배양 된 곤충 세포의 과도 표현 및 재조합 단백질의 세포 현지화

요약

Nonlytic 곤충 세포 발현 시스템은 생산 세포 트래 피킹 / 제이션, 및 재조합 단백질의 기능 분석을 위해 충분히 활용된다. 여기서 우리는 상업적으로 이용 가능한 나비목 세포주에서 발현 벡터 및 후속 과도 단백질 발현을 생성하는 방법을 설명합니다. 세포 내 형광 마커 단백질과 Bemisia의 담배가 루이의 아쿠아 포린의 공동 제이션 또한 제공된다.

초록

이종 단백질 발현 시스템은 재조합 단백질의 생산에 사용되는, 셀룰러 피킹 / 제이션의 해석 및 서브 유기체 수준에서 단백질의 생화학 적 기능의 결정. 배큘로 바이러스 발현 시스템은 점점 더 많은 생명 공학, 제약 및 산업용 애플리케이션이 분명한 혜택을 바이러스 감염을 포함하지 않지만 종종 간과하고 충분히 활용하는 nonlytic 시스템에서 단백질 생산을 위해 사용되지만. 여기서는 nonlytic 발현 벡터 및 과도 재조합 단백질 발현을 생성하는 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 재조합 단백질의 효율적인 세포 제이션을 허용하고 신속하게 세포 내 단백질 피킹을 식별하는데 사용될 수있다. 우리는뿐만 아니라, 곤충 Bemisia의 담배가 루이의 두 아쿠아 포린 단백질을 포함하여 시중에서 판매하는 곤충 세포주에서 네 개의 재조합 단백질의 발현을 보여세포 원형질막 세포 이하의 특정 마커 단백질로서 세포 내 리소좀에 대한. 모든 재조합 단백질은 재조합 단백질의 직접 검출을 가능하게 그들의 카복실 말단에서 형광 단백질 마커 키메라 같이 제조 하였다. 플라스미드 관심과 알려진 세포 내 마커의 유전자 구조를 숨겨와 세포의 이중 형질 전환 라이브 세포 이미징 및 세포 단백질 현지화의 개선 확인이 가능합니다.

서문

곤충 세포 발현 시스템을 사용하여 재조합 단백질의 생산은 진핵 세포 단백질의 연구에 많은 이점을 제공합니다. 즉, 곤충 세포 유사 번역 후 변형, 가공, 적절히 접힌 단백질 ^{1, 2, 3의 제조에} 유리하다 포유류 세포에 존재하는 것과 같은 정렬 메커니즘을 갖는다. 곤충 세포 시스템은 일반적으로 포유 동물 세포주 ^{4, 5에} 비해 유지 보수를 위해 더 적은 자원과 적은 시간과 노력을 필요로한다. 배큘로 바이러스 발현 시스템은 단백질의 특성화 및 치료제 외국 펩타이드 백신 생산 용 바이러스 단백질의 면역 원성 프레젠테이션 다중 합성 용 재조합 단백질의 생산을 포함하여 널리 다양한 분야에서 사용되는 하나의 곤충 세포 기반 시스템이며 - 단백질 복합체등의 당화 단백질의 제조. ^{1, 2, 4, 6.} 있다, 그러나, 상황이되는 배큘로 바이러스 발현은 ^{3, 7} 적용되지 않을 수 있으며, nonlytic 과도 곤충 발현 시스템의 사용이 더 적합 할 수있다. 특히, 과도 곤충 세포 발현 재조합 단백질의 빠른 합성을위한 가능성을 제공, 바이러스 부과 세포 용해를 포함하지 않는 덜 개발 및 유지 보수를 필요로하고, 더 나은 단백질 합성 ^{7, 8, 9시} 세포 인신 매매를 연구하는 수단을 ^{제공, 10.}

이 프로토콜을 이용하여 발현 벡터의 신속한 생성을 설명 두 단계 PCR 중첩 확장 (OE-PCR) ^{(11) 및, 대장균에서 플라스미드 DNA의 표준 클로닝. 플라스미드는 이중 트랜 상업적으로 이용 가능한 배양 된 곤충 세포에 사용되는 대표적인 단백질을 생산 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 두 개의 서로 다른 형광 표지 세포 내 마커 단백질의 생산과 사용을 설명하고 곤충 Bemisia의 담배가 루이의 두 아쿠아 포린 단백질 colocalization을 보여줍니다. 다음 프로토콜 OE-PCR, 표적 단백질의 세포 지역화 곤충 세포 및 형질 유지하고, 형광 현미경의 기본 방법을 제공한다.}

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프로토콜

표현의 플라스미드의 건설 1. OE-PCR

참고 : OE-PCR에 사용 된 모든 프라이머는 표 1을 참조하십시오. 높은 충실도의 DNA 중합 효소의 사용은 모든 증폭하는 것이 좋습니다. 그러나 이러한 효소는 자주 방치하지 않기 때문에 3 'A는, 그것의 Taq DNA 중합 효소와 간단한 비 증폭 배양을 실시 할 필요가에 "A-꼬리"를 PCR 제품 조교 곤충 세포 발현로 복제하기 전에 벡터. 이 프로토콜은 곤충 발현 플라스미드가 세포 내 마커 단백질 (두 Bemisia의 담배가 루이 아쿠아 포린 단백질이 경우), 또는 관심의 유전자의 카복실 말단에 인 - 프레임 융합 형광 단백질, 키 메릭 단백질을 형질 생성하는 방법을 보여준다 (도 1).

1. 증폭 개의 독립적 인 발사 구성 OE-PCR을 사용하여 생성한다 : (1) 관심의 유전자를 코딩하는 서열 (B. 담배가 루이아쿠아 포린 1 : BtDrip1; B.의 담배가 루이의 아쿠아 포린 2 BtDrip2_v1) EGFP 또는 (2) 세포 내 마커 (초파리 melanogaster의 성 펩타이드 수용체라는 녹색 형광 단백질 변이체에 프레임 융합 : DmSPR 호모 사피엔스 포스 포 리파제 A2 : HsPLA2)에 mCherry 코딩 시퀀스. 직접 PIB / V5-그의-TA 플라스미드로 최종 OE-PCR 제품을 결찰.
   1. OE-PCR의 첫 번째 라운드를 들면, (표 1에 볼드체로 도시) 유전자 특이 적 센스 프라이머 및 키메라 안티센스 프라이머를 사용하여 (AD 및 A'-D도 1은 '로 표시됨)에 대응 (표 1 이탤릭체) 관심 / 세포 내 마커 유전자 (종결 코돈이없는) 최종 15 BP로 원하는 형광 단백질의 5 '말단의 15 염기쌍 내지 (EGFP 또는 mCherry)는 3'오버행을 갖는 제품을 생성한다.
      참고 : PCR 조건은 표 2를 참조하십시오.
   2. 별도의 튜브에있어서,과 특이 유전자를 사용원하는 형광체의 5'- 말단으로부터 관심 / 세포 내 마커 유전자의 3 '말단의 15 염기쌍, 15 염기쌍을 포함하고 키메라 센스 프라이머 (표 1의 밑줄로 표시) IC 형광 단백질 안티센스 프라이머 단백질은 5 '오버행을 가진 제품을 생성합니다.
      참고 : PCR 조건은 표 2를 참조하십시오. PCR 반응의 주형은 하나 이상의, 바람직하게 플라스미드 DNA는 목적하는 서열을 은닉하는 서열 확인 PCR 생성물 또는 일 수있다. 여기에 설명 된 연구는 순서 검증 된 플라스미드를 사용합니다.
   3. (표준 분자 수준 오스를 사용하여) 1 % 아가로 스겔 전기 영동에 가진 PCR 산물을 분리한다.
   4. 소비세 시판 DNA 겔 추출 키트를 사용하여 예상되는 크기 (표 2 참조)의 생성물을 정제 (이 프로토콜에서 사용되는 특정 키트 물질의 표를 참조).
   5. 최종 오버랩 전자를 생성하는 단계 1.1.4에서 겔 정제 된 PCR 산물을 사용하여xtension 제품은 ( 'A로 표시된'- D ''를도 1). 관심 / 아세포의 마커 유전자와 목적하는 키메라 서열을 생성 할 수있는 형광 단백질에 해당하는 유전자 특이 적 안티센스 프라이머위한 유전자 특이 적 센스 프라이머를 사용한다.
      참고 : PCR 조건은 표 2를 참조하십시오. 경험적 최종적 전체 길이 키메라 PCR 생성물을 수득하기 위해, 반응 혼합물에 추가 1 라운드 오버랩 신장 산물의 최적 량을 결정하는 것이 필요할 수있다.
   6. 1 % 아가 로스 겔 전기 영동에 의해 제 2 라운드 PCR-OE 제품 별개. 소비세는 시중에서 판매하는 DNA 젤 추출 키트를 사용하여 제품을 정화.
   7. TA 클로닝에 필요한 3 'adenylated (즉, 꼬리) 제품을 생성하는 72 ° C에서 10 분 동안의 Taq DNA 중합 효소의 마스터 믹스를 1 개 유닛으로 겔 정제 2 라운드 OE-PCR 제품 인큐베이션.
   8. 결과 adenylated 제품을 결찰이소 부틸 렌 발현 벡터에 화학적 능력 (열충격) 또는 electrocompetent (전기) 대장균 세포를 형질 전환 표준 분자 클로닝 기술을 사용한다. 적절한 선별 마커 (예, 암피실린 또는 베니 실린)을 함유하는 배지에서 밤새 플레이트.
   9. 발현 플라스미드는 5'-3 '방향 인서트를 형질 형질 전환 된 인서트 양성 콜로니를 확인하기 위해 벡터 특이 프라이머 및 삽입 특이 프라이머를 사용하여 콜로니 ^PCR을 수행한다 ^(12). 예상 된 크기의 PCR 제품을 생성하는 식민지의 야간 문화를 준비합니다.
   10. 제조업체의 지시에 따라 시판되는 DNA 정제 키트 (이 프로토콜에서 사용되는 특정 키트 재료 표 참조)를 이용하여 플라스미드 DNA를 분리. 직접적인 DNA 서열 분석에 의해 각각의 삽입 체의 서열 무결성을 검증.

2. 곤충 세포 배양 유지 보수

주 : 무균 상태를 유지 층류 후드 내 조직 배양 플라스크의 개방을 요구하는 모든 셀의 조작을 수행하기 위해. 종래 셀 조작에 층류 후드 UV 살균 램프에 적어도 1 시간 우회전. 니트릴 장갑을 착용하고 그들의 사용하기 전에 70 % 에탄올로 벤치, 피펫,기구, 튜브 및 플라스크의 표면 오염을 제거. 기본 세포 배양 기술에 대한 지식 ^(13)를 권장합니다.

1. 혈청이없는 배지에 적응 TNI 세포 (트리코 NI 난소 조직 유래의 확립 된 세포 배양 라인)을 사용하여 28 ° C T25의 조직 배양 플라스크에서 무 혈청 곤충 배지에서 점착성 단층 배양로 유지한다.
2. Sf9 세포 (스포 도프 테라 프 루기 페르 난소 조직 유래의 확립 된 세포 배양 라인)와 유사하게 사용되지만 TNM-FH 곤충 배양 배지 보충 유지10 % 소 태아 혈청 (FBS) 에드.
3. -80 ° C에서 재고의 튜브를 제거하고는 37 ° C의 물을 욕조에 해동 할 수 있도록하여 냉동 인 Sf9 또는 TNI 세포에서 배양 초기 종자. 해동 후 70 % 에탄올로 유리 병의 오염을 제거하고 얼음에 배치합니다.
4. 새로운 T25 플라스크 전송 해동 곤충 세포 현탁액 1 ㎖에 곤충 세포 배지 4 mL를 넣고. 28 ° C, 비 가습 인큐베이터에 플라스크를 배치하고, 세포를 30-45 분 동안 부착 할 수있다.
5. 적절한 배지 5 mL를 시딩 배지를 교체하고 28 ° C 비 가습 인큐베이터 플라스크 옮긴다. 매일 세포의 합류를 모니터링합니다. 통로 세포는 90 %의 포화 상태에 도달했을 때.
   참고 : T25 플라스크의 전체 범위는 ~ 5 × 10 ⁶ 세포에 해당합니다.
6. 곤충 세포 통로.
   1. 세포 통로, 제 5 ㎖ 멸균 피펫을 사용하여 혈청 학적 융합 세포를 포함하는 플라스크에서 배출 된 매체를 제거한다.매체가 얻어 세포 단층에서, 하나 개의 코너로 흐르도록 플라스크를 기울인다. 조심스럽게 세포를 방해하지 않고 피펫을 사용하여 매체를 제거합니다.
   2. 부드럽게 새로운 살균 5 ㎖ 혈청 피펫을 사용하여 무 혈청 배지 곤충 4 mL를 합류 단층을 함유하는 T25 플라스크를 세척함으로써 세포를 TNI시키다. 플라스크에 걸쳐 피펫 팁을 이동 서서히 느슨하게 플라스크 바닥에 부착 된 세포를 제거하기 위해 관개.
      1. 모든 미디어를 제거를 통해 플라스크를 회전하고, 플라스크의 바닥이 깨끗한 지 관찰하여 세포의 적절한 분리를 확인합니다.
   3. 더 단단히 부착 Sf9 세포에 대해, 신선한 TNM-FH 배지 4 mL를 첨가하고, 세포 부착을 제거하는 셀 스크레이퍼를 사용한다. 부드럽게 혼합 세포 응집을 줄이기 위해 5 ㎖의 혈청 학적 피펫을 사용합니다.
   4. 매체의 볼륨 당 가능한 곤충 세포의 수를 추정하는 자동 세포 계수기를 사용합니다. 1.5 mL의 세포 / 배지 혼합물에 0.1 mL의 전송미세 원심 분리 튜브. 별도의 0.5 mL의 미세 원심 분리 튜브에, 트리 판 블루 10 μL로 세포 / 배지 혼합물 10 μL를 추가한다.
   5. 포장에서 셀 카운터 챔버 슬라이드를 제거하고 계산 슬라이드의 각 측면에 셀 / 중간 / 트리 판 블루 혼합물 10 μL를 추가한다. 세포 카운터에 슬라이드 삽입하고, 세포 밀도 및 생존 능력을 결정한다.
   6. 세포 밀도를 사용하여 계산하고 새로운 무균 T25 플라스크에 곤충 세포 배지 (최대 5 ㎖까지)의 적절한 부피를 추가한다.
   7. 신선한 미디어와 T25 플라스크에 약 1.5 × 10 ⁶ 세포로 이동; _{(P, N의 셀의} 이전 세대 통로 번호 P의 _N + 1 세대) 세포 라인을 사용 날짜, 중간 부가 세포 수 및 통로 번호 플라스크 라벨; 최대 72 시간 동안 28 ° C의 배양기에서 플라스크를 배치했다.
      주 : 곤충 세포가 연속적으로 전달 될 수 있고, 세포를 형질 감염 및 / 또는 이종 덜 들일 수도 있지만통로 (30) 후 단백질 발현. 10 % 표백제 용액으로 파기 세포 / 미디어를 처리하고, 처리 전에 일회용 플라스틱 제품을 오토 클레이브.

3. 곤충 세포 형질

1. 와 T25 플라스크 시드 최대 1 × 적합한 곤충 세포 배지에서 ⁶ TNI 또는 인 Sf9 세포 (인 Sf9위한 TNI 및 TNM-FH 용 무 혈청 곤충 배지), 28 ° C에서 72 시간 동안 포화 상태로 성장한다.
2. 제거하고 기존 매체를 버리고 신선한 혈청이없는 곤충 매체의 4 mL로 세포를 이동시키다 (위의 단계 2.6.2과 2.6.3을 참조).
3. 자동 세포 계수기 (위의 단계 2.6.4 참조)를 사용하여 세포 농도를 추정한다.
4. 각각의 35mm의 유리 - 바닥 접시에 약 7 × ¹⁰⁵ 세포를 첨가하고, 세포를 28 ℃에서 20-25 분 동안 부착 할 수있다.
5. 각각의 형질 감염을 위해, 플라스미드 DNA의 2 μg의 추가 (DO 중 하나에 대한 두 개의 플라스미드들 각각으로부터 하나의 플라스미드 형질 하나 또는 2 μg의 행멸균 1.5ml의 미세 원심 분리 튜브 인 Sf9 및 형질 TNI) 모두 FBS가없는 무 혈청 곤충 배지 (0.1 mL를 행 uble 형질).
6. 별도의 튜브에, 무 혈청 곤충 배지 0.1 ㎖의 트랜 스펙 션 시약의 8 μL를 혼합하고 관심의 플라스미드 DNA를 함유하는 용액 튜브에 옮긴다. 가볍게 와동 및 20 RT 부화 - 30 분.
7. 전량을 1 mL로 같도록 혈청 곤충 배지 0.8 mL의 플라스미드 형질 단계 3.5 내지 3.6의 혼합물을 희석.
8. 조심스럽게 부착 된 세포를 포함하는 유리 접시에서 용지를 제거합니다. 희석 된 플라스미드 형질 감염 배지 부착 세포 오버레이.
9. 5 시간 동안 28 ℃에서 세포를 인큐베이션.
   주 : 형질 조건은 최대 형질 전환 효율 (경험적 최적화를 필요로 예를 들면 밤새 형질보다 5 시간, 사용 된 플라스미드 DNA의 양, 형질 감염 시약 화학사용, 등.).
10. 제거하고 형질 매체를 폐기하고 부드럽게 세포를 꺼 내려하지 않도록주의, 무 혈청 곤충 매체의 1 mL로 세포를 씻어.
11. 신선한 곤충 세포 배지 (인 Sf9에 대한 TNI와 TNM-FH에 대한 혈청이없는 곤충 매체)의 2 mL를 추가하고 48 ~ 72 시간 동안 28 ° C에서 품어.
    참고 : 다시, 조건이 최대 이종 단백질 발현에 대한 경험적 최적화가 필요합니다.

4. 공 초점 형광 현미경

1. 48-72 시간 후 형질 감염에서 IPL-41 곤충 배지 1 ㎖로 한번 세포를 세척하고 2 mL의 IPL-41 촬상 용 커버.
   참고 :이 세척 단계는 정상 세포의 유지에 사용되는 곤충 세포 매체 관찰 배경 자동 형광을 줄일 수 있습니다.
2. 훽스트 살아있는 세포 염색 시약을 4 방울을 가하여 매체 (이 프로토콜에서 사용되는 특정 핵 염색 재료의 테이블 참조)를 20-25 분 동안 28 ℃에서 배양한다.
   참고 : 추가 NUC염료 EGFP 및 mCherry에서 독특한 형광 프로파일을 가져야하지만 리어 얼룩은 치환 될 수있다.
3. 자기 밀폐 된 공 촛점 현미경 스캐닝 레이저로 35mm 접시 (이 프로토콜에 사용되는 특정 악기 재료의 표 참조)을 놓습니다.
4. 훽스트, EGFP 및 mCherry 관찰 조건 현미경 조정 : 훽스트 여기 / 방출 - 461분의 359 나노 미터; EGFP 여기 / 방출 - 510분의 489 나노 미터; mCherry 여기 / 방출 - 610분의 580 내지.
5. 형광 발현을 확인한 후 60X 위상 대조 물 액침 대물 주사를 사용 모드로 전환하기 위해 10 배 대물 렌즈를 사용하여 초기 검사를 수행한다.
6. 화상 콘트라스트, 해상도를 최적화하기위한 레이저 파워 (5-7 %), 검출 감도 (47-49 %), 주사 속도, Z 축 깊이, 디지털 줌을 조정한다. 이미지 1.5 배 디지털 줌의 세포는 90X 증폭의 총을 제공합니다.
   참고 : 현미경 매개 변수를 최적화에 대한 경험적 조정 필요및 이미지 컬렉션 사용 기기에 특정 될 수있다.
7. TIFF 이미지 파일로 원시 데이터를 내보내고 그림 세대 (작물 및 오버레이)를 수정합니다.

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결과

OE-PCR

OE-PCR 일단 관심 형광 마커 단백질의 임의의 테스트에 대응하는 유전자 재조합 키 메릭 단백질의 생성을 허용, 발현 벡터에 삽입 키메라 DNA 산물의 합성을 허용한다. 도 1은 형광 단백질 마커 EGFP에 프레임 시퀀스 (BtDrip1 및 BtDrip2_v1)를 부호화 B.의 담배가 루이의 아쿠아 포린 PIB를 함유하는 발현 벡터의 제...

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토론

이종 단백질 발현 시스템은 다수의 다운 스트림 애플리케이션 ^4에 사용되는 재조합 단백질의 생산을위한 중요한 도구입니다. 사용할 수있는 다양한 발현 시스템에서 선택하면 관심있는 단백질의 최종 목표에 따라 달라집니다. 여러 곤충 세포 발현 시스템은 원핵 생물과 진핵 세포 발현 시스템 ^{5, 6} 유연한 대안을 제공하는 사용할 수 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
KOD DNA Polymerase	EMD Millipore	71085-3	High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products
ExTaq DNA Polymerase	TaKaRa-Clontech	RR001B	DNA polymerase used for A-tailing of PCR products
EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix	Lucigen	30033-1	DNA polymerase used for bacterial colony PCR
Biometra TProfessional Gradient Thermocycler	Biometra/LABRepCo	070-851
Agarose LE	Benchmark Scientific	A1705
SYBR Safe DNA Gel Stain	ThermoFisher	S33102
Montage DNA Gel Extraction Kit	EMD Millipore	LSKGEL050
pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit	ThermoFisher	K89020	Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution.
QIAprep Spin MiniPrep Kit	Qiagen	27104
QIAcube Robotic Workstation	Qiagen	9001292
Purifier Vertical Clean Bench	Labconco	3970401
Tni cultured insect cell Line	Allele Biotech	ABP-CEL-10005
Sf9 cultured insect cell Line	Allele Biotech	ABP-CEL-10002
Serum-Free Insect Culture Medium	Allele Biotech	ABP-MED-10002
TNM-FH Insect Culture Medium	Allele Biotech	ABP-MED-10001
IPL-41 Insect Medium	ThermoFisher	11405081
Cellfectin II Transfection Reagent	ThermoFisher	10362100
16 cm Disposable Cell Scrapers	Sarstedt	83.1832	Cell scrapers with two-position blade
25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps	Life Science Products	CT-229331
Transfer Pipets	Fisher	1371120
Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes	Life Science Products	CT-229475
PipetteBoy	VWR	14222-180
5 mL Serological Pipettes	Sarstedt	86.1253.001
0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes	Fisher	14230200
Polypropylene Biohazard Autoclave Bags	Fisher	01828C
35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes	Matsunami Glass	D35-14-1.5-U	35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated
Incubator, Model 1510E	VWR	35823-961
Countess II FL Cell Counter	ThermoFisher	AMQAF1000
Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent	ThermoFisher	C10228
Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope	Olympus	FV10i-LIV
HsPLA2/pCS6 plasmid DNA	transOMIC Technologies	TCH1303
pmCherry Vector	Clontech	632522
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)	ThermoFisher	R37605