JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Nonlytic системы экспрессии клеток насекомых недостаточно для производства, торговли сотовой / локализации, а также рекомбинантного белка функционального анализа. Здесь мы описываем методы для генерации векторов экспрессии и последующей кратковременной экспрессию белка в коммерчески доступных чешуекрылых клеточных линиях. Совместно локализация Bemisia tabaci аквапоринов с субклеточных флуоресцирующих белков - маркеров также представлены.

Аннотация

Гетерологичных системах экспрессии белка используются для получения рекомбинантных белков, интерпретация клеточного оборота / локализации, а также определение биохимической функции белков в суб-организменном уровне. Хотя выражение бакуловирусных системы все чаще используются для производства белка в многочисленных биотехнологическом, фармацевтическом и промышленных применениях, nonlytic систем, которые не связаны с вирусной инфекцией имеют очевидные преимущества, но часто упускаются из вида и недостаточно. Здесь мы опишем способ генерации nonlytic векторов экспрессии и переходную экспрессии рекомбинантного белка. Этот протокол позволяет эффективно клеточной локализации рекомбинантных белков и может быть использован для быстрого перемещения белков различить внутри клетки. Покажет экспрессию четыре рекомбинантных белков в коммерчески доступной линии клеток насекомых, в том числе двух аквапориных белков из насекомых Bemisia tabaci, а такжев субклеточных маркерных белков, специфичных для плазматической мембраны клетки и внутриклеточные лизосомы. Все рекомбинантные белки получали в виде химер с флуоресцентными маркерами белка в их карбоксильных концах, что позволяет для прямого обнаружения рекомбинантных белков. Двойная трансфекция клеток плазмид, несущие конструкции для генов, представляющего интереса и известных субклеточных маркеров позволяет клетки живого изображения и улучшенной проверке локализации клеточного белка.

Введение

Получение рекомбинантных белков с использованием насекомыми системы экспрессии клеток предлагает многочисленные преимущества для изучения эукариотических белков. А именно, клетки насекомых обладают сходными посттрансляционными модификациями, обработку и сортировки механизмов , как присутствующие в клетках млекопитающих, что является предпочтительным для получения правильно свернутых белков 1, 2, 3. Системы клеток насекомых , как правило , также требуют меньше ресурсов и меньше времени и усилий для поддержания чем клеточных линий млекопитающих 4, 5. Система экспрессии бакуловируса является одним из таких насекомых клеточной системы на основе, которая в настоящее время широко используется во многих областях, в том числе получения рекомбинантных белков для белка характеристик и терапевтических средств, иммуногенной презентации чужеродных пептидов и вирусных белков для производства вакцин, синтеза мульти -protein комплексы, Производство гликозилированных белков и т.д.. 1, 2, 4, 6. Есть, однако, ситуации , в которых бакуловирус выражение не может быть применимо 3, 7, а также использование nonlytic и переходных систем экспрессии насекомых может быть более подходящим. В частности, выражение переходных клеток насекомых дает возможность для быстрого синтеза рекомбинантного белка, требует меньше усилий и техническое обслуживания, не включает в себя вирусный взимаемые лизис клеток, а также предоставляют средства для лучшего изучения клеточной торговли людей во время синтеза белка 7, 8, 9, 10.

Этот протокол описывает быстрое формирование векторов экспрессии, используя два этапа расширения перекрытия ПЦР (ОЕ-ПЦР) 11 и стандартное клонирование ДНК плазмиды в кишечной палочке. Плазмиды используются для двойной трансфекции коммерчески доступные культивируемые клеток насекомых, и для получения репрезентативных белков. Протокол описывает производство и использование двух различных флуоресцентно меченных белков субклеточных маркеров и демонстрирует колокализацию с двумя аквапорин белков из насекомых Bemisia tabaci. Следующий протокол обеспечивает базовую методологию для OE-PCR, насекомых поддержания клеток и трансфекции, и флуоресцентной микроскопии для клеточной локализации белков-мишеней.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. OE-PCR для строительства экспрессирующих плазмид

Примечание: В таблице 1 для всех праймеров , используемых в OE-PCR. Использование ДНК-полимеразы высокой точности рекомендуется для всех усилений. Однако, поскольку эти ферменты часто не оставляют 3' А, необходимо выполнить краткие, не-усилительные инкубации с полимеразой Taq ДНК с „А-хвостом“ продукты ПЦРА перед клонированием их в выражение клеточного насекомых Т.А. вектор. Этот протокол демонстрирует способ для генерации насекомых экспрессии плазмиды , несущая химерных белки, с флуоресцентными белками , слитых в рамке считывания с карбоксильным концом генов , представляющего интереса (в данном случае, к двум Bemisia tabaci аквапорина белков) или субклеточным белкам - маркеров (рис 1).

  1. Используйте OE-PCR, который состоит из двух независимых циклов амплификации, для генерации: (1) последовательности , кодирующие гены , представляющие интерес (Б. tabaciаквапорин 1: BtDrip1; Б. tabaci аквапорин 2: BtDrip2_v1) , слитый в рамке с зеленым флуоресцентным белком вариант под названием EGFP , или (2) субклеточных маркеров (дрозофилы пол пептид рецептора: DmSPR; гомо сапиенс фосфолипазы А2: HsPLA2) с кодирующей последовательностью mCherry. Непосредственно лигировании конечных продуктов ОГО-ПЦР в плазмиду ПИБ / V5-His-TA.
    1. Для первого раунда OE-PCR (обозначенный AD и А'-D»на рисунке 1), используют ген-специфический смысловой праймер (показанный жирным шрифтом в таблице 1) и химерного антисмыслового праймера (выделены курсивом в таблице 1) , соответствующих до конечной 15 пар оснований (без стоп-кодона) гену интереса / субклеточных маркеров и 15 п.о. 5'-конца желаемого флуоресцентного белка (EGFP или mCherry), чтобы генерировать продукт с свесом 3' .
      Примечание: В таблице 2 условий ПЦР.
    2. В отдельной пробирке, используют ген-specifIC флуоресцентный белок антисмыслового праймер (показан с подчеркиванием в таблице 1) и химерный смысловой праймером , который содержит 15 пар оснований с 3'-конца гена интереса / субклеточных маркера и 15 пар оснований от 5'-конца желаемого флуоресцентного белок, чтобы генерировать продукт с свесом 5' .
      Примечание: см таблицу 2 для условий ПЦР. Шаблон ПЦР может быть либо последовательностью подтверждено ПЦР-продукт или, более предпочтительно, плазмидной ДНК, несущий желаемую последовательность. Исследование, описанное здесь, использует последовательность апробирована плазмиды.
    3. Отдельные продукты ПЦР с 1% электрофореза в агарозном геле (с использованием стандартных молекулярно-класса агарозы).
    4. Акциз и очистить продукты ожидаемого размера (смотри таблицу 2) с использованием коммерчески доступного набора для экстракции геля ДНК (смотри таблицу материалов для конкретного набора , используемого в данном протоколе).
    5. С помощью гель-очищенных ПЦР-продуктов со стадии 1.1.4 для создания окончательного перекрытия еXtension изделия (обозначается A '' - D '' на фиг.1). Используйте ген-специфический смысловой праймер для интересующего гена / маркеров субклеточных и соответствующего ген-специфического антисмыслового праймера для флуоресцентного белка, чтобы генерировать желаемую химерную последовательность.
      Примечание: см таблицу 2 для условий ПЦР. Это может быть необходимо, чтобы эмпирически определить оптимальные количества первого раунда расширения продуктов перекрытия, чтобы добавить к реакционной смеси с получением конечного, полной длины химерного продукта ПЦР.
    6. Отделить вторые круглые продукты ОГО-ПЦР на 1% электрофорезе в агарозном геле. Акциз и очистки продуктов с использованием коммерчески доступного набора для экстракции геля ДНК.
    7. Инкубировать гель-очистке второго круглых продуктов ОЕ-ПЦР с 1 единицу Taq - ДНК - полимеразы мастер смеси в течение 10 мин при 72 ° C , чтобы генерировать 3' adenylated (т.е. А-хвостатых) продукты , необходимые для клонирования TA.
    8. Лигирования в результате adenylated продуктыв вектор экспрессии ПИБ и использовать стандартные методы молекулярного клонирования для трансформации химически компетентных (теплового шока) или Электрокомпетентные (электропорации) клетки кишечной палочки. Тарелка в течение ночь на среду , содержащей соответствующий маркер выбора (то есть, ампициллин или карбенициллин).
    9. Выполните ПЦР колоний 12 с использованием вектора-специфического праймера и праймера вставки специфичные для идентификации вставки-позитивные колонии , которые были трансформированы с экспрессирующие плазмиды , несущие вставки в ориентации 5'-3' . Приготовьте ночные культуры колоний, порождающих продуктов ПЦР ожидаемых размеров.
    10. Изолировать плазмидной ДНК с использованием коммерчески доступного набора для очистки ДНК в соответствии с инструкциями производителя (см Материалы таблицу для конкретного набора , используемого в данном протоколе). Проверка целостности последовательности каждой вставки путем прямого секвенирования ДНК.

2. Поддержание культуры клеток насекомых

Примечание: Для поддержания стерильных условий, проводить все манипуляции клеток, требующих открытие колбы культуры ткани в пределах колпака с ламинарным потоком. Включите ламинарный поток капота УФ бактерицидную лампу, по меньшей мере за 1 ч до клеточных манипуляций. Wear нитриловые перчатки и обеззаразить поверхность скамьи, пипетки, столовые приборы, трубки и колбы с 70% -ным этанолом перед их использованием. Знакомство с основными методами клеточной культуры рекомендуется 13.

  1. Используйте ВСИТЕ клетки (установленная для культивирования клеток линий получены из Trichoplusia щий ткани яичников), которые адаптированы к среде без сыворотки и поддерживать их в качестве клейкой монослойной культуры в среде насекомых без сыворотки при 28 ° С в T25 колбах для культуры ткани.
  2. Поддерживать клетки Sf9 (установленную культуру линии клеток , полученную из Spodoptera frugiperda ткани яичников) Аналогично , но с использованием TNM-FH культуры насекомых среднего дополненияред с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS).
  3. Семенной первоначальную культуру от замороженного Sf9 или ВСИ клеток путем удаления из запаса флаконов -80 ° С и дают им возможность оттаивать в водяной бане при 37 ° C. Обеззараживать ампулы с 70% этанолом после оттаивания и поместить их на льде.
  4. Добавить 4 мл среды клеток насекомых в новую колбу Т25 и перенос 1 мл талых насекомых клеточной суспензии. Поместите колбу в 28 ° C, не-увлажненном инкубаторе и позволяют клеткам прикрепляться в течение 30-45 мин.
  5. Заменить высев среду с 5 мл соответствующей среды и переносят в колбы на 28 ° C, не увлажненный инкубатор. Монитор клеток впадения ежедневно. Пассаж клетка, когда они достигают 90% сплошность.
    Примечание: Полный охват Т25 колбы соответствует ~ 5 × 10 6 клеток.
  6. Клеток насекомых проход.
    1. Для того, чтобы прохождение клеток, сначала удалить истощенную среду из колбы, содержащей сливные клеток с использованием стерильной 5 мл серологической пипетки.Наклон колбы таким образом, чтобы среда течет в одном углу, вдали от монослоя клеток. Аккуратно извлеките носитель с помощью пипетки, не нарушая клетки.
    2. Выбивать ВСИ клетки осторожно промывки колбы Т25, содержащую сливающийся монослой с 4 мл среды насекомых без сыворотки с использованием новой, стерильная, 5 мл серологической пипетки. Перемещение наконечник пипетки через колбу и медленно орошает, чтобы удалить клетки слабо прикрепленные к нижней части колбы.
      1. Проверьте наличие адекватного отрыва клеток путем удаления всех средств массовой информации, поворачивая колбу снова, и наблюдая, что дно колбы ясно.
    3. Для клеток Sf9, которые прилипают более плотно, добавить 4 мл свежей среды TNM-FH и использовать сотовый скребок, чтобы сместить прикрепленные клетки. С помощью серологической пипетки 5 мл осторожно перемешать и уменьшить клетки комкова.
    4. С помощью автоматизированного счетчика клеток для оценки количества жизнеспособных клеток насекомых на объем среды. Передача 0,1 мл / клеточной среде смеси до 1,5 млмикрофужная трубка. В отдельных 0,5 мл микроцентрифужной пробирки, добавляют 10 мкла клетки / средней смеси до 10 мкл трипанового синего.
    5. Удаление счетчика клеток в камере слайд из упаковки и добавить 10 мкл клеточной среды / / трипанового синего смеси в каждую сторону от счетной слайда. Вставьте слайд в счетчик клеток и определить плотность клеток и жизнеспособность.
    6. Используя плотность клеток, рассчитать и добавить собственный объем насекомых среды клеток (до 5 мл) к новым, стерильные колбы Т25.
    7. Передача примерно 1-1,5 × 10 6 клеток в колбы Т25 с свежей средой; маркировать колбы с клеточной линией, датой, используемой средой, количеством клеток , добавленным, и номером канала (P N + 1 поколением, где Р п является номером прохода для предыдущего поколения клеток); и помещают в колбы в инкубаторе C 28 ° до 72 ч.
      Примечание: Клетки насекомых могут непрерывно распространяться, хотя клетки могут быть менее восприимчивы к трансфекции и / или гетерологичномуэкспрессии белка после 30 пассажей. Рассматривать все отбрасывается клеток / носитель с 10% -ным раствором хлорной извести и автоклав одноразовой пластиковой посуды перед утилизацией.

3. Insect Cell Трансфекция

  1. Семенной в T25 колбу с до 1 × 10 6 ВСИ или Sf9 клетки в соответствующей клеточной среде насекомых (бессывороточную среда для насекомых ВСИ и TNM-FH для Sf9) и расти до конфлюэнтности в течение 72 ч при 28 ° С.
  2. Удаляют старую среду и сместить клетки с 4 мл среды насекомых свежей сыворотки (см шагов 2.6.2 и 2.6.3, выше).
  3. Оценка плотности клеток с использованием автоматического счетчика клеток (смотри стадию 2.6.4, выше).
  4. Добавить приблизительно 7 х 10 5 клеток на отдельные 35 мм с прозрачным дном посуды и позволяют клеткам прикрепляться в течение 20-25 мин при температуре 28 ° С.
  5. Для каждой трансфекции добавляют 2 мкг плазмидной ДНК (либо из одной плазмиды для одиночной или трансфекции 2 мкг из каждых из этих двух плазмид для делuble трансфекция) в 0,1 мл среды без сыворотки насекомых (без FBS для обоего Sf9 и ВСИТЕ трансфекции) в стерильных 1,5 мл микроцентрифужной пробирки.
  6. В отдельной пробирке, смешать 8 мкл реагента для трансфекции с 0,1 мл среды насекомых без сыворотки, а затем передать этот раствор в пробирку, содержащую плазмидную ДНК, представляющий интерес. Слегка вихрь и инкубируют при комнатной температуре в течение 20 - 30 мин.
  7. Развести плазмиды трансфекции смесь из шагов 3,5 и 3,6 с 0,8 мл среды насекомых без сыворотки, так что общий объем равен 1 мл.
  8. Аккуратно извлеките носитель из стеклянной посуды, содержащей прикрепленные клетки. Перекрытие прикрепленные клетки с разбавленной плазмиды трансфекции среды.
  9. Инкубируйте клетки при 28 ° С в течение 5 ч.
    Примечание: Условия для трансфекции требуют эмпирической оптимизации для максимальной эффективности трансфекции (например, в течение ночи трансфекции , а не 5 ч, количество плазмидной ДНК использовали, химический состав реагента для трансфекцииб и др.).
  10. Удаляем трансфекции среды и осторожно промыть клетки с 1 мл среды насекомых без сыворотки, осторожно, чтобы не сместить клетки.
  11. Добавьте 2 мл свежей среды клеток насекомых (не содержащую сыворотку среды без насекомых для ВСИ и TNM-FH для Sf9) и инкубируют при 28 ° С в течение 48-72 ч.
    Примечание: Опять же, условия требуют эмпирической оптимизации для максимальной экспрессии гетерологичных белков.

4. конфокальной флуоресцентной микроскопии

  1. В 48-72 ч после трансфекции, промыть клетки один раз 1 мл IPL-41 среды насекомых, а затем покрывают 2 мл IPL-41 для работы с изображениями.
    Примечание: Эта стадия промывки снижает фоновые автофлуоресценции наблюдаемых со средой клеток насекомых, используемой в обычном обслуживании клеток.
  2. Добавьте 4 капли Hoechst окрашивающего реагента живых клеток (смотрите таблицу материалов для конкретного ядерного красителя, используемого в данном протоколе) к среде и инкубируют при 28 ° С в течение 20-25 мин.
    Примечание: Дополнительная писLear пятно может быть замещено, хотя краситель должен иметь профиль флуоресценции уникальный от EGFP и mCherry.
  3. Поместите 35 мм блюдо в замкнуты лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (см таблицу материалов для конкретного инструмента, используемого в данном протоколе).
  4. Настройка микроскопа для условий наблюдения Хехст, EGFP и mCherry: Хехст возбуждения / эмиссии - 359/461 нм; EGFP возбуждения / эмиссии - 489/510 нм; mCherry возбуждения / эмиссии - 580/610 нм.
  5. Выполнить первоначальное сканирование с использованием 10x цели, чтобы подтвердить флуоресцентное выражение, а затем перейти в режим сканирования с помощью цели контраста вода-погружения в 60X фазы.
  6. Регулировка мощности лазера (5-7%), чувствительность детектора (47-49%), скорость сканирования, глубина Z-ось, а цифровое масштабирование, чтобы оптимизировать контрастность и разрешение изображения. Изображение клетки при 1.5X цифрового зума, чтобы дать в общей сложности 90x усиления.
    Примечание: Параметры микроскопов требуют эмпирической регулировки для оптимальнойколлекции изображений и могут быть специфическими для инструмента в использовании.
  7. Экспорт необработанных данных в виде файлов изображений TIFF и изменять (растениеводство и накладку) для генерации фигуры.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

ОЕ-ПЦР

ЫЙ-ПЦР позволяет для синтеза химерных продуктов ДНК, которые, как только вставленного в вектор экспрессии, позволяют для производства рекомбинантных химерных белков, соответствующих какого-либо тест интересующего гена и маркер?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Гетерологичные системы экспрессии белка являются важными инструментами для получения рекомбинантных белков , используемых во многих последующих применениях 4. Выбор из различных систем экспрессии, доступных в зависимости от конечной цели для интересующего белка. Нескол...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарим Линн Forlow-Jech и Данниол Лерой для оказания технической помощи. Эта работа была поддержана базой ЦИРИ финансирования для USDA ARS, Национальная программа 304 - Средства защиты растений и карантина [Проект № 2020-22620-022-00D] к JAF и JJH Упоминание торговых наименований или коммерческих продуктов в этой статье является исключительно для целей предоставления конкретной информации и не подразумевает рекомендацию или одобрение со стороны Министерства сельского хозяйства США. Министерство сельского хозяйства США равные возможности и работодателем.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
KOD DNA PolymeraseEMD Millipore71085-3High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products
ExTaq DNA PolymeraseTaKaRa-ClontechRR001BDNA polymerase used for A-tailing of PCR products
EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master MixLucigen30033-1DNA polymerase used for bacterial colony PCR
Biometra TProfessional Gradient ThermocyclerBiometra/LABRepCo070-851
Agarose LEBenchmark ScientificA1705
SYBR Safe DNA Gel StainThermoFisherS33102
Montage DNA Gel Extraction KitEMD MilliporeLSKGEL050
pIB/V5-His TOPO TA Expression KitThermoFisherK89020Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution.
QIAprep Spin MiniPrep KitQiagen27104
QIAcube Robotic WorkstationQiagen9001292
Purifier Vertical Clean BenchLabconco3970401
Tni cultured insect cell LineAllele BiotechABP-CEL-10005
Sf9 cultured insect cell LineAllele BiotechABP-CEL-10002
Serum-Free Insect Culture MediumAllele BiotechABP-MED-10002
TNM-FH Insect Culture MediumAllele BiotechABP-MED-10001
IPL-41 Insect MediumThermoFisher11405081
Cellfectin II Transfection ReagentThermoFisher10362100
16 cm Disposable Cell ScrapersSarstedt83.1832Cell scrapers with two-position blade
25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter CapsLife Science ProductsCT-229331
Transfer PipetsFisher1371120
Sterile, 50 mL Bio-Reaction TubesLife Science ProductsCT-229475
PipetteBoyVWR14222-180
5 mL Serological PipettesSarstedt86.1253.001
0.5 mL Flat-Cap PCR TubesFisher14230200
Polypropylene Biohazard Autoclave BagsFisher01828C
35 mm #1.5 Glass Bottom DishesMatsunami GlassD35-14-1.5-U35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated
Incubator, Model 1510EVWR35823-961
Countess II FL Cell CounterThermoFisherAMQAF1000
Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue ReagentThermoFisherC10228
Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal MicroscopeOlympusFV10i-LIV
HsPLA2/pCS6 plasmid DNAtransOMIC TechnologiesTCH1303
pmCherry VectorClontech632522
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)ThermoFisherR37605

Ссылки

  1. Kost, T. A., et al. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).
  2. van Oers, M. M., et al. Thirty years of baculovirus-insect cell protein expression: from dark horse to mainstream technology. J. Gen. Virol. 96 (1), 6-23 (2015).
  3. Contreras-Gòmez, A., et al. Protein production using the baculovirus-insect cell expression system. Biotechnol. Progr. 30 (1), 1-18 (2014).
  4. Hunt, I. From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression. Protein Expres. Purif. 40 (1), 1-22 (2005).
  5. Kollewe, C., Vilcinskas, A. Production of recombinant proteins in insect cells. Am. J. Biochem. Biotechnol. 9 (3), 255-271 (2013).
  6. Altmann, F., et al. Insect cells as hosts for the expression of recombinant glycoproteins. Glycotechnology. Berger, E. G., Clausen, H., Cummings, R. D. , Springer. Boston, MA. 29-43 (1999).
  7. Shen, X., et al. A simple plasmid-based transient gene expression method using High Five cells. J. Biotechnol. 216, 67-75 (2015).
  8. Chen, H., et al. Rapid screening of membrane protein expression in transiently transfected insect cells. Protein Expres. Purif. 88 (1), 134-142 (2013).
  9. Shen, X., et al. Virus-free transient protein production in Sf9 cells. J. Biotechnol. 171, 61-70 (2014).
  10. Loomis, K. H., et al. InsectDirect System: rapid, high-level protein expression and purification from insect cells. J. Struct. Funct. Genomics. 6 (2), 189-194 (2005).
  11. Wurch, T., et al. A modified overlap extension PCR method to create chimeric genes in the absence of restriction enzymes. Biotechnol. Tech. 12 (9), 653-657 (1998).
  12. Woodman, M. E. Direct PCR of intact bacteria (colony PCR). Curr. Protoc. Microbiol. 9 (3), 1-6 (2008).
  13. Cell Culture Basics Handbook. , ThermoFisher Scientific. Available from: http://www.thermofisher.com/us/en/home/references/gibco-cell-culture-basics.html?cid=fl-cellculturebasics, Pub. no. MAN0002734 Rev A.0 (2014).
  14. Mathew, L. G., et al. Identification and characterization of functional aquaporin water channel protein from alimentary tract of whitefly, Bemisia tabaci. Insect Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 178-190 (2011).
  15. Van Ekert, E., et al. Molecular and functional characterization of Bemisia tabaci aquaporins reveals the water channel diversity of hemipteran insects. Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 39-51 (2016).
  16. Hull, J. J., Brent, C. S. Identification and characterization of a sex peptide receptor-like transcript from the western tarnished plant bug Lygus hesperus. Insect Mol. Biol. 23 (3), 301-319 (2014).
  17. Maroniche, G. A., et al. Development of a novel set of Gateway-compatible vectors for live imaging in insect cells. Insect Mol. Biol. 20 (5), 675-685 (2011).
  18. Hull, J. J., et al. Identification of the western tarnished plant but (Lygus hesperus) olfactory co-receptor ORCO: Expression profile and confirmation of atypical membrane topology. Arch. Insect Biochem. 81 (4), 179-198 (2012).
  19. Lee, J. M., et al. Re-evaluation of the PBAN receptor molecule: Characterization of PBANR variants expressed in the pheromone glands of moths. Front. Endocrinol. 3 (6), 1-12 (2012).
  20. Fabrick, J. A., et al. Molecular and functional characterization of multiple aquaporin water channel proteins from the western tarnished plant bug, Lygus hesperus. Insect Biochem. Mol. Biol. 45, 125-140 (2014).
  21. Lu, M., et al. A baculovirus (Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus) repeat element functions as a powerful constitutive enhancer in transfected insect cells. J. Biol. Chem. 272, 30724-30728 (1997).
  22. Ren, L., et al. Comparative analysis of the activity of two promoters in insect cells. African J. Biotechnol. 10, 8930-8941 (2011).
  23. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
  24. Kohnhorst, C. L., et al. Subcellular functions of proteins under fluorescence single-cell microscopy. Biochim. Biophys. Acta. 1864, 77-84 (2016).
  25. Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. Recent advances in quantitative colocalization analysis: focus on neuroscience. Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).
  26. Shaner, N. C., et al. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  27. Chalfie, M., et al. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  28. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotech. 22 (12), 1567-1572 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

122TrichoplusiaSpodoptera frugiperdaSf9Bemisia tabaci

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены