Yetişkin Farelerde Subpial Adeno-ilişkili Virüs 9 (AAV9) Vektör Teslimatı

Özet

Bu çalışmanın amacı yetişkin farelerde yeni bir subpial gen dağıtım tekniği kullanarak spinal adeno-ilişkili virüs 9 (AAV9) aracılı gen dağıtımının potensi ve güvenliğini geliştirmek ve doğrulamaktı.

Özet

Yetişkin sıçanlarda ve domuzlarda subpeal bir adeno-ilişkili virüs 9 (AAV9) vektör nakli tekniğinin başarıyla geliştirilmesi daha önce bildirilmiştir. AAV9 sunumu için sub-polial polietilen kateteri (PE-10 veya PE-5) kullanarak subpial enjekte edilmiş spinal segmentlerdeki spinal parankima boyunca (beyaz ve gri madde) güçlü transgen ekspresyonu gösterilmiştir. Nörodejeneratif hastalıkların geniş çaplı transgenik fare modelleri nedeniyle, yetişkin farelerde güçlü bir merkezi sinir sistemi (CNS) hedefli vektör nakli tekniğinin geliştirilmesi için güçlü bir istek vardır. Buna göre, bu çalışmada yetişkin C57BL / 6J farelerinde güvenli ve etkili spinal AAV9 verilmesine izin veren bir spinal subpial vektör nakil cihazının ve teknik geliştirilmesi açıklanmaktadır. Spinal olarak immobilize ve anestezi uygulanmış farelerde, pia mater (servikal 1 ve lumbar 1-2 spinal segmental düzey), bir XYZ manipülatörü kullanılarak keskin bir 34G iğne ile kesilmiştir. İkinci bir XYZ maNipulator daha sonra lomber ve / veya servikal subpial alana künt bir 36G iğne ilerletmek için kullanıldı. Daha sonra, yeşil flüoresan proteini (GFP) kodlayan AAV9 vektörü (3-5 uL, 1.2 x 10 ¹³ genom kopyaları (gc)) subpial olarak enjekte edildi. Enjeksiyondan sonra nörolojik fonksiyon (motor ve duyu) periyodik olarak değerlendirildi ve hayvanlar% 4 paraformaldehitle AAV9 verildikten 14 gün sonra perfüzyonla sabitlendi. Yatay veya transvers omurilik kesitlerinin analizi, gri ve beyaz maddelerin tümünde omurilik boyunca transgen ekspresyonu gösterdi. Buna ek olarak, motor kortekste, çekirdek ruberinde ve formatio retikularda inen motor aksonlarda ve nöronlarda, retrograd olarak aracılık edilen yoğun GFP ekspresyonu görüldü. Herhangi bir hayvanda hiçbir nörolojik bozukluk kaydedilmedi. Bu veriler, subpial vektör sunum tekniğinin prosedürle ilişkili omurilik hasarına neden olmaksızın erişkin farelerde başarıyla kullanılabileceğini ve son derece güçlü transgen ekspresyonlarıyla ilişkili olduğunu göstermektedirOmurilik nöraksileri boyunca.

Giriş

Çeşitli omurilik ve SSS nörodejeneratif bozukluklarını tedavi etmek için AAV vektörlerinin kullanılması ilgi gen (ler) in ekspresyonunu etkili bir şekilde arttırmak veya susturmak için iyi kabul görmüş bir platform haline gelmektedir. CNS / omurilik bozukluklarını tedavi etmek için bu teknolojinin daha etkin kullanılması için en önemli sınırlamalardan biri, yetişkin memelilerde AAV vektör (ler) ini derin beyne veya omurilik parankimine sunma yeteneğinin sınırlı olmasıdır.

Örneğin AAV9'un yetişkin kemirgenlerde, kedilerde veya insan dışı primatlarda sistemik olarak verilmesinin, beyinde ve omurilikte bulunan nöronlarda ^{1 , 2 , 3} nolu transgen ekspresyonunu indüklemede sadece orta derecede etkili olduğu gösterildi. AAV9 vektörlerinin daha etkin intratekal sunumunun, anatomik olarak tanımlanmış nöron havuzlarında sadece sınırlı transgenin ekspresyona yol açtığı gösterilmiştir. Daha özel olarak, iblisler olduInsan dışı primatlarda, domuzlarda veya kemiricilerde sisternal veya lumbo-sakral intratekal AAV9 verilmesinin spinal α motonöronlarında ve segmental dorsal kök ganglion nöronlarında yüksek düzeyde transgene eksprese edildiğini belirtti. Bununla birlikte, beyaz cevherde spinal internöronlarda veya artan veya azalan aksonlarda minimal veya hiç ifade görülmemektedir ^{4 , 5 , 6 , 7} . Toplu halde, bu veriler, intratekal olarak verilen AAV'nin daha derin spinal parankime yayılmasını önleyen, oldukça etkili bir biyolojik anatomik bariyer bulunduğunu göstermektedir.

Yetişkin sıçan ve fareleri kullanılarak Önceki bir çalışmada, yeni bir subpial vektör dağıtım tekniği ⁸ geliştirilmiştir. Bu yaklaşımı kullanarak, tekli bolus subpial AAV9 sunumundan sonra çok kuvvetli ve çok segmentli transgen ekspresyonu gösterildi. Yoğun GFP ifadesi sürekli olarak görüldüEnjekte edilmiş spinal segmentler vasıtasıyla nöronlarda, glial hücrelerde ve inen / yükselen aksonlarda. Bu çalışma, pia mater'in intratekal alanın spinal parankim içine etkili AAV9 difüzyonunu sınırlayan birincil bariyeri temsil ettiğini ilk kez gösterdi. Bu önceden geliştirilmiş teknik ve subpial enjeksiyon cihazı büyük kemirgenlerde (sıçanlar gibi) veya yetişkin domuzlarda nispeten kolaydır; ancak sistem yetişkin fareler gibi küçük hayvanlarda kullanım için uygun değildir. Çeşitli nörodejeneratif bozukluklara sahip mevcut transjenik fare modellerinin sayısının yüksek olması nedeniyle farelerde etkili bir spinal-parankimal vektör nakli tekniğinin geliştirilmesine açık bir ihtiyaç vardır. Böyle bir tekniğin varlığı spesifik gen sessizleşmesinin etkisini ( örneğin shRNA kullanarak) veya hücreye özgü olmayan ( örneğin sitomegalovirüs-CMV veya Ubiquitin) veya hücreye spesifik ( örn., Sinapsin veya glial Fibriler asidikProtein (GFAP) promotörlerinin erken postnatal gelişimi sırasında veya hastalıklı koşullar altında.

Buna göre, bu çalışmada, yetişkin farelerde etkili bir şekilde kullanılabilen minyatür bir subpial vektör iletim sistemini geliştirdik ve doğruladık. Benzer şekilde, önceki sıçan ve domuz çalışmalarında olduğu gibi, bu çalışma farelerde tekli bolus subpial AAV9 verilmesinden sonra omurilik parankim boyunca güçlü bir transgen ekspresyonunu göstermektedir. Bu yaklaşımın basitliği, enjekte edilen farelerin subpial AAV9 sunumu için çok iyi tolere edilebilirliği ve spinal parankimdeki transgen ekspresyonunun yüksek gücü, bu tekniğin herhangi bir laboratuar ortamında etkili bir şekilde uygulanabileceğini ve spinal gen ekspresyonunu hedefleyen deneylerde kullanılabileceğini düşündürmektedir.

Protokol

Bu çalışmalar, San Diego Kaliforniya Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan ve hayvan kullanımı için Laboratuar Hayvan Bakımı yönergelerinin Değerlendirilmesi Derneği ile uyumlu bir protokol çerçevesinde yürütülmüştür. Tüm çalışmalar, grup büyüklüğünü ve hayvan acısını en aza indirecek şekilde yapıldı.

1. Genel Hayvan ve Cerrahi Hazırlık

1. Cerrahi prosedürü başlatmadan önce virüsü çözdürün (AAV9-UBI-GFP, 5 μL alikotlar) ⁸ . Damıtılmış suda dekstran tozunu karıştırarak% 5 dekstran (10,000 MW) solüsyonu hazırlayın. Virüs çözeltisini,% 2.5'lik bir son dekstran konsantrasyonuna kadar% 5 dekstran çözeltisi 1: 1 ile karıştırın.
   1. Virüs çözeltisini buzda (4 ° C) saklayın.
2. Yetişkin C57BL / 6J fareler kullanın (erkek ve dişi, 20-30 g). Farelerde% 5 izofluran (O ₂ , 1 L / dakika) ile anestezi uygulayın ve 2Solunum hızına ve pençe tutam tepkisine bağlı olarak cerrahi sırasında burun konisi ile% 3 inhale izofluran (O ₂ , 1 L / dakika).
3. Hayvanların tıraş tıraş makası ile tıraş edin ve cildi% 2 klorheksidin ile temizleyin.
4. Kronik iyileşme çalışmalarında sıkı bir steril teknik izleyin.
5. Lomber subpial enjeksiyonlar yapılacaksa, Th8-L1 vertebra üzerine örtülü bir deri kestiği bir bisturi ile kesin ve makas kullanarak paravertebral kası Th10-12 spinal vertebradan ayırın.
   1. Fareyi omurga kelepçeleri kullanarak standart bir stereotaksik çerçeveye yerleştirin.
   2. Çatlaklar görününene kadar Th10-12 omurganın katının her iki tarafını bir diş matkabı (matkap ucu: 0.9 mm, hız: 20.000 dev / dak) ile tıraş edin.
   3. Kırık kemik parçalarını forsepsle çıkarın ve bel omurgasının dorsal yüzeyini ortaya çıkarın.
   4. 30 g paslanmaz çelik bir iğne ve forseps kullanarak durayı 1 cm kadar açık bırakın.
6. Servikal subpial enjeksiyonlar yapılacaksa, dorsal boyun derisini 1.5-2 cm incikoz kullanarak inceltin ve C1-C2 parçalarını maruz bırakın.
   1. 23G paslanmaz çelik bir iğne ve forseps kullanarak cisterna magnanın atlanto-oksipital zarını çıkarın.
   2. Pamuklu çubuk kullanarak herhangi bir doku ve kemik enkazının kesi bölgesini temizleyin.
   3. Durayı, 30 G paslanmaz çelik bir iğne ve forseps kullanarak 2-3 mm kadar kesip kesin.

2. Piyel Membranının Açılması ve AAV9 Tesliminde Alt İğne Takılması

1. 34 G pia delici iğneyi, bir cam kılcal tutucu kullanarak bir XYZ manipülatörünün Z-koluna takın ( Şekil 1A ve B ).
   NOT: Pia delici iğneyi üretmek için, 34G iğnenin orijinal eğimli ucu, elmas aşındırıcı plakalı (kaba (5.0 μm ila 50 μm uç boyutları) cam kılcal bir beveller ve bileme açısı15 - 20 °. İğnenin ucu (1 mm uzunluk, ucundan ölçülür) yaklaşık 90 ° derece hafifçe bükülür ( Şekil 1B , sol uç).
2. Cerrahi bir diseksiyon kapsamı kullanarak, 8-10 X büyütme noktasına ayarlayın, pia'yı pia nüfuz eden iğne ile X-kolunu kullanarak yaklaşık 1 mm ( Şekil 1C ) geçirin.
   1. 5-10 ° C'de doku yüzeyine nüfuz eden iğnenin açısını koruyun.
3. Pia açıldıktan sonra, X-kolunu kullanarak pia penetrasyon iğnesini alt yüzey alanından yatay olarak çıkarın ( Şekil 1 D).
   NOT: Girilen bölgeyi bir kan damarı gibi bir yer işareti ile hatırla.
4. PE-10 veya PE-20 hortumu ile enjeksiyon iğnesine bağlı 50 μL'lik bir mikrosirajı kullanarak AAV9-UBI-GFP virüsü ile künt bir 36G enjeksiyon iğnesi yerleştirin.
5. İğneyi ikinci bir XYZ manipülatörünün Z-koluna monte edin ( Şekil 1A ve B ) bir cam kılcal tutucu ( Şekil 1B , sağ ekleme) kullanarak.
   NOT: Alt AAV9 enjeksiyon iğnesi üretmek için, 36 G'lik bir iğnenin künt ucu, keskin kenarları kaldırmak için elmas aşındırıcı plakalı kaba (5.0 μm ila 50 μm uç boyutları) bir cam kılcal eğimli bez kullanarak cilalanır. İğnenin ucu (2-3 mm uzunluğunda, ucundan ölçülür) yaklaşık 90 ° derece hafifçe bükülür. Pia nüfuz eden ve subpial enjeksiyon iğneleri, 1-2 cm uzunluğundaki 20G köle paslanmaz çelik boruya (iğnenin ucundan 10 mm uzaklıkta) sokulur ve epoksi ile yapıştırılır. Cam kılcal tutucuya güvenli bir şekilde tutturmak için 20 G (0,91 mm çaplı) boru kullanılması gereklidir.
6. İkinci manipülatörün X, Y ve Z kollarını manipüle ederek, AAV9 enjeksiyon iğnesinin ucunu pia nüfuz etmiş bölgeye yerleştirin ve daha sonra bir önceki piyel membran açılımı boyunca alt yüzey alanına 2-3 mm ilerletin. X-kolu( Şekil 1E ve F ).
   NOT: 1) AAV9-UBI-GFP, daha önce bildirilen protokoller ^{9 , 10'a} göre hazırlanır ve nihai titreler mL başına (gc / mL) 1.2 x 10 ¹³ genom kopyasına ayarlanır. 2) Kolaylıkla tanımlanabileceği için çukur açma bölgesinin işaretlenmesine gerek yoktur ( Şekil 1D ).
7. AAV9-UBI-GFP'yi (1.5, 3 veya 5 μL) 50 μL'lik bir mikro-şırınga kullanarak subspektif alana enjekte edin (deneysel gruplar için Tablo 1'e bakın).
8. AAV9-UBI-GFP enjeksiyonu tamamlandıktan sonra enjeksiyon iğnesini alt yüzey alanından çıkarın.
9. 4.0 monofilament sütür ve cerrahi klipsleri kullanarak kas ve cildi kapatın.
   NOT: Açık omurgayı sızdırmaya gerek yoktur.
10. Hayvanların bir ısıtma masasında iyileşmesine izin verin.
11. Ağrı kontrolü için her 12 saatte 0.05 mg / kg / sn Buprenorfin enjekte edilirAmeliyattan 2-3 gün sonra.

3. Perfüzyon-fiksasyon, Doku KriyroKoruma ve İmmünofloresan Boyama

1. Alt AAV9 enjeksiyonlarından sonra önceden belirlenmiş bir zaman noktasında, ötenazi solüsyonu ( Madde Tablosu , 0.3 mL) ile fareleri derinden anestezi altına alınız ve bunları 20 mL heparinize salin ile transkardiyolden perfüze ettikten sonra 20 mL% 4 paraformaldehid PBS içinde perfüze edin.
2. Omurga kordlarını ve beyinlerini bir kemik rongeur kullanarak parçalara ayırın ve gece boyunca 4 ° C'de PBS'de% 4 formaldehitle post-fix edin.
3. Omurga kordlarını ve beyinlerini 5-7 gün minimum süreyle PBS içinde% 30 sükroz ile kriyoprotekte edin.
4. Bir kriyostat üzerinde koronal, transvers veya uzunlamasına / yatay dondurulmuş kesitleri (30 μm kalınlıkta) kesin ve 4 ° C'de PBS'de saklayın.

4. Omurilik ve Beyin Bölümlerinin İmmünofloresan Boyaması (Bkz. Malzeme Tablosu)

1. Serbest yüzen bölümleri ilk aşamada kuluçkalayınY antikorlarını gece boyunca.
2. Birincil antikorlar ile inkübasyondan sonra, bölümleri PBS içinde üç kez yıkayın ve flüoresan eşlenik eşek anti-tavşan, eşek anti-tavuk ve eşek anti-keçi ikincil antikorlarla inkübe edin.
3. Mikroskopik slaytlar bölümleri monte edin, oda sıcaklığında kurutun ve bir anti-solmaya ortamı ile örtün.
4. Epifloresan floresan mikroskopu (hedefler: 10X, NA-0.3; 20X, NA-0.8 ve 63X, NA-1.4) kullanarak görüntü yakalama.

Sonuçlar

Subpial AAV9 Enjeksiyonlu Kesitlerdeki Potansiyel Transgen Ekspresyonu:
AAV9 verilmesinden 14 gün sonra omurilik bölümlerindeki transgene (GFP) ekspresyon analizi, spinal parankim boyunca AAV9 dozuna bağımlı GFP ekspresyonu gösterdi. Önce, üst bel subpial alanına enjekte edilen iki bilateral 3 μL AAV9-UBI-GFP enjeksiyonu, tüm lomber omurilikte üst torakal segmentlere uzanan beyaz ve gri maddenin yakın komşuluğu ile ilişkilendirildi (

Tartışmalar

Mevcut çalışma yetişkin farelerde subpial vektör (AAV9) verilmesinin bir teknikini açıklamaktadır. Ekli videoda gösterildiği gibi, bu yaklaşım ve teknik, gerekli araçların ve pia-delici iğne ve subpial enjeksiyon iğnesinin kurulmuş ve test edilmiş spesifikasyonlara uygun olarak üretilmesi şartıyla etkin bir şekilde kullanılabilir.

Farelerde Tutarlı ve Güvenli Subpial Enjeksiyon Yapmada Kritik Teknik Değişkenler:
Gösterildiği gibi, dorsal b...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J Mice	Jackson Labs	664
Lab Standard Stereotaxic for Mice	Harvard Apparatus	72-9568
Mouse Spinal Adaptor	Harvard Apparatus	72-4811
XYZ Manipulator	Stoelting	51604
Manual Infusion Pump	Stoelting	51218
34G Beveled Nanofill Needle	World Precision Instruments	NF34BV-2
36G Blunt Nanofill needle	World Precision Instruments	NF-36BL-2
Fluriso, Isoflurane	MWI Veterinary Supply	502017
Chlorhexidine Solution	MWI Veterinary Supply	501027
20G Stainless Steel Needle	Becton-Dickinson	305175
23G Stainless Steel Needle	Becton-Dickinson	305145
30G Stainless Steel Needle	Becton-Dickinson	305128
Cotton Tipped Applicator	MWI Veterinary Supply	27426
Glass Capillary Beveller	Narishige International	SM-25B
Slide Microscope Superfrost	Leica Microsystems	M80
50μl Microsyringe	Hamilton	81242
BD Intramedic PE-20 Tubing	Becton, Dickinson	427406
BD Intramedic PE-10 Tubing	Becton, Dickinson	427401
4-0 monofilament suture	VetOne	V1D397
Glass Capillary Beveller	Narishige	Pipet Micro Grinder EG-40
5 min Epoxy (Epoxy Clear)	Devcon	14310
Euthanasia Solution	MWI Veterinary Supply	11168
Heparin Inj 1000U/mL	MWI Veterinary Supply	54254
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Anti NeuN Antibody	EMD-Millipore	ABN78	Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000
Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody	EMD-Millipore	AB144P	Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100
Anti GFP Antibody	Aves Labs	GFP-1020	Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A21207	Secondary Antibody, 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680	ThermoFisher Scientific	A10043	Secondary Antibody, 1:1000
Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Jackson Immunoresearch Labs	703-545-155	Secondary Antibody, 1:1000
Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647	Abcam	ab150131	Secondary Antibody, 1:1000
Slide Microscope Superfrost	Fisher Scientific	12-550-143
ProLong Gold Antifade Mountant	Fisher Scientific	P36930
Epifluorescence Microscope	Zeiss	Zeiss AxioImager M2
Fluorescence Confocal Microscope	Olympus	Olympus FV1000
Dextran	Polysciences, Inc	19411
AAV9-UBC-GFP	UCSD Viral Vector Core Laboratory