Субпиальный адено-ассоциированный вирус 9 (AAV9) Доставка векселей для взрослых мышей

Резюме

Целью настоящего исследования было разработать и обосновать потенцию и безопасность доставки гена, опосредованного спинным адено-ассоциированным вирусом 9 (AAV9), с использованием новой технологии доставки субпиальных генов у взрослых мышей.

Аннотация

Ранее сообщалось об успешной разработке метода доставки векторов аденоассоциированного вируса 9 (AAV9) у взрослых крыс и свиней. Было продемонстрировано использование субпиализированных полиэтиленовых катетеров (PE-10 или PE-5) для доставки AAV9, продемонстрирована мощная экспрессия трансгена через спинномозговую паренхиму (белое и серое вещество) в субпиально-инъецированных спинномозговых сегментах. Из-за широкого спектра трансгенных мышечных моделей нейродегенеративных заболеваний существует сильное желание разработать мощную систему доставки центральной нервной системы (ЦНС) для взрослых мышей. Соответственно, настоящее исследование описывает развитие устройства для доставки вектора позвоночной линии и метода для обеспечения безопасной и эффективной доставки спинального AAV9 у взрослых мышей C57BL / 6J. У пациентов с иммобилизованными и обезболиваемыми мышами пиама (шейный 1 и поясничный 1-2 спинальный сегментный уровень) была разрезана с помощью острого иглы 34 G с использованием манипулятора XYZ. Второй XYZ maNipulator затем использовали для продвижения тупой иглы 36G в поясничное и / или цервикальное субпиальное пространство. Затем подкожно вводили вектор AAV9 (3-5 мкл, 1,2 х 10 ¹³ геномных копий (gc)), кодирующий зеленый флуоресцентный белок (GFP). После инъекций периодически оценивали неврологическую функцию (моторную и сенсорную), а животных фиксировали перфузией через 14 дней после доставки AAV9 с 4% параформальдегидом. Анализ горизонтальных или поперечных участков спинного мозга показал трансгенную экспрессию по всему спинному мозгу, как в сером, так и в белом веществе. Кроме того, интенсивная ретроградно-опосредованная экспрессия GFP наблюдалась в нисходящих моторных аксонах и нейронах в моторной коре, ядре ruber и formatio reticularis. Никаких неврологических дисфункций не было отмечено у любых животных. Эти данные показывают, что метод доставки субпиальной вектора может успешно использоваться у взрослых мышей, не вызывая травмы спинного мозга, связанные с процедурой, и связан с высокоэффективными трансгенными экспрессиямиВо всей спинальной нейраксии.

Введение

Использование векторов AAV для лечения различных нейродегенеративных заболеваний спинного мозга и ЦНСН становится хорошо принятой платформой для эффективного усиления или молчания экспрессии интересующего гена (генов). Одним из ключевых ограничений для более эффективного использования этой технологии для лечения расстройств ЦНС / спинного мозга является ограниченная способность доставлять вектор (ы) AAV в паренхиму глубокого мозга или спинного мозга у взрослых млекопитающих.

Было продемонстрировано, например, что системная доставка AAV9 у взрослых грызунов, кошек или не-человеческих приматов лишь умеренно эффективна при индуцировании экспрессии трансгена в нейронах головного и спинного мозга ^{1 , 2 , 3} . Было показано, что более эффективная интратекальная доставка векторов AAV9 приводит к только ограниченной экспрессии трансгена в анатомически определенных пулах нейронов. В частности, это были демоныЧто цистернальная или пояснично-крестцовая интратекальная доставка AAV9 у нечеловеческих приматов, свиней или грызунов приводит к высокому уровню экспрессии трансгена в спинальных α-мотонейронах и сегментных нейронах ганглиозного сегментарного дорсального корня. Однако минимальное или отсутствующее выражение в спинальных интернейронах или восходящих или нисходящих аксонах в белом веществе показано ^{4 , 5 , 6 , 7} . В совокупности эти данные показывают, что существует высокоэффективный биологически-анатомический барьер, который предотвращает диффузию интратекально поставленного ААВ в более глубокую спинальную паренхиму.

В предыдущем исследовании, проведенном с использованием взрослых крыс и свиней, была разработана новая методика доставки субпиальных векторов ⁸ . Используя этот подход, сильная и многосегментная экспрессия трансгена была продемонстрирована после однобалочной субпиальной доставки AAV9. Интенсивное выражение GFP постоянно наблюдалосьВ нейронах, глиальных клетках и нисходящих / восходящих аксонах через вводимые спинномозговые сегменты. Это исследование впервые продемонстрировало, что pia mater представляет собой первичный барьер, ограничивающий эффективную диффузию AAV9 в спинальную паренхиму из интратекального пространства. Хотя этот ранее разработанный метод и субпиальное инъекционное устройство относительно просты в использовании у крупных грызунов (например, крыс) или взрослых свиней, система не подходит для использования у мелких животных, таких как взрослые мыши. Из-за большого числа доступных моделей трансгенных мышей различных нейродегенеративных нарушений существует явная потребность в разработке эффективной техники доставки вектора-паренхиматозного вектора у мышей. Доступность такого метода позволила бы изучить влияние специфического подавления генов ( например, с использованием shRNA) или усиление с использованием неспецифических клеток ( например, цитомегаловирус-ЦМВ или Ubiquitin) или клеточно-специфических ( например, синапсина или глиальных Фибриллярная кислаяБелка (GFAP)) в раннем послеродовом развитии или в больных условиях.

Соответственно, в настоящем исследовании мы разработали и подтвердили систему миниатюрной субпиальной векторной доставки, которая может эффективно использоваться у взрослых мышей. Аналогично, как и в предыдущих исследованиях крыс и свиней, эта работа демонстрирует мощную трансгенную экспрессию во всей спинномозговой паренхиме после однобалочной субпиальной доставки AAV9 у мышей. Простота этого подхода, очень хорошая переносимость вводимых мышей к субпиальной доставке AAV9 и высокая эффективность экспрессии трансгена в спинномозговой паренхиме позволяют предположить, что этот метод можно эффективно реализовать в любой лабораторной обстановке и использовать в экспериментах, нацеленных на экспрессию спинного гена.

протокол

Эти исследования проводились в соответствии с протоколом, одобренным Институтом по уходу за животными и его использованием в Калифорнийском университете в Сан-Диего, и отвечали рекомендациям Ассоциации по оценке лабораторных рекомендаций по уходу за животными для животных. Все исследования проводились таким образом, чтобы минимизировать размер группы и страдания животных.

1. Общая подготовка животных и хирургии

1. Перед началом хирургической процедуры оттереть вирус (AAV9-UBI-GFP, 5 мкл аликвот) ⁸ . Подготовьте 5% раствор декстрана (10 000 МВт) путем смешивания порошка декстрана в дистиллированной воде. Смешать раствор вируса с 5% раствором декстрана 1: 1 до конечной концентрации декстрана 2,5%.
   1. Храните раствор вируса на льду (4 ° C).
2. Используйте взрослые мыши C57BL / 6J (мужчины и женщины, 20-30 г). Анестезируйте мышей с использованием 5% изофлурана (в O ₂ , 1 л / мин) и поддерживайте их при 2-3% вдыхаемого изофлурана (в O ₂ , 1 л / мин) носовым конусом во время операции, в зависимости от частоты дыхания и ответа на щепотку лапы.
3. Бритья спины животных с помощью стрижки для стрижки и очистить кожу 2% хлоргексидина.
4. При хронических исследованиях восстановления придерживаются строгой стерильной техники.
5. Если необходимо провести поясничные субпиальные инъекции, разрежьте кожу, наложив на позвонки Th8-L1 скальпелем и отсоедините паравертебральную мышцу от позвонков позвонков Th10-12, используя ножницы.
   1. Установите животное в стандартную стереотаксическую рамку с помощью мышечных зажимов.
   2. Потяните обе стороны пластинки позвонков Th10-12, используя зубную дрель (сверло: 0,9 мм, скорость: 20000 об / мин) до появления трещин.
   3. Удалите растрескивающиеся фрагменты кости с помощью щипцов и выставить дорсальную поверхность поясничного спинного мозга.
   4. Отрежьте твердую поверхность около 1 см, используя иглу из нержавеющей стали 30 г и щипцы.
6. Если необходимо провести инъекции шейки матки, вырежьте спинную шею 1,5-2 см с помощью ножниц и выведите сегменты C1-C2.
   1. Удалите атланто-затылочную мембрану цистерны магна, используя иглу из нержавеющей стали 23G и щипцы.
   2. Очистите участок разреза любого тряпочного и костного обломков с помощью ватных тампонов.
   3. Отрежьте трубу около 2-3 мм, используя иглу из нержавеющей стали 30 г и щипцы.

2. Открытие мембранной мембраны и установка подпиальной иглы для доставки AAV9

1. Вставьте пробивную иглу 34 G в Z-образную рукоятку манипулятора XYZ, используя стеклянный капиллярный держатель ( рис. 1A и B ).
   ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы изготовить иглу для пианинга, исходный скошенный наконечник иглы 34G затачивается с помощью стеклянного капиллярного сковорода с алмазной абразивной пластиной - грубых (размеры наконечника от 5,0 до 50 мкм) и угла измельчения15 - 20 °. Кончик иглы (длина 1 мм, измеренный от наконечника) затем осторожно согнут примерно до 90 ° ( рис. 1В , левая вставка).
2. Используя область хирургического рассечения, установите 8-10-кратное увеличение, пронизывайте пиа с помощью пион-проникающей иглы примерно на 1 мм ( рис. 1C ) с помощью X-arm.
   1. Держите угол проникающей иглы на поверхности ткани при 5-10 °.
3. После открытия пии выньте иглу для пианинга горизонтально из подпиального пространства ( рисунок 1 D), используя X-образную рукоятку.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Помните пронзительный сайт с помощью ориентира, такого как кровеносный сосуд.
4. Загрузите тупую иглу 36G для инъекций с вирусом AAV9-UBI-GFP, используя микролизер, содержащий 50 мкл, подключенный к инъекционной игле с помощью трубки PE-10 или PE-20.
5. Установите иглу в Z-плечо второго манипулятора XYZ ( рисунок 1A и B ) с использованием стеклянного капиллярного держателя ( рисунок 1B , правая вставка).
   ПРИМЕЧАНИЕ. Для изготовления субпиальной инъекционной иглы AAV9 тупой наконечник иглы 36 G полируется с использованием стеклянного капиллярного сковорода с алмазно-абразивной пластиной - крупнозернистой (от 5,0 до 50 мкм) для удаления острых кромок. Кончик иглы (длина 2-3 мм, измеренный от наконечника) затем мягко согнут до 90 °. Пиля-проникающие и подпиальные иглы для инъекций вставляются в трубку из нержавеющей стали длиной 20 см длиной 20 см (10 мм от конца иглы) и склеены эпоксидной смолой. Для надежного крепления к стеклянному капиллярному держателю требуется использование трубки диаметром 20 G (0,91 мм).
6. Управляя стрелками X, Y и Z второго манипулятора, поместите кончик инъекционной иглы AAV9 в участок, покрытый пиаром, а затем продвиньте его примерно на 2-3 мм в пространство подпила через предыдущее отверстие для пузырьковой мембраны, используя X-рука( Рис. 1Е и F ).
   ПРИМЕЧАНИЕ. 1) AAV9-UBI-GFP готовят в соответствии с ранее сообщенными протоколами ^{9 , 10} , а конечные титры регулируют до 1,2 × 10 ¹³ копий генома на мл (г / мл). 2) Нет необходимости отмечать сайт открытия сообщения, поскольку он легко идентифицируется ( рисунок 1D ).
7. Внесите AAV9-UBI-GFP (1,5, 3 или 5 мкл) в субпиальное пространство с помощью микролизера 50 мкл (см. Таблицу 1 для экспериментальных групп).
8. Удалите инъекционную иглу из субпиального пространства после завершения инъекции AAV9-UBI-GFP.
9. Закройте мышцы и кожу, используя 4,1 монофиламентный шов и хирургические зажимы.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Нет необходимости закрывать открытый позвонок.
10. Разрешить животным восстанавливаться на нагревательной подушке.
11. Для контроля боли вводят бупренорфин 0,05 мг / кг / ш каждые 12 ч дляЧерез 2-3 дня после операции.

3. Перфузионная фиксация, тканевая криозащита и иммунофлуоресцентное окрашивание

1. В заданный момент времени после подпиальных инъекций AAV9 глубоко обезболивают мышей раствором эвтаназии (см. Таблицу материалов , 0,3 мл) и транскрипционно перфузируют их 20 мл гепаринизированного физиологического раствора, а затем 20 мл 4% параформальдегида в PBS.
2. Рассеивайте спинномозговые шнуры и мозги с помощью костного рога и фиксируйте их в 4% формальдегиде в PBS в течение ночи при 4 ° C.
3. Криозащита спинного мозга и мозгов с 30% сахарозы в PBS в течение минимум 5-7 дней.
4. Вырезать корональные, поперечные или продольные / горизонтальные замороженные секции (толщиной 30 мкм) на криостате и хранить их в PBS при 4 ° C.

4. Иммунофлуоресцентное окрашивание спинного мозга и разделов мозга (см. Таблицу материалов)

1. Инкубировать свободно плавающие участки в примареY антител в течение ночи.
2. После инкубации с первичными антителами промыть секции три раза в PBS и инкубировать с люминесцентными конъюгированными ослиными анти-кроличьими, ослиными анти-куриными и осликовыми антителами против козиса.
3. Смонтируйте секции на горках микроскопа, высушите их при комнатной температуре и накройте их анти-затухающей средой.
4. Захват изображений с использованием эпифлуоресцентного флуоресцентного микроскопа (цели: 10X, NA-0,3; 20X, NA-0,8 и 63X, NA-1,4).

Результаты

Сильное трансгенное выражение в субпиально AAV9-инъекциях Сегменты:
Анализ экспрессии трансгена (GFP) в отделах спинного мозга через 14 дней после доставки AAV9 показал экспрессию GFP, зависимую от AAV9, по всей спинномозговой паренхиме. Во-первых, две двусторон...

Обсуждение

В настоящем исследовании описывается методика доставки субпиальных векторов (AAV9) у взрослых мышей. Как показано в сопроводительном видео, этот подход и техника могут быть эффективно использованы при условии, что необходимые инструменты и пиа-проникающая игла и субпиальная инъекционн...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J Mice	Jackson Labs	664
Lab Standard Stereotaxic for Mice	Harvard Apparatus	72-9568
Mouse Spinal Adaptor	Harvard Apparatus	72-4811
XYZ Manipulator	Stoelting	51604
Manual Infusion Pump	Stoelting	51218
34G Beveled Nanofill Needle	World Precision Instruments	NF34BV-2
36G Blunt Nanofill needle	World Precision Instruments	NF-36BL-2
Fluriso, Isoflurane	MWI Veterinary Supply	502017
Chlorhexidine Solution	MWI Veterinary Supply	501027
20G Stainless Steel Needle	Becton-Dickinson	305175
23G Stainless Steel Needle	Becton-Dickinson	305145
30G Stainless Steel Needle	Becton-Dickinson	305128
Cotton Tipped Applicator	MWI Veterinary Supply	27426
Glass Capillary Beveller	Narishige International	SM-25B
Slide Microscope Superfrost	Leica Microsystems	M80
50μl Microsyringe	Hamilton	81242
BD Intramedic PE-20 Tubing	Becton, Dickinson	427406
BD Intramedic PE-10 Tubing	Becton, Dickinson	427401
4-0 monofilament suture	VetOne	V1D397
Glass Capillary Beveller	Narishige	Pipet Micro Grinder EG-40
5 min Epoxy (Epoxy Clear)	Devcon	14310
Euthanasia Solution	MWI Veterinary Supply	11168
Heparin Inj 1000U/mL	MWI Veterinary Supply	54254
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Anti NeuN Antibody	EMD-Millipore	ABN78	Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000
Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody	EMD-Millipore	AB144P	Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100
Anti GFP Antibody	Aves Labs	GFP-1020	Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A21207	Secondary Antibody, 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680	ThermoFisher Scientific	A10043	Secondary Antibody, 1:1000
Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Jackson Immunoresearch Labs	703-545-155	Secondary Antibody, 1:1000
Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647	Abcam	ab150131	Secondary Antibody, 1:1000
Slide Microscope Superfrost	Fisher Scientific	12-550-143
ProLong Gold Antifade Mountant	Fisher Scientific	P36930
Epifluorescence Microscope	Zeiss	Zeiss AxioImager M2
Fluorescence Confocal Microscope	Olympus	Olympus FV1000
Dextran	Polysciences, Inc	19411
AAV9-UBC-GFP	UCSD Viral Vector Core Laboratory