瞬时表达和重组蛋白的细胞定位在培养的昆虫细胞

摘要

Nonlytic昆虫细胞表达系统没有得到充分利用进行生产，细胞运输/定位，和重组蛋白质功能分析。这里，我们描述的方法来产生在市售鳞翅目细胞系的表达载体和随后的瞬时表达。与亚细胞荧光标记蛋白烟粉虱水通道蛋白的共定位还提出。

摘要

异源蛋白质表达系统用于生产重组蛋白，细胞运输/定位的解释，和蛋白质在子有机体水平的生化功能的确定。虽然杆状病毒表达系统在众多的生物技术，制药和工业应用中，不涉及病毒感染有明显的好处，但往往被忽视和未充分利用nonlytic系统越来越多地用于生产蛋白质。在这里，我们描述了用于产生nonlytic表达载体和瞬时重组蛋白表达的方法。该协议允许对重组蛋白的高效细胞定位和可用于在细胞内迅速辨别蛋白质运输。我们示出了四个重组蛋白在市售的昆虫细胞系的表达，包括来自昆虫烟粉虱 2水通道蛋白的蛋白质，以及作为特异于细胞质膜亚细胞标志物蛋白和细胞内溶酶体。所有的重组蛋白被生产为具有在它们的羧基末端，其允许直接检测重组蛋白的荧光蛋白标记的嵌合体。细胞与质粒构建携带针对感兴趣和已知的亚细胞标记物的基因的转染双允许活细胞成像，改进的蜂窝蛋白质定位的验证。

引言

生产用昆虫细胞表达系统重组蛋白的真核蛋白质的研究提供了许多好处。即，昆虫细胞具有相似的翻译后修饰，处理和排序机制的那些存在于哺乳动物细胞中，这是有利的用于制备正确折叠的蛋白^1，2，3。昆虫细胞系统通常还需要更少的资源和较少的时间和精力用于维护比哺乳动物细胞系^4,5。杆状病毒表达系统是一种这样的昆虫细胞为基础的系统，它现已被广泛地用于许多学科，包括生产用于蛋白质表征和治疗剂，外源肽和用于疫苗生产的病毒蛋白的免疫原性的介绍，多合成重组蛋白的 - 蛋白质复合物，生产糖基化蛋白等 。 ^{1，2，4，6。}有，但是，情况，其中杆状病毒表达可能不适用^3,7，以及使用nonlytic和瞬态昆虫表达系统的可能更合适。具体而言，瞬态昆虫细胞表达提供了重组蛋白的快速合成的可能性，需要更少的开发和维护，不涉及病毒强加细胞裂解，并提供了蛋白质合成^7，8，9中更好地研究细胞运输的手段^{， 10。}

这个协议描述了使用快速生成的表达载体的两步骤的重叠延伸PCR（OE-PCR） 11和质粒DNA在大肠杆菌中标准的克隆。质粒被用于双重转染市售培养的昆虫细胞，并产生代表的蛋白质。该协议描述了两种不同的荧光标记的亚细胞标志物蛋白的生产和使用，并演示共定位与来自昆虫烟粉虱 2水通道蛋白的蛋白质。以下方案提供了用于OE-PCR，昆虫细胞维持和转染，而对于目标蛋白的细胞定位的荧光显微镜的基本方法。

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研究方案

1. OE-PCR用于表达质粒的构建

注:请参阅表1在OE-PCR中使用的所有引物。建议对所有扩增使用高保真DNA聚合酶。然而，因为这些酶通常不留下3' A，有必要用Taq DNA聚合酶进行简短的，非放大孵育至‘A-尾’的PCR产物将它们克隆到TA昆虫细胞表达前向量。此协议演示了一个方法，以产生昆虫表达质粒携带嵌合蛋白，与框融合到感兴趣的基因的羧基末端的荧光蛋白（在这种情况下，两个烟粉虱水通道蛋白的蛋白质），或亚细胞标记蛋白（ 图1）。

1. 使用OE-PCR，它由两个独立的轮扩增的，以产生:（1）编码感兴趣的基因的序列（ 烟粉虱水通道蛋白1:BtDrip1;框融合与称为EGFP或（2）的亚细胞标记物（ 果蝇性肽受体绿色荧光蛋白变体BtDrip2_v1）: 烟粉虱水通道蛋白2 DmSPR; 智人磷脂酶A2:HsPLA2）与所述的mCherry编码序列。直接结扎最终OE-PCR产品进入PIB / V5-他-TA质粒。
   1. 对于第一轮OE-PCR的，使用基因特异性有义引物（ 表1中以粗体示出）和嵌合反义引物（由AD和A'-D"在图1中所示）（在表1斜体）对应利息/亚细胞标记物的基因的最后15个碱基（无终止密码子）和至所需的荧光蛋白的5'端的15bp的（EGFP或mCherry的），以产生具有3' 突出端的产物。
      注:请参见表2 PCR条件。
   2. 在一个单独的管中，使用基因特异性IC荧光蛋白反义引物包含来自感兴趣/亚细胞标记物的基因的3'末端15个碱基和15个碱基对来自期望的荧光5'端和嵌合有义引物（与表1中下划线示出）蛋白质以产生具有一个5' 突出端的产物。
      注:请参阅表2为PCR条件。将PCR模板可以是一个序列验证PCR产物，或更优选地，DNA质粒携带所需序列。这里所描述的研究使用了序列验证质粒。
   3. 分离，用1％琼脂糖凝胶电泳PCR产物（使用标准的分子级琼脂糖）。
   4. 消费和纯化预期大小（ 见表2），使用市售的DNA凝胶提取试剂盒的产品（见材料的表中这个协议所使用的特定试剂盒）。
   5. 使用凝胶纯化的PCR产物从步骤1.1.4以产生最终的重叠Èxtension产品（ -在图1中'A所示'' D'）。使用基因特异性有义引物对利息/亚细胞标记物的基因和用于荧光蛋白以产生期望的嵌合序列对应的基因特异性反义引物。
      注:请参阅表2为PCR条件。它可能是必要的经验确定的第一轮重叠延伸产物的最佳量添加到反应混合物中以产生最终的，全长嵌合PCR产物。
   6. 分离由1％琼脂糖凝胶电泳第二轮OE-PCR产物。使用市售的DNA凝胶提取试剂盒消费和纯化产品。
   7. 孵育凝胶纯化第二轮OE-PCR产物用1个单位Taq DNA聚合酶预混的10分钟在72℃，以产生3'腺苷酸化（ 即 A尾）所需的TA克隆产品。
   8. 结扎造成的腺苷酸化产品到PIB表达载体并使用标准的分子克隆技术来转化化学感受（热休克）或电感受态（电穿孔） 大肠杆菌细胞中。在含有合适的选择标记（ 即，氨苄青霉素或羧苄青霉素）的培养基平板过夜。
   9. 使用载体特异性引物和特定的插入引物，以确定已用表达质粒窝藏在5'-3'方向插入插入阳性集落进行菌落PCR ^12。准备克隆产生预期大小的PCR产物的过夜培养。
   10. 隔离使用根据制造商的说明可商购的DNA纯化试剂盒（参见材料 表对该协议所使用的特定试剂盒）质粒DNA。验证由直接DNA测序每个插入的序列完整性。

2。昆虫细胞培养维护

注:为了保持无菌条件下，进行要求的组织培养烧瓶中的层流罩内的开口的所有细胞的操作。打开层流罩紫外线杀菌灯至少1个小时的细胞的操作之前。穿丁腈手套及其使用之前净化替补，移液管，器皿，管，并用70％乙醇的烧瓶的表面上。熟悉基本的细胞培养技术，推荐^13。

1. 使用Tni的细胞（来自粉纹夜蛾的卵巢组织来源的建立的细胞培养物线），它们适应于无血清培养基中并予以保持在无血清昆虫培养基在28℃下在T25组织培养瓶中贴壁单层培养。
2. 保持的Sf9细胞（来自草地夜蛾卵巢组织来源的建立的细胞培养系）类似，但使用TNM-FH昆虫培养基补充编有10％胎牛血清（FBS）。
3. 通过从-80℃取出的库存小瓶中并允许它们在37℃水浴中解冻种子从冷冻的Sf9或Tni的细胞的原始培养物。消毒用70％乙醇的小瓶解冻后，将它们放在冰上。
4. 添加4mL的昆虫细胞培养基到一个新的T25烧瓶，并转移1mL的解冻的昆虫细胞悬浮液。将烧瓶置于28℃，非湿润的培养箱和允许细胞30-45分钟附着。
5. 替换用5mL合适的培养基的接种培养基和培养瓶转移到28℃的非加湿培养箱。每天监测细胞汇合。通道的细胞，当他们达到90％汇合。
   注意:T25烧瓶的完全覆盖对应于〜5×10个^6个细胞。
6. 昆虫细胞传代。
   1. 到通道中的细胞，首先除去从含有使用无菌5mL的血清吸液管汇合的细胞将烧瓶中的耗尽介质。使得介质流向一个角，从细胞单层远离倾斜烧瓶中。小心地取出使用移液管的介质，而不干扰细胞。
   2. 轻轻漂洗使用新的，无菌，5mL的血清吸液管包含用4mL无血清昆虫培养基的汇合的单层的T25烧瓶逐出Tni的细胞。移动跨越烧瓶中的移液管尖端，慢慢灌溉以除去松散附着在烧瓶底部的细胞。
      1. 通过删除所有媒体，翻转烧瓶中，并观察该瓶的底部是明确检查细胞充分分离。
   3. 为Sf9细胞，其附着越紧，加入4毫升新鲜TNM-FH培养基中，并用细胞刮棒以移去贴壁细胞。使用5毫升血清吸管轻轻混匀并减少细胞聚集。
   4. 使用自动细胞计数器来估计每介质的体积活昆虫细胞的数目。转移0.1mL的细胞/培养基混合物的至1​​.5mL的微量离心管中。在一个单独的0.5毫升微量离心管中，细胞/培养基混合物的添加10μL至台盼蓝的10μL。
   5. 从包装中取出细胞计数器室滑动件和添加细胞/培养基/台盼蓝混合液10μL于计数滑动的每一侧上。插入幻灯片进入细胞计数器和确定细胞密度和生存力。
   6. 使用的细胞密度，计算并添加昆虫细胞培养基（最多5 mL）添加到新的无菌T25烧瓶的适当体积。
   7. 输送约1-1.5×10 ^6个细胞用新鲜培养基T25烧瓶;标记烧瓶与细胞系，日期，介质使用时，加入的细胞数，和通道号（P _N + 1的生成，其中，P _n是上一代细胞的传代次数）;并将其放置在一个28℃的培养箱中培养瓶长达72小时。
      注意:昆虫细胞可以连续地传播，尽管细胞可以是转染和/或异源更少接受后30代蛋白质表达。治疗与10％漂白溶液中的所有丢弃细胞/培养基和处置前高压灭菌的一次性塑料器皿。

3.昆虫细胞转染

1. 播种T25烧瓶高达1×10 ^6个或Tni的Sf9细胞在合适的昆虫细胞培养基（对于TN1和TNM-FH为的Sf9无血清昆虫培养基）并生长至融合72小时在28℃。
2. 取下并丢弃旧的介质，并用4毫升新鲜的无血清昆虫培养基移出细胞（参见步骤2.6.2和2.6.3，上文）。
3. 估计使用自动细胞计数器（参照步骤2.6.4，上文）的细胞密度。
4. 添加约7×10 ⁵细胞至个体35毫米玻璃底培养皿和允许细胞在28℃下20-25分钟附着。
5. 对于每次转染，加入2微克质粒DNA（从一个质粒用于转染单或2微克来自各两个质粒用于做的在无菌的1.5mL微量离心管uble转染）到0.1毫升无血清昆虫培养基（无FBS两者的Sf9和Tni的转染）的。
6. 在一个单独的管中，混合8μL转染试剂用0.1mL无血清昆虫培养基中，然后该溶液转移到含有目的质粒DNA的管中。轻轻涡，并在室温孵育20 - 30分钟。
7. 稀释从步骤3.5将质粒转染混合物和3.6用0.8毫升无血清昆虫培养基，使得总体积等于1毫升。
8. 小心地从含有贴壁细胞的玻璃培养皿取出介质。覆盖贴壁细胞与稀释的质粒的转染培养基。
9. 孵育细胞在28℃5小时。
   注意:用于转染的条件要求实现最大转染效率（经验优化例如，转染过夜而不是5小时，质粒DNA的使用量，将转染试剂的化学性质使用的， 等 ）。
10. 卸下并丢弃转染培养基，轻轻地用1mL无血清昆虫培养基洗细胞，小心不要以移去细胞。
11. 加入2毫升的新鲜昆虫细胞培养基（对于TN1和TNM-FH为的Sf9无血清昆虫培养基）中，并在28℃下孵育48-72小时。
    注:同样，条件需要最大的异源蛋白表达经验优化。

4.共聚焦荧光显微镜

1. 在48-72小时后转染，用1mL IPL-41昆虫培养基洗细胞一次，然后用2mL的IPL-41用于成像覆盖。
   注意:此洗涤步骤减少了与在正常细胞的维持使用昆虫细胞介质中观察到的背景自发荧光。
2. 加入4滴Hoechst的活细胞染色试剂（见的用于本协议中使用的特定的核染色材料的表）的培养基中并在28℃下孵育20-25分钟。
   注:其他NUC利尔污渍可以被取代，尽管染料应具有EGFP和的mCherry独特荧光分布。
3. 放置35mm培养皿到自封闭的激光扫描共聚焦显微镜（见材料的表中这个协议所使用的特定仪器）。
4. 调整的Hoechst，EGFP，和mCherry的观察条件的显微镜:Hoechst的激发/发射 - 四百六十一分之三百五十九纳米; EGFP激发/发射 - 510分之489纳米; mCherry的激发/发射 - 六百十分之五百八十〇纳米。
5. 使用10x物镜，以确认荧光表达，然后使用60X相衬水浸物镜切换为扫描模式下执行的初始扫描。
6. 调整激光功率（5-7％），检测器灵敏度（47-49％），扫描速度，Z轴的深度，和数码变焦，以优化图像对比度和分辨率。图像将细胞在1.5X数码变焦，得到总90X放大。
   注:显微镜参数需要优化经验调整图像采集，并且可以具体到使用仪器。
7. 导出原始数据为TIFF图像文件，并修改（作物和覆盖）的数字产生。

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结果

OE-PCR

OE-PCR允许的是，一旦被插入到表达载体中，允许产生对应于目标和荧光标记蛋白的任何测试基因的重组嵌合蛋白的嵌合DNA产物的合成。 图1表示用于生产含有烟粉虱水通道蛋白编码符合读框的序列（BtDrip1和BtDrip2_v1）与荧光蛋白质标记EGFP PIB的表达载体的一般方案。在这种情况下，制备含有EGFP在它们的羧...

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讨论

异源蛋白质表达系统可用于产生在许多下游应用⁴中使用的重组蛋白的重要工具。从现有的各种表达系统选择取决于感兴趣的蛋白质的最终目标。几个昆虫细胞表达系统是可用的提供灵活的替代原核和真核细胞表达系统^5,6。需要杆状病毒感染，以驱动蛋白表达的昆虫系统是目前最流行的和广泛使用的昆虫系统中，用在研究和治疗应用

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
KOD DNA Polymerase	EMD Millipore	71085-3	High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products
ExTaq DNA Polymerase	TaKaRa-Clontech	RR001B	DNA polymerase used for A-tailing of PCR products
EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix	Lucigen	30033-1	DNA polymerase used for bacterial colony PCR
Biometra TProfessional Gradient Thermocycler	Biometra/LABRepCo	070-851
Agarose LE	Benchmark Scientific	A1705
SYBR Safe DNA Gel Stain	ThermoFisher	S33102
Montage DNA Gel Extraction Kit	EMD Millipore	LSKGEL050
pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit	ThermoFisher	K89020	Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution.
QIAprep Spin MiniPrep Kit	Qiagen	27104
QIAcube Robotic Workstation	Qiagen	9001292
Purifier Vertical Clean Bench	Labconco	3970401
Tni cultured insect cell Line	Allele Biotech	ABP-CEL-10005
Sf9 cultured insect cell Line	Allele Biotech	ABP-CEL-10002
Serum-Free Insect Culture Medium	Allele Biotech	ABP-MED-10002
TNM-FH Insect Culture Medium	Allele Biotech	ABP-MED-10001
IPL-41 Insect Medium	ThermoFisher	11405081
Cellfectin II Transfection Reagent	ThermoFisher	10362100
16 cm Disposable Cell Scrapers	Sarstedt	83.1832	Cell scrapers with two-position blade
25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps	Life Science Products	CT-229331
Transfer Pipets	Fisher	1371120
Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes	Life Science Products	CT-229475
PipetteBoy	VWR	14222-180
5 mL Serological Pipettes	Sarstedt	86.1253.001
0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes	Fisher	14230200
Polypropylene Biohazard Autoclave Bags	Fisher	01828C
35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes	Matsunami Glass	D35-14-1.5-U	35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated
Incubator, Model 1510E	VWR	35823-961
Countess II FL Cell Counter	ThermoFisher	AMQAF1000
Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent	ThermoFisher	C10228
Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope	Olympus	FV10i-LIV
HsPLA2/pCS6 plasmid DNA	transOMIC Technologies	TCH1303
pmCherry Vector	Clontech	632522
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)	ThermoFisher	R37605