سوببيال الغدة المرتبطة فيروس 9 (AAV9) ناقلات تسليم في الفئران الكبار

Summary

وكان الهدف من هذه الدراسة لتطوير والتحقق من صحة وسلامة فيروس العمود الفقري الغدة المرتبطة 9 (AAV9) تسليم الجينات بوساطة باستخدام تقنية تسليم الجينات دون المستوى الرواية في الفئران البالغة.

Abstract

وقد تم الإبلاغ عن التطور الناجح للفيروس الفرعي الغدة المرتبطة فيروس 9 (AAV9) تقنية نقل ناقلات في الفئران البالغة والخنازير في السابق. باستخدام القسطرة البولي ايثيلين وضعت تحت مكان (بي-10 أو بي-5) لتسليم AAV9، وقد تجلى التعبير التحوير قوي من خلال لحمة في العمود الفقري (المادة البيضاء والرمادية) في أجزاء العمود الفقري حقنه بشكل جزئي. بسبب مجموعة واسعة من نماذج الماوس المعدلة وراثيا من أمراض الاعصاب، وهناك رغبة قوية لتطوير الجهاز العصبي المركزي قوية (نس) -Ttargeted تقنية تسليم ناقلات في الفئران البالغة. وبناء على ذلك، تصف هذه الدراسة تطوير جهاز تسليم ناقلات تحت القشرة العمود الفقري وتقنية للسماح آمنة وفعالة تسليم العمود الفقري AAV9 في الفئران C57BL / 6J الكبار. في الفئران يجمد بشكل جماعي وتخدير الفئران، والقطن الحنون (عنق الرحم 1 والقطني 1-2 مستوى القطني الشوكي) تم شقه مع إبرة حادة 34 G باستخدام مناور شيز. الثانية شيز ماثم استخدم نيبولاتور للمضي قدما إبرة حادة 36G في القطني و / أو عنق الرحم الفضاء تحت السطحية. و AAV9 ناقلات (3-5 ميكرولتر؛ 1.2 × 10 ¹³ نسخ الجينوم (غ)) تم ترميز البروتين الأخضر الفلورسنت (غفب) ثم حقن سوباليالي. بعد الحقن، تم تقييم وظيفة عصبية (المحرك والحسية) بشكل دوري، وكانت الحيوانات نضح ثابتة بعد 14 يوما من تسليم AAV9 مع بارافورمالدهيد 4٪. أظهر تحليل أقسام الحبل الشوكي الأفقي أو المستعرض التعبير التحوير في جميع أنحاء الحبل الشوكي بأكمله، في كل من المواد الرمادي والأبيض. وبالإضافة إلى ذلك، شوهد التعبير غفب بوساطة مكثفة ريتروغراديلي في المحاور الحركية الهبوطية والخلايا العصبية في القشرة الحركية، نواة روبر، وشكلية شبكية. لم يلاحظ أي خلل عصبي في أي الحيوانات. وتظهر هذه البيانات أن تقنية تسليم ناقلات تحت القفص يمكن أن تستخدم بنجاح في الفئران البالغة، دون التسبب في إصابة الحبل الشوكي ذات الصلة بالإجراء، ويرتبط مع تجانس قوي للغاية إكسبريسسيون، عبر، ال التعريف، شوكي، نيوراكسيس.

Introduction

استخدام ناقلات آف لعلاج مجموعة متنوعة من الحبل الشوكي واضطرابات الجهاز العصبي المركزي العصبية أصبحت منصة مقبولة بشكل جيد ل أوبغريغولات بفعالية أو إسكات التعبير عن الجينات (ق) من الفائدة. واحدة من القيود الرئيسية على استخدام أكثر فعالية لهذه التكنولوجيا لعلاج اضطرابات الجهاز العصبي المركزي / العمود الفقري الحبل هو القدرة المحدودة على تقديم ناقلات آف (ق) إلى الدماغ العميق أو حبل الشوكي حمة في الثدييات الكبار.

وقد ثبت، على سبيل المثال، أن تسليم النظامية من AAV9 في القوارض الكبار والقطط، أو الرئيسيات غير البشرية هي فقط فعالة بشكل معتدل في إحداث التعبير التحوير في الخلايا العصبية في الدماغ والحبل الشوكي ^{1 ، 2 ، 3} . وقد تبين أيضا أن تسليم أكثر فعالية داخل القراب من ناقلات AAV9 أن يؤدي إلى التعبير التحوير محدود فقط في مجموعات تعرف تشريحيا من الخلايا العصبية. وبشكل أكثر تحديدا، فقد كان الشياطينتراتد أن قاطعة أو قطني العجزية داخل القراب AAV9 التسليم في الرئيسيات غير البشرية، والخنازير، أو القوارض يؤدي إلى مستوى عال من التعبير التحوير في العمود الفقري α- الحركات العصبية والخلايا العصبية الجذرية الظهري العقدية. ومع ذلك، الحد الأدنى أو أي تعبير في إنترنيورونس الشوكي أو محاور صاعدة أو تنازلي في المادة البيضاء ينظر ^{4 ، 5 ، 6 ، 7} . بشكل جماعي، وتظهر هذه البيانات أن وجود حاجز البيولوجية التشريحية فعالة للغاية، مما يمنع نشر آف تسليمها داخل إنتراثيكالي إلى حمة الشوكي أعمق.

في دراسة سابقة باستخدام الفئران البالغة والخنازير، تم تطوير تقنية تسليم ناقلات سوببيال رواية ⁸ . باستخدام هذا النهج، وقد أثبتت قوية جدا ومتعدد القطاعات التحوير التعبير بعد واحد بلعة تحت السطحية تسليم AAV9. وكان ينظر إلى التعبير غفب مكثفة باستمرارفي الخلايا العصبية والخلايا الدبقية، والمحاور الهبوطية / الصاعدة من خلال أجزاء العمود الفقري حقن. وأظهرت هذه الدراسة لأول مرة أن الأم الحنون يمثل الحاجز الأساسي الذي يحد من انتشار AAV9 فعالة في لحمة في العمود الفقري من الفضاء داخل القراب. في حين أن هذه التقنية التي تم تطويرها سابقا وجهاز حقن تحت الجلد من السهل نسبيا للاستخدام في القوارض الكبيرة (مثل الفئران) أو الخنازير الكبار، والنظام ليست مناسبة للاستخدام في الحيوانات الصغيرة، مثل الفئران الكبار. ونظرا لارتفاع عدد نماذج الماوس المعدلة وراثيا المتاحة من مجموعة متنوعة من الاضطرابات العصبية، وهناك حاجة واضحة لتطوير فعالة النخاع متني متجه تقنية تسليم ناقلات في الفئران. توافر مثل هذه التقنية من شأنه أن يسمح لدراسة تأثير إسكات الجينات محددة (على سبيل المثال، باستخدام شرنا) أو أوبريغولاتيون باستخدام خلية غير محددة (على سبيل المثال، الفيروس المضخم للخلايا-سمف أو أوبيكيتين) أو خلية محددة (على سبيل المثال، سينابسين أو غليال الحمضية الليفيةالبروتين (غفاب)) المروجين خلال مرحلة ما بعد الولادة في مرحلة مبكرة أو تحت ظروف مريضة.

وبناء على ذلك، في هذه الدراسة، قمنا بتطوير والتحقق من صحة نظام تسليم ناقلات تحت القشرية مصغرة التي يمكن استخدامها على نحو فعال في الفئران الكبار. وبالمثل، كما هو الحال في الدراسات الفئران والخنازير السابقة، ويوضح هذا العمل التعبير التحوير قوية في جميع أنحاء الحمة الشوكي بعد واحد البلعة تحت الجلد تسليم AAV9 في الفئران. بساطة هذا النهج، والتحمل جيد جدا من الفئران حقن إلى تسليم AAV9 تحت السطحية، وفعالية عالية للتعبير التحوير في حمة الشوكي تشير إلى أن هذه التقنية يمكن تنفيذها على نحو فعال في أي إعداد المختبر واستخدامها في التجارب التي تستهدف التعبير الجيني في العمود الفقري.

Protocol

أجريت هذه الدراسات في إطار بروتوكول وافقت عليه لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية من جامعة كاليفورنيا، سان دييغو وكانت في الامتثال مع جمعية لتقييم المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان المختبر للاستخدام الحيوان. وقد أجريت جميع الدراسات بطريقة تقلل إلى أدنى حد حجم المجموعة والمعاناة الحيوانية.

1. عام الحيوان وإعداد الجراحية

1. قبل البدء في الإجراء الجراحي، ذوبان الجليد الفيروس (AAV9-UBI- غفب، 5 قسامات ميكرولتر) ⁸ . إعداد 5٪ ديكستران (10000 ميغاواط) الحل عن طريق خلط مسحوق ديكستران في الماء المقطر. مزيج من حل الفيروس مع 5٪ حل ديكستران 1: 1 إلى تركيز ديكستران النهائي من 2.5٪.
   1. تخزين محلول فيروس على الجليد (4 درجة مئوية).
2. استخدام الكبار C57BL / 6J الفئران (الذكور والإناث، 20-30 ز). تخدير الفئران باستخدام 5٪ إيسوفلوران (في O ₂ ، 1 لتر / دقيقة) والحفاظ عليها في 2-3٪ استنشاق إيسوفلوران (في O ₂ ، 1 لتر / دقيقة) بواسطة مخروط الأنف أثناء الجراحة، وهذا يتوقف على معدل التنفس واستجابة قرصة مخلب.
3. يحلق الجزء الخلفي من الحيوانات مع كليبرز الحلاقة وتنظيف الجلد مع 2٪ الكلورهيكسيدين.
4. في دراسات الانتعاش المزمن تتبع تقنية معقمة صارمة.
5. إذا الحقن القطنية تحت القشرية التي يتعين القيام بها، وقطع الجلد تراكب الفقرات TH8-L1 مع مشرط وفصل العضلات الفقرية من الفقرات العمود الفقري TH10-12 باستخدام مقص.
   1. جبل الحيوان في إطار التجسيمي القياسية باستخدام المشابك العمود الفقري الماوس.
   2. يحلق كلا الجانبين من الصفيحة من الفقرات TH10-12 باستخدام الحفر الأسنان (مثقاب: 0.9 ملم، والسرعة: 20،000 دورة في الدقيقة) حتى تظهر الشقوق.
   3. إزالة شظايا العظام متصدع مع ملقط وفضح السطح الظهري من الحبل الشوكي القطني.
   4. قطع فتح الجافية حوالي 1 سم باستخدام 30 G الفولاذ المقاوم للصدأ إبرة وملقط.
6. إذا حقن عنق الرحم القروية هي التي يتعين القيام بها، شق الرقبة الظهرية الجلد 1.5-2 سم باستخدام مقص وفضح شرائح C1-C2.
   1. إزالة الغشاء أتلانتو القذالي من الصهريج ماجنا باستخدام 23G إبرة الفولاذ المقاوم للصدأ وملقط.
   2. تنظيف موقع شق من أي الأنسجة والحطام العظام باستخدام مسحات القطن.
   3. قطع فتح الجافية حوالي 2-3 ملم باستخدام 30 G الفولاذ المقاوم للصدأ إبرة وملقط.

2. فتح غشاء بيال وإدراج إبرة سوبالي ل AAV9 التسليم

1. جبل 34 G بيا اختراق إبرة في Z- الذراع من مناور شيز باستخدام حامل الزجاج الشعرية ( الشكل 1A و B ).
   ملاحظة: لتصنيع إبرة اختراق بيا، وشحذ مشطوف الأصلي من إبرة 34G وشحذ باستخدام بيفيلر الزجاجية الشعر مع لوحة الماس جلخ - الخشنة (5.0 ميكرون إلى 50 ميكرون الأحجام نصيحة) وزاوية طحن15 - 20 °. غيض من الإبرة (1 مم طول، يقاس من طرف) ثم عازمة بلطف إلى حوالي 90 درجة ( الشكل 1B ، إدراج اليسار).
2. باستخدام نطاق تشريح الجراحي، وتعيين إلى 8-10 X التكبير، اختراق الحنون مع إبرة اختراق حنون عن طريق 1 ملم ( الشكل 1C ) باستخدام X- الذراع.
   1. الحفاظ على زاوية إبرة اختراق على سطح الأنسجة في 5-10 درجة.
3. بعد افتتاح حنون، وإزالة إبرة اختراق حفرة بين أفقيا من الفضاء القزح ( الشكل 1 D) باستخدام X- الذراع.
   ملاحظة: تذكر الموقع الذي تم اختراقه من قبل معلم، مثل الأوعية الدموية.
4. تحميل إبرة الحقن 36G حادة مع فيروس AAV9-UBI- غفب باستخدام ميكروسيرينج 50 ميكرولتر متصلة إبرة الحقن مع بي-10 أو بي-20 الأنابيب.
5. جبل الإبرة في Z- الذراع من مناور شيز الثاني ( الشكل 1A و B ) باستخدام حامل الزجاج الشعرية ( الشكل 1B ، إدراج الحق).
   ملاحظة: لتصنيع إبرة حقن AAV9 تحت السطحية، يتم مصقول غيض حادة من إبرة 36 ​​G باستخدام الزجاج الشعيرات الشعرية مع الماس جلخ لوحة - الخشنة (5.0 ميكرون إلى 50 ميكرون الأحجام نصيحة) لإزالة حواف حادة. غيض من الإبرة (2-3 ملم طول، يقاس من طرف) ثم عازمة بلطف إلى حوالي 90 درجة. يتم إدخال إبر الحقن اختراق و سوبتيال في 1-2 سم طويلة 20G الرقيق أنابيب الفولاذ المقاوم للصدأ (10 ملم من نهاية الإبرة) وصقها مع الايبوكسي. مطلوب استخدام 20 G (0.91 مم قطرها) أنابيب لمرفق آمن إلى حامل الزجاجية الشعرية.
6. من خلال التلاعب X، Y، Z الأسلحة من مناور الثاني، وضع غيض من إبرة الحقن AAV9 في الموقع اختراق بيا ثم تقدمه حوالي 2-3 ملم في الفضاء تحت القاع من خلال افتتاح غشاء بيال السابق باستخدام X-الذراع( الشكل 1E و F ).
   ملاحظة: 1) يتم إعداد AAV9-UBI- غفب وفقا لبروتوكولات ذكرت سابقا ^{9 ، 10} ، ويتم تعديل التتر النهائية إلى 1.2 × 10 ¹³ نسخ الجينوم لكل مل (غ / مل). 2) ليست هناك حاجة لوضع علامة على موقع افتتاح بيال لأنه يمكن التعرف عليها بسهولة ( الشكل 1D ).
7. حقن AAV9-UBI- غفب (1.5، 3، أو 5 ميكرولتر) في الفضاء تحت القاع باستخدام ميكروسيرينج 50 ميكرولتر (انظر الجدول 1 للمجموعات التجريبية).
8. إزالة إبرة الحقن من الفضاء تحت القاع بعد حقن AAV9-UBI- غفب كاملة.
9. إغلاق العضلات والجلد باستخدام 4.0 خيط حيدة ومقاطع الجراحية.
   ملاحظة: ليست هناك حاجة لختم فقرة مفتوحة.
10. السماح للحيوانات لاسترداد على وسادة التدفئة.
11. للسيطرة على الألم حقن البوبرينورفين 0.05 ملغ / كغ / سك كل 12 ساعة ل2-3 أيام بعد الجراحة.

3. التروية التثبيت، الأنسجة كريوبروتكتيون، و المناعي تلطيخ

1. في وقت محدد سلفا بعد الحقن AAV9 سوبالي، تخدير عميق الفئران مع القتل الرحيم حل (انظر جدول المواد ، 0.3 مل) وترانسكارديالي يروي لهم 20 مل من الهيبارينيز المالحة تليها 20 مل من بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني.
2. تشريح الحبل الشوكي والعقول باستخدام رونجور العظام وبعد إصلاحها في 4٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
3. كريوبروتيكت الحبل الشوكي والعقول مع 30٪ السكروز في برنامج تلفزيوني لمدة لا تقل عن 5-7 أيام.
4. قطع الاكليلية، عرضية، أو طولية / أقسام المجمدة الأفقية (30 ميكرون سميكة) على ناظم البرد وتخزينها في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية.

4. المناعي تلطيخ الحبل الشوكي وأقسام الدماغ (انظر جدول المواد)

1. احتضان أقسام العائمة الحرة في بريمارy بين عشية وضحاها.
2. بعد الحضانة مع الأجسام المضادة الأولية، وغسل المقاطع ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني واحتضان مع مضان مترافق حمار مكافحة الأرنب، حمار مكافحة الدجاج، والحمار المضادة للماعز الأجسام المضادة الثانوية.
3. تركيب المقاطع على الشرائح المجهرية، وتجفيفها في درجة حرارة الغرفة، وتغطيتها مع المتوسطة المضادة للتلاشي.
4. التقاط الصور باستخدام المجهر مضان إبيفلورزنس (الأهداف: 10X، نا-0.3؛ 20X، نا-0.8؛ و 63 X، نا-1.4).

النتائج

التعبير عن التحوير القوي في قطاعات حقن AAV9 تحت الأفرع:
أظهر تحليل التحوير (غفب) التعبير في أقسام الحبل الشوكي في 14 يوما بعد تسليم AAV9 AAV9 جرعة التعبير غفب تعتمد في جميع أنحاء الحمة الشوكي. أولا، تم ربط اثنين من ثلاثة حقن 3 ميكرولتر من AAV9-UBI...

Discussion

وتصف الدراسة الحالية تقنية ناقلات تحت القفص (AAV9) تسليم الفئران البالغة. كما هو مبين في الفيديو المصاحب، يمكن استخدام هذا النهج والتقنية على نحو فعال، شريطة أن يتم تصنيع الأدوات المطلوبة والإبرة اختراق بيا إبرة وحقن تحت الجلد بشكل صحيح، وفقا للمواصفات المعمول بها واخ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J Mice	Jackson Labs	664
Lab Standard Stereotaxic for Mice	Harvard Apparatus	72-9568
Mouse Spinal Adaptor	Harvard Apparatus	72-4811
XYZ Manipulator	Stoelting	51604
Manual Infusion Pump	Stoelting	51218
34G Beveled Nanofill Needle	World Precision Instruments	NF34BV-2
36G Blunt Nanofill needle	World Precision Instruments	NF-36BL-2
Fluriso, Isoflurane	MWI Veterinary Supply	502017
Chlorhexidine Solution	MWI Veterinary Supply	501027
20G Stainless Steel Needle	Becton-Dickinson	305175
23G Stainless Steel Needle	Becton-Dickinson	305145
30G Stainless Steel Needle	Becton-Dickinson	305128
Cotton Tipped Applicator	MWI Veterinary Supply	27426
Glass Capillary Beveller	Narishige International	SM-25B
Slide Microscope Superfrost	Leica Microsystems	M80
50μl Microsyringe	Hamilton	81242
BD Intramedic PE-20 Tubing	Becton, Dickinson	427406
BD Intramedic PE-10 Tubing	Becton, Dickinson	427401
4-0 monofilament suture	VetOne	V1D397
Glass Capillary Beveller	Narishige	Pipet Micro Grinder EG-40
5 min Epoxy (Epoxy Clear)	Devcon	14310
Euthanasia Solution	MWI Veterinary Supply	11168
Heparin Inj 1000U/mL	MWI Veterinary Supply	54254
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Anti NeuN Antibody	EMD-Millipore	ABN78	Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000
Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody	EMD-Millipore	AB144P	Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100
Anti GFP Antibody	Aves Labs	GFP-1020	Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A21207	Secondary Antibody, 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680	ThermoFisher Scientific	A10043	Secondary Antibody, 1:1000
Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Jackson Immunoresearch Labs	703-545-155	Secondary Antibody, 1:1000
Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647	Abcam	ab150131	Secondary Antibody, 1:1000
Slide Microscope Superfrost	Fisher Scientific	12-550-143
ProLong Gold Antifade Mountant	Fisher Scientific	P36930
Epifluorescence Microscope	Zeiss	Zeiss AxioImager M2
Fluorescence Confocal Microscope	Olympus	Olympus FV1000
Dextran	Polysciences, Inc	19411
AAV9-UBC-GFP	UCSD Viral Vector Core Laboratory