazione / emissione - 489/510 nm; mCherry eccitazione / emissione - 580/610 nm.
5. Eseguire una prima scansione utilizzando un obiettivo 10x per confermare l'espressione fluorescente e quindi passare alla modalità di scansione utilizzando un obiettivo contrasto acqua-immersione 60X fase.
6. Regolare la potenza del laser (5-7%), sensibilità del rivelatore (47-49%), la velocità di scansione, profondità Z, e zoom digitale per ottimizzare il contrasto e risoluzione dell'immagine. Immagine le cellule a 1.5X zoom digitale per dare un totale di 90X di amplificazione.
   Nota: i parametri del microscopio richiedono una regolazione empirica ottimaleraccolta di immagini e può essere specifico per lo strumento in uso.
7. Esportare i dati grezzi come file di immagini TIFF e modificare (colture e sovrapposizione) per la generazione di figura.

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Risultati

OE-PCR

OE-PCR consente la sintesi di prodotti di DNA chimeriche che, una volta inserito in un vettore di espressione, per consentire la produzione di proteine ​​chimeriche ricombinanti corrispondenti a qualsiasi gene prova di interesse e l'proteina marcatore fluorescente. La figura 1 rappresenta uno schema generale per la produzione di vettori di espressione contenenti PiB B. aquaporin tabaci...

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Discussione

Sistemi di espressione di proteine eterologhe sono strumenti importanti per la produzione di proteine ricombinanti utilizzati in numerose applicazioni a valle ^4. Scegliendo tra i diversi sistemi di espressione disponibili dipende l'obiettivo finale per la proteina di interesse. Diversi sistemi di espressione delle cellule di insetto sono disponibili che offrono alternative flessibili per sistemi di espressione delle cellule procariote ed eucariote ^5,

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
KOD DNA Polymerase	EMD Millipore	71085-3	High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products
ExTaq DNA Polymerase	TaKaRa-Clontech	RR001B	DNA polymerase used for A-tailing of PCR products
EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix	Lucigen	30033-1	DNA polymerase used for bacterial colony PCR
Biometra TProfessional Gradient Thermocycler	Biometra/LABRepCo	070-851
Agarose LE	Benchmark Scientific	A1705
SYBR Safe DNA Gel Stain	ThermoFisher	S33102
Montage DNA Gel Extraction Kit	EMD Millipore	LSKGEL050
pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit	ThermoFisher	K89020	Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution.
QIAprep Spin MiniPrep Kit	Qiagen	27104
QIAcube Robotic Workstation	Qiagen	9001292
Purifier Vertical Clean Bench	Labconco	3970401
Tni cultured insect cell Line	Allele Biotech	ABP-CEL-10005
Sf9 cultured insect cell Line	Allele Biotech	ABP-CEL-10002
Serum-Free Insect Culture Medium	Allele Biotech	ABP-MED-10002
TNM-FH Insect Culture Medium	Allele Biotech	ABP-MED-10001
IPL-41 Insect Medium	ThermoFisher	11405081
Cellfectin II Transfection Reagent	ThermoFisher	10362100
16 cm Disposable Cell Scrapers	Sarstedt	83.1832	Cell scrapers with two-position blade
25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps	Life Science Products	CT-229331
Transfer Pipets	Fisher	1371120
Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes	Life Science Products	CT-229475
PipetteBoy	VWR	14222-180
5 mL Serological Pipettes	Sarstedt	86.1253.001
0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes	Fisher	14230200
Polypropylene Biohazard Autoclave Bags	Fisher	01828C
35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes	Matsunami Glass	D35-14-1.5-U	35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated
Incubator, Model 1510E	VWR	35823-961
Countess II FL Cell Counter	ThermoFisher	AMQAF1000
Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent	ThermoFisher	C10228
Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope	Olympus	FV10i-LIV
HsPLA2/pCS6 plasmid DNA	transOMIC Technologies	TCH1303
pmCherry Vector	Clontech	632522
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)	ThermoFisher	R37605