成体マウスにおける子宮頸部アデノ随伴ウイルス9（AAV9）ベクター送達

要約

本研究の目的は、成体マウスにおける新規な遺伝子サブ送達技術を用いて、脊髄アデノ随伴ウイルス9（AAV9）媒介遺伝子送達の効力および安全性を開発および検証することであった。

要約

成体ラットおよびブタにおける亜麻痺性アデノ随伴ウイルス9（AAV9）ベクター送達技術の成功した開発は以前に報告されている。 AAV9送達のために下位に配置されたポリエチレンカテーテル（PE-10またはPE-5）を使用して、脊髄実質を介した潜在的なトランスジーン発現（白人および灰白質）が、浅部注射された脊髄セグメントにおいて実証されている。神経変性疾患のトランスジェニックマウスモデルの広い範囲のため、成体マウスにおける強力な中枢神経系（CNS）標的化ベクター送達技術の開発に対する強い要望がある。したがって、本研究は、成体C57BL / 6Jマウスにおいて安全かつ有効な脊髄AAV9送達を可能にする脊髄小脳ベクター送達装置および技術の開発を記載する。脊椎固定化および麻酔したマウスでは、XYZマニピュレータを用いて、脊髄（頚部1および腰部1-2の脊髄分節レベル）を鋭利な34Gの針で切開した。第2のXYZma次いで、鈍い36G針を腰部および/または頸部の胸部空間に進めるために、ニプレーターを使用した。次いで、緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードするAAV9ベクター（3-5μL; 1.2×10 ¹³ゲノムコピー（gc））を皮下注射した。注射後、神経機能（運動および感覚）を定期的に評価し、4％パラホルムアルデヒドでAAV9送達してから14日後に動物を灌流固定した。水平または横断脊髄切片の分析は、灰白質および白質の両方において、脊髄全体にわたって導入遺伝子発現を示した。さらに、強く逆行的に媒介されるGFP発現は、運動皮質、核破裂部および網様体における下行運動軸およびニューロンにおいて見られた。いずれの動物においても神経学的機能障害は認められなかった。これらのデータは、小児ベクター送達技術が、処置関連の脊髄損傷を引き起こすことなく、成体マウスにおいて首尾よく使用され得、非常に強力な導入遺伝子発現に関連することを示す脊髄神経叢全体にわたって

概要

多様な脊髄およびCNS神経変性疾患を治療するためのAAVベクターの使用は、関心のある遺伝子の発現を効果的にアップレギュレートまたはサイレンシングするための十分に容認されたプラットフォームとなっている。 CNS /脊髄障害を治療するためのこの技術のより有効な利用に対する重要な制限の1つは、成人哺乳動物の深部脳または脊髄実質にAAVベクターを送達する能力が限られていることである。

それは大人の齧歯類、ネコ、または非ヒト霊長類におけるAAV9の全身送達は、脳や脊髄の^1、2、3のニューロンに導入遺伝子発現を誘導することでのみ適度に有効であること、例えば、実証されました。 AAV9ベクターのより効果的な髄腔内送達は、解剖学的に定義されたニューロンのプールにおいて限られたトランスジーン発現しかもたらさないことも示されている。より具体的には、それは悪魔非ヒト霊長類、ブタ、またはげっ歯類におけるcisternalまたはlumbo-sacralの髄腔内髄腔内AAV9送達が、脊髄α-運動ニューロンおよび部分的な背根神経節ニューロンにおいて高レベルのトランスジーン発現をもたらすことを示している。しかし、脊髄介在ニューロン又は昇順または白質における下降軸索における最小または全く発現は^{、4、5、6、7を}見ています。まとめると、これらのデータは、髄腔内に送達されたAAVのより深い脊柱実質への拡散を防止する、非常に有効な生物学的 - 解剖学的障壁が存在することを示す。

成体ラットおよびブタを用いた以前の研究では、新規な小児ベクター送達技術が開発された⁸ 。このアプローチを使用して、単一ボーラスAAV9送達後に、非常に強力で多セグメントのトランスジーン発現が実証された。激しいGFP発現が一貫して見られた神経細胞、グリア細胞、および下垂/上行軸索において、注入された脊髄分節を通過する。この研究は、髄膜腔からの脊髄実質への効果的なAAV9の拡散を制限する主な障壁であることを初めて実証した。この以前に開発された技術および小児注射デバイスは、大きなげっ歯類（ラットのような）または成人のブタで使用するのが比較的容易であるが、成体マウスのような小型動物での使用には適していない。様々な神経変性障害の利用可能なトランスジェニックマウスモデルの数が多いため、マウスにおける効果的な脊柱 - 実質細胞ベクター送達技術の開発が明らかに必要とされている。そのような技術の利用可能性は、細胞非特異的（ 例えば、サイトメガロウイルス-CMVまたはユビキチン）または細胞特異的（ 例えば、シナプシンまたはグリア）を用いた特異的遺伝子サイレンシング（ 例えば、 shRNAを用いる）またはアップレギュレーションの研究を可能にする線維性酸性プロテイン（GFAP））プロモーターの活性を阻害する可能性がある。

したがって、本研究では、成体マウスにおいて効果的に使用され得る小型の小児ベクター送達システムを開発し、検証した。同様に、以前のラットおよびブタの研究の場合と同様に、この研究は、マウスにおける単球ボーラスsubpial AAV9送達後の脊柱実質全体にわたる有力なトランスジーン発現を実証する。このアプローチの単純さ、腹腔内AAV9送達に対する注射されたマウスの非常に良好な忍容性、および脊髄実質における導入遺伝子発現の高い効力は、この技術が任意の実験室環境において効果的に実施され得、脊髄遺伝子発現を標的とする実験において使用され得ることを示唆する。

プロトコル

これらの試験は、カリフォルニア大学サンディエゴ校の動物実験および使用委員会の承認を受けたプロトコールのもとで実施され、動物実験のための動物実験ガイドライン評価協会に準拠しています。すべての研究は、群の大きさおよび動物の苦痛を最小限に抑えるように実施した。

1.一般的な動物および外科的調製物

1. 手術を開始する前に、ウイルスを解凍する（AAV9-UBI-GFP;5μLアリコート） ⁸ 。デキストラン粉末を蒸留水に混合して5％デキストラン（10,000 MW）溶液を調製する。ウイルス溶液を5％デキストラン溶液と1：1で混合し、2.5％の最終デキストラン濃度にする。
   1. ウイルス溶液を氷上に保存する（4℃）。
2. 成体C57BL / 6Jマウス（オスおよびメス、20〜30g）を使用する。 5％イソフルラン（O 2、1L /分）を用いてマウスを麻酔し、 ₂で維持する-3％は、呼吸速度及び足ピンチ応答に応じて、手術中、ノーズコーンによってイソフルラン（O ₂中、1 L /分）吸入します。
3. シェービングクリッパーで動物の背中を剃り、2％クロルヘキシジンで皮膚をきれいにする。
4. 慢性的な回復研究では、厳密な無菌技術に従う。
5. 腰椎注射を行う場合は、Th8-L1椎骨の上にある皮膚をメスで切って、はさみを使ってTh10-12脊椎骨から傍脊椎筋を離します。
   1. マウスの脊髄クランプを使用して動物を標準的な定位フレームにマウントする。
   2. 亀裂が現れるまで歯科用ドリル（ドリルビット：0.9mm、速度：20,000rpm）を使用して、Th10-12椎骨の薄層の両面を剃る。
   3. 割れた骨断片を鉗子で除去し、腰椎の背側表面を露出させる。
   4. 30Gステンレススチール針と鉗子を使用して約1cmの硬膜を切る。
7. 23Gステンレス鋼の針と鉗子を使用して、大槽のアトランタ - 後頭皮膜を除去する。
8. 綿棒で組織や骨の破片の切開部位をきれいにします。
9. 30Gのステンレス製の針と鉗子を使用して約2〜3mmの硬膜を切る。

2.膜貫通開口およびAAV9送達のための子宮頸部針挿入

1. ガラス毛細管ホルダー（ 図1AおよびB ）を使用して、XYZマニピュレータのZアームに34 Gの貫通針を取り付けます。
   注：貫通針を製造するために、34Gニードルの元の面取りされた先端は、ダイヤモンド研磨板を有するガラスキャピラリーベベル（荒い（5.0μm〜50μmの先端サイズ））および砥石角度15〜20°。針の先端（先端から測定して1mmの長さ）を約90°に緩やかに曲げます （ 図1B 、左のインサート）。
2. 8-10倍に設定された外科的解剖スコープを使用して、Xアームを用いて約1mm（ 図1C ）の穿刺針で穿刺する。
   1. 組織の表面に針を通す角度を5~10°に保つ。
3. 開口部を開いた後、Xアームを用いて平滑筋から水平に貫通した針を抜去する（ 図 1D）。
   注：貫通した場所は、血管などのランドマークで覚えています。
4. PE-10またはPE-20チューブを注射針に接続した50μLマイクロシリンジを用いて、鈍的36G注射針にAAV9-UBI-GFPウイルスをロードする。
5. 第2のXYZマニピュレータのZアームに針を取り付けます （ 図1A 図1B、右側インサート）を使用してNG>及びB）。
   注：サブプライアルAAV9注射針を製造するために、36G針の鈍い先端を、ダイヤモンド研磨板 - 粗い（5.0μm〜50μmの先端サイズ）を備えたガラスキャピラリーベベルを用いて研磨し、鋭いエッジを除去する。針の先端（先端から測定して2〜3mmの長さ）を緩やかに約90°に曲げる。穿刺針および穿刺針を1-2cm長の20Gスレーブステンレス鋼管（針の端から10mm）に挿入し、エポキシで接着する。ガラスキャピラリーホルダーに確実に取り付けるためには、直径20 mm（直径0.91 mm）のチューブを使用する必要があります。
6. 第2マニピュレータのX、Y、Zアームを操作することにより、AAV9注射針の先端を穿刺部位に位置させ、次にこれを使用して、 Xアーム（ 図1EおよびF ）。
   注：1）AAV9-UBI-GFPは、以前のプロトコル^9、10を報告し、最終力価は、mL当たり1.2×10 ¹³ゲノムコピー（GC / mLで）に調整されるに従って調製されます。 2）容易に同定できるので、軟口蓋の部位をマークする必要はない（ 図1D ）。
7. 50μLのマイクロシリンジを用いて、AAV9-UBI-GFP（1.5、3、または5μL）をサブスペースに注入します（実験グループについては表1を参照）。
8. AAV9-UBI-GFP注入が完了した後、注射針をサブスペースから外す。
9. 4.0モノフィラメント縫合糸と外科用クリップを使用して筋肉と肌を閉じます。
   注記：開いた椎骨をシールする必要はありません。
10. 動物を加熱パッドで回復させる。
11. 疼痛管理のために、ブプレノルフィン0.05mg / kg / scを12時間毎に手術後2〜3日。

灌流固定、組織凍結保護、および免疫蛍光染色

1. 亜脂肪族AAV9注射後の所定の時点で、マウスを安楽死溶液（0.3mLの表を参照）で深く麻酔し、20mLのヘパリン処理した生理食塩水、次いで20mLのPBS中の4％パラホルムアルデヒドで経心灌流する。
2. 骨鉗子を使用して脊髄と脳を解剖し、PBS中の4％ホルムアルデヒドで4℃で一晩後固定する。
3. 最低5〜7日間、PBS中の30％スクロースで脊髄および脳を凍結保護する。
4. クライオスタット上で、コロナ、トランスバース、または縦/横の凍結切片（厚さ30μm）を切り取り、PBSに4℃で保存します。

4.脊髄および脳切片の免疫蛍光染色（材料表を参照）

1. フリーフローティングセクションをprimarでインキュベートするy抗体を一晩インキュベートする。
2. 一次抗体とのインキュベーションの後、PBSで3回切片を洗浄し、蛍光結合ロバ抗ウサギ、ロバ抗チキンおよびロバ抗ヤギ二次抗体とともにインキュベートする。
3. 切片を顕微鏡スライド上に載せ、室温で乾燥させ、そして退色防止培地で覆う。
4. 落射蛍光顕微鏡（対物レンズ：10X、NA-0.3; 20X、NA-0.8;および63X、NA-1.4）を用いて画像を取り込む。

結果

亜型AAV9注射部位における有力なトランスジーン発現：
AAV9送達後14日目の脊髄切片における導入遺伝子（GFP）発現の分析は、脊髄実質全体にわたってAAV9用量依存性GFP発現を示した。第1に、上部腰椎腔に注入されたAAV9-UBI-GFPの2回の両側3μL注射は、腰部脊髄全体における白色および灰白質のほぼ完全な感染と関連し、上部胸部セグメントに及んだ...

ディスカッション

現在の研究では、成体マウスにおける腹側ベクター（AAV9）送達の技術が記載されている。付属のビデオで実証されているように、確立され、試験された仕様に従って、必要な器具および穿刺針および胸骨下注射針が適切に製造されるならば、この手法および技法を効果的に使用することができる。

マウスにおける一貫した安全な副作用注射を行う際の重要な技術?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J Mice	Jackson Labs	664
Lab Standard Stereotaxic for Mice	Harvard Apparatus	72-9568
Mouse Spinal Adaptor	Harvard Apparatus	72-4811
XYZ Manipulator	Stoelting	51604
Manual Infusion Pump	Stoelting	51218
34G Beveled Nanofill Needle	World Precision Instruments	NF34BV-2
36G Blunt Nanofill needle	World Precision Instruments	NF-36BL-2
Fluriso, Isoflurane	MWI Veterinary Supply	502017
Chlorhexidine Solution	MWI Veterinary Supply	501027
20G Stainless Steel Needle	Becton-Dickinson	305175
23G Stainless Steel Needle	Becton-Dickinson	305145
30G Stainless Steel Needle	Becton-Dickinson	305128
Cotton Tipped Applicator	MWI Veterinary Supply	27426
Glass Capillary Beveller	Narishige International	SM-25B
Slide Microscope Superfrost	Leica Microsystems	M80
50μl Microsyringe	Hamilton	81242
BD Intramedic PE-20 Tubing	Becton, Dickinson	427406
BD Intramedic PE-10 Tubing	Becton, Dickinson	427401
4-0 monofilament suture	VetOne	V1D397
Glass Capillary Beveller	Narishige	Pipet Micro Grinder EG-40
5 min Epoxy (Epoxy Clear)	Devcon	14310
Euthanasia Solution	MWI Veterinary Supply	11168
Heparin Inj 1000U/mL	MWI Veterinary Supply	54254
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Anti NeuN Antibody	EMD-Millipore	ABN78	Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000
Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody	EMD-Millipore	AB144P	Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100
Anti GFP Antibody	Aves Labs	GFP-1020	Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A21207	Secondary Antibody, 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680	ThermoFisher Scientific	A10043	Secondary Antibody, 1:1000
Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Jackson Immunoresearch Labs	703-545-155	Secondary Antibody, 1:1000
Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647	Abcam	ab150131	Secondary Antibody, 1:1000
Slide Microscope Superfrost	Fisher Scientific	12-550-143
ProLong Gold Antifade Mountant	Fisher Scientific	P36930
Epifluorescence Microscope	Zeiss	Zeiss AxioImager M2
Fluorescence Confocal Microscope	Olympus	Olympus FV1000
Dextran	Polysciences, Inc	19411
AAV9-UBC-GFP	UCSD Viral Vector Core Laboratory