La livraison de vecteur 9 (AAV9) associée au virus Adeno-Associé Subpial (AAV9) chez les souris adultes

Résumé

L'objectif de la présente étude était de développer et de valider la puissance et la sécurité de la délivrance de gènes médiés par le virus 9 associé à l'adéno-lésion spinale (AAV9) en utilisant une nouvelle technique de délivrance de gène subpial chez des souris adultes.

Résumé

Le développement réussi d'une technique de délivrance de vecteur de virus adéno-associé subpial 9 (AAV9) chez des rats et des cochons adultes a été signalé précédemment. En utilisant des cathéters en polyéthylène (PE-10 ou PE-5) placés sous le point de vue de l'AAV9, on a démontré une expression efficace du transgène à travers le parenchyme rachidien (matière blanche et grise) dans les segments de la colonne vertébrale injectés subtilement. En raison de la vaste gamme de modèles de souris transgéniques de maladies neurodégénératives, il existe un fort désir de développer une technique de transfert de vecteur cible ciblée du système nerveux central puissant (SIC) chez des souris adultes. En conséquence, la présente étude décrit le développement d'un dispositif de délivrance de vecteur sous-viral de la colonne vertébrale et d'une technique permettant une délivrance sûre et efficace d'AAV9 de la colonne vertébrale chez des souris adultes C57BL / 6J. Chez les souris épieillées et anesthésiées, la pia-mère (cervical 1 et le segment segmentaire lombaire 1-2) a été incisé avec une aiguille pointue de 34 G en utilisant un manipulateur XYZ. Une deuxième XYZ maLe nipulateur a ensuite été utilisé pour avancer une aiguille 36G émoussée dans l'espace sous-espace lombaire et / ou cervical. Le vecteur AAV9 (3-5 μL; 1,2 x 10 ¹³ copies du génome (gc)) codant pour la protéine fluorescente verte (GFP) a ensuite été injecté subtilement. Après les injections, la fonction neurologique (moteur et sensorielle) a été évaluée périodiquement, et les animaux ont été fixés par perfusion 14 jours après la délivrance d'AAV9 avec du paraformaldéhyde à 4%. L'analyse des sections de la moelle épinière horizontale ou transversale a montré une expression du transgène dans toute la moelle épinière, tant en matière grise que blanche. De plus, une expression intense de GFP récidiviste a été observée dans les axones moteurs et les neurones descendants dans le cortex moteur, le noyau nucléaire et la formatio reticularis. Aucun dysfonctionnement neurologique n'a été noté chez aucun animal. Ces données montrent que la technique de délivrance du vecteur sous-viral peut être utilisée avec succès chez la souris adulte, sans causer de lésions de la moelle épinière liée à la procédure, et est associée à un transgène très efficacePendant tout le neuraxis rachidien.

Introduction

L'utilisation de vecteurs d'AAV pour traiter une variété de troubles neurodégénératifs de la moelle épinière et du SNC devient une plate-forme bien acceptée pour réguler efficacement ou faire taire l'expression des gènes d'intérêt. L'une des principales limites à l'utilisation plus efficace de cette technologie pour traiter les troubles du SNC et de la moelle épinière est la capacité limitée de délivrer un vecteur (s) d'AAV au cerveau profond ou au parenchyme de la moelle épinière chez les mammifères adultes.

Il a été démontré, par exemple, que la distribution systémique d'AAV9 chez les rongeurs adultes, les chats ou les primates non humains n'est que modérément efficace pour induire l'expression du transgène dans les neurones du cerveau et de la moelle épinière ^{1 , 2 , 3} . La délivrance intrathécale plus efficace des vecteurs AAV9 a également montré qu'il ne conduisait qu'à une expression limitée du transgène dans des pools de neurones anatomiquement définis. Plus précisément, ce sont des démonsQue l'administration d'AAV9 intracellulaire cisternal ou lumbo-sacré chez des primates, des porcs ou des rongeurs non humains conduit à un niveau élevé d'expression du transgène dans les motoneurones α-spinales et les neurones ganglionnaires de la racine dorsale segmentaire. Cependant, une expression minimale ou nulle des interneurones de la colonne vertébrale ou des axones ascendants ou descendants dans la matière blanche est vue ^{4 , 5 , 6 , 7} . Collectivement, ces données montrent qu'une barrière biologique-anatomique hautement efficace existe, ce qui empêche la diffusion d'AAV délivré par voie intrathécale dans un parenchyme rachidien plus profond.

Dans une étude antérieure portant sur des rats adultes et des porcs, une nouvelle technique de transmission de vecteur subfaire a été développée ⁸ . À l'aide de cette approche, une expression du transgène hautement efficace et multi-segmentaire a été démontrée après une administration de l'AAV9 subpial à un seul bolus. Une expression intensive des GFP a été constamment observéeDans les neurones, les cellules gliales et les axones descendants / ascendants à travers les segments de la colonne vertébrale injectés. Cette étude a démontré pour la première fois que la pia-mère représente la principale barrière limitant la diffusion efficace d'AAV9 dans le parenchyme rachidien de l'espace intrathécal. Bien que cette technique développée précédemment et son dispositif d'injection subpial soit relativement facile à utiliser chez les grands rongeurs (comme les rats) ou les cochons adultes, le système ne convient pas aux petits animaux, comme les souris adultes. En raison du nombre élevé de modèles de souris transgéniques disponibles d'une variété de troubles neurodégénératifs, il existe un besoin évident de développement d'une technique de délivrance de vecteur spinale parenchymateuse efficace chez la souris. La disponibilité d'une telle technique permettrait d'étudier l'effet d'un inhibition spécifique des gènes ( p. Ex., En utilisant l'ARNm) ou une régulation positive en utilisant des cellules non spécifiques ( p. Ex. Cytomégalovirus-CMV ou ubiquitine) ou spécifiques de cellules ( p. Ex ., Synapsine ou gliale Acide fibrillaireProtéines (GFAP)) pendant le développement post-natal tôt ou dans des conditions malades.

En conséquence, dans la présente étude, nous avons développé et validé un système miniature de distribution de vecteurs subtiles qui peut être utilisé efficacement chez la souris adulte. De même, comme dans les études antérieures sur le rat et le porc, ce travail démontre une expression puissante du transgène dans tout le parenchyme rachidien après une délivrance de l'AAV9 subpial à bol unique chez la souris. La simplicité de cette approche, la très bonne tolérance des souris injectées à la transmission de l'AAV9 subpériale et la forte puissance de l'expression du transgène dans le parenchyme de la colonne vertébrale suggèrent que cette technique peut être mise en œuvre efficacement dans n'importe quel milieu de laboratoire et utilisée dans des expériences ciblant l'expression des gènes rachidiens.

Protocole

Ces études ont été réalisées dans le cadre d'un protocole approuvé par le comité institutionnel pour les soins et l'utilisation des animaux de l'Université de Californie, à San Diego, et étaient conformes à l'Association pour l'évaluation des directives sur les soins de l'animal de laboratoire à des fins animales. Toutes les études ont été effectuées de manière à minimiser la taille du groupe et la souffrance des animaux.

1. Préparation générale des animaux et de la chirurgie

1. Avant de commencer la procédure chirurgicale, décongeler le virus (AAV9-UBI-GFP, 5 μl d'aliquotes) ⁸ . Préparez une solution à 5% de dextrane (10 000 MW) en mélangeant de la poudre de dextrane dans de l'eau distillée. Mélangez la solution de virus avec une solution de dextrane à 1% 1: 1 jusqu'à une concentration finale en dextrane de 2,5%.
   1. Stocker la solution de virus sur de la glace (4 ° C).
2. Utiliser des souris adultes C57BL / 6J (hommes et femmes, 20 à 30 g). Anesthésier les souris en utilisant 5% d'isoflurane (en O ₂ , 1 L / min) et les maintenir à 2-3% d'isoflurane inhalé (en O ₂ , 1 L / min) par le cône du nez pendant la chirurgie, selon le taux de respiration et la réponse au pincement des pattes.
3. Raser le dos des animaux avec des tondeuses à raser et nettoyer la peau avec 2% de chlorhexidine.
4. Dans les études de récupération chronique, suivre une technique stérile stricte.
5. Si des injections subpiales lombaires doivent être effectuées, couper la peau en recouvrant les vertèbres Th8-L1 avec un scalpel et détacher le muscle paravertébral des vertèbres rachidiennes Th10-12 à l'aide de ciseaux.
   1. Monter l'animal dans un cadre stéréotaxique standard en utilisant des pinces de la colonne vertébrale de la souris.
   2. Raser les deux côtés de la lame de la vertèbre Th10-12 à l'aide d'une perceuse dentaire (foret: 0,9 mm, vitesse: 20 000 tr / min) jusqu'à ce que les fissures apparaissent.
   3. Enlevez les fragments d'os craqués avec une pince et exposez la surface dorsale de la moelle épinière.
   4. Couper l'ouverture d'environ 1 cm à l'aide d'une aiguille en acier inoxydable 30 G et d'une pince.
6. Si des injections subpiennes cervicales doivent être effectuées, inciser la peau du cou dorsal 1,5-2 cm à l'aide de ciseaux et exposer les segments C1-C2.
   1. Retirez la membrane atlanto-occipitale de la cisterna magna à l'aide d'une aiguille en acier inoxydable 23G et d'une pince.
   2. Nettoyer le site d'incision de tout débris tissulaire et osseux à l'aide de coton-tige.
   3. Couper l'estrat d'environ 2-3 mm à l'aide d'une aiguille en acier inoxydable 30 G et d'une pince.

2. Ouverture de la Membrane Pial et insertion de l'aiguille Subpial pour livraison AAV9

1. Montez l'aiguille pénétrante pia de 34 G dans le bras Z d'un manipulateur XYZ à l'aide d'un support capillaire en verre ( Figure 1A et B ).
   REMARQUE: Pour fabriquer l'aiguille pia-pénétrante, l'extrémité chanfreinée originale de l'aiguille 34G est aiguisée à l'aide d'un biseau capillaire en verre avec une plaque abrasive en diamant - grossière (tailles de 0,5 μm à 50 μm) et un angle de meulage de15 - 20 °. La pointe de l'aiguille (1 mm de longueur, mesurée à partir de la pointe) est ensuite doucement pliée à environ 90 ° ( Figure 1B , insert gauche).
2. En utilisant une portée de dissection chirurgicale, réglée à un grossissement 8-10 X, pénétrer la pia avec l'aiguille pia-pénétrant d'environ 1 mm ( Figure 1C ) en utilisant le bras X.
   1. Garder l'angle de l'aiguille pénétrante sur la surface du tissu à 5-10 °.
3. Après l'ouverture de la pia, retirez l'aiguille pia-pénétrante à l'horizontale de l'espace sous-espace ( Figure 1 D) à l'aide du bras X.
   REMARQUE: Rappelez-vous le site pénétré par un repère, tel qu'un vaisseau sanguin.
4. Chargez une aiguille d'injection 36G émoussée avec le virus AAV9-UBI-GFP en utilisant une micro-jambe de 50 μL reliée à l'aiguille d'injection avec des tubes PE-10 ou PE-20.
5. Montez l'aiguille dans le bras Z d'un deuxième manipulateur XYZ ( Figure 1A et B ) à l'aide d'un support capillaire en verre ( Figure 1B , insert droit).
   REMARQUE: Pour fabriquer l'aiguille d'injection subafficelle AAV9, la pointe émoussée d'une aiguille 36 G est polie à l'aide d'un biseau capillaire en verre avec plaque abrasive en diamant - grossière (tailles de 0,5 μm à 50 μm) pour enlever les bords tranchants. La pointe de l'aiguille (2-3 mm de longueur, mesurée à partir de la pointe) est ensuite pliée doucement à environ 90 °. Les aiguilles d'injection pia-pénétrantes et subpériales sont insérées dans un tube en acier inoxydable esclave 20G de 2 cm de long (10 mm de l'extrémité de l'aiguille) et collées avec de l'époxy. L'utilisation d'un tube de 20 G (0,91 mm de diamètre) est requise pour une fixation sécurisée au support capillaire en verre.
6. En manipulant les bras X, Y et Z du deuxième manipulateur, positionnez l'extrémité de l'aiguille d'injection AAV9 dans le site pia-pénétré, puis avancez-le environ 2-3 mm dans l'espace sous-espace à travers l'ouverture précédente de la membrane par le biais de la X-bras( Figure 1E et F ).
   NOTE: 1) L'AAV9-UBI-GFP est préparé selon les protocoles ^{9 , 10} précédemment rapportés, et les titres finaux sont ajustés à 1,2 x 10 ¹³ copies du génome par ml (gc / mL). 2) Il n'est pas nécessaire de marquer le site de l'ouverture du pial car il est facilement identifiable ( Figure 1D ).
7. Injecter l'AAV9-UBI-GFP (1.5, 3 ou 5 μL) dans l'espace sub-dépistage à l'aide d'une micro-jambage de 50 μL (voir tableau 1 pour les groupes expérimentaux).
8. Retirez l'aiguille d'injection de l'espace sous-espace après l'achèvement de l'injection AAV9-UBI-GFP.
9. Fermez le muscle et la peau à l'aide de sutures de monofilaments 4.0 et de clips chirurgicaux.
   REMARQUE: Il n'est pas nécessaire de sceller la vertèbre ouverte.
10. Permettre aux animaux de récupérer sur un coussin chauffant.
11. Pour le contrôle de la douleur injecter Buprénorphine 0,05 mg / kg / sc toutes les 12 h pour2-3 jours après la chirurgie.

3. La fixation par perfusion, la cryoprotection tissulaire et la coloration par immunofluorescence

1. A un point de temps prédéterminé après les injections subatiles d'AAV9, anesthésier profondément les souris avec une solution d'euthanasie (voir la Table des matériaux , 0,3 mL) et les perfuser transcardialement avec 20 ml de solution salée héparinée suivie de 20 ml de paraformaldéhyde à 4% dans du PBS.
2. Dissectionnez les cordes et le cerveau de la moelle épinière à l'aide d'un rongeur osseux et postez-les dans du formaldéhyde à 4% dans du PBS pendant une nuit à 4 ° C.
3. Cryoproteger les cordes épineuses et le cerveau avec 30% de saccharose dans du PBS pendant au moins 5 à 7 jours.
4. Couper les sections congelées coronales, transversales ou longitudinales / horizontales (30 μm d'épaisseur) sur un cryostat et les stocker dans du PBS à 4 ° C.

4. Immunofluorescence Coloration des sections de la moelle épinière et du cerveau (voir la table des matières)

1. Incuber les sections flottantes en primaireY pendant toute la nuit.
2. Après incubation avec des anticorps primaires, laver les sections trois fois dans du PBS et incuber avec des anticorps anti-lapin anti-lapin, anti-poulet et anti-chèvre anti-poulet et anti-poulet conjugués à la fluorescence.
3. Montez les sections sur les lames de microscopie, séchez-les à température ambiante et recouvrez-les avec un milieu anti-décoloré.
4. Capturez des images à l'aide d'un microscope à fluorescence à épifluorescence (objectifs: 10X, NA-0.3; 20X, NA-0.8 et 63X, NA-1.4).

Résultats

Expression transgénique efficace dans les segments Subpially AAV9-injectés:
L'analyse de l'expression du transgène (GFP) dans les sections de la moelle épinière à 14 jours après l'accouchement de l'AAV9 a montré une expression de la GFP dépendante de la dose AAV9 tout au long du parenchyme de la colonne vertébrale. Tout d'abord, deux injections bilatérales de 3 μL d'AAV9-UBI-GFP injectées dans l'espace subpial lombair...

Discussion

L'étude actuelle décrit une technique de délivrance de vecteur subpial (AAV9) chez des souris adultes. Comme cela a été démontré dans la vidéo qui l'accompagne, cette approche et cette technique peuvent être utilisées efficacement, à condition que les instruments requis et l'aiguille pia-penetrante et l'aiguille d'injection subpienne soient correctement fabriquées, conformément aux spécifications établies et testées.

Variables techniques critiques ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J Mice	Jackson Labs	664
Lab Standard Stereotaxic for Mice	Harvard Apparatus	72-9568
Mouse Spinal Adaptor	Harvard Apparatus	72-4811
XYZ Manipulator	Stoelting	51604
Manual Infusion Pump	Stoelting	51218
34G Beveled Nanofill Needle	World Precision Instruments	NF34BV-2
36G Blunt Nanofill needle	World Precision Instruments	NF-36BL-2
Fluriso, Isoflurane	MWI Veterinary Supply	502017
Chlorhexidine Solution	MWI Veterinary Supply	501027
20G Stainless Steel Needle	Becton-Dickinson	305175
23G Stainless Steel Needle	Becton-Dickinson	305145
30G Stainless Steel Needle	Becton-Dickinson	305128
Cotton Tipped Applicator	MWI Veterinary Supply	27426
Glass Capillary Beveller	Narishige International	SM-25B
Slide Microscope Superfrost	Leica Microsystems	M80
50μl Microsyringe	Hamilton	81242
BD Intramedic PE-20 Tubing	Becton, Dickinson	427406
BD Intramedic PE-10 Tubing	Becton, Dickinson	427401
4-0 monofilament suture	VetOne	V1D397
Glass Capillary Beveller	Narishige	Pipet Micro Grinder EG-40
5 min Epoxy (Epoxy Clear)	Devcon	14310
Euthanasia Solution	MWI Veterinary Supply	11168
Heparin Inj 1000U/mL	MWI Veterinary Supply	54254
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Anti NeuN Antibody	EMD-Millipore	ABN78	Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000
Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody	EMD-Millipore	AB144P	Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100
Anti GFP Antibody	Aves Labs	GFP-1020	Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A21207	Secondary Antibody, 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680	ThermoFisher Scientific	A10043	Secondary Antibody, 1:1000
Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Jackson Immunoresearch Labs	703-545-155	Secondary Antibody, 1:1000
Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647	Abcam	ab150131	Secondary Antibody, 1:1000
Slide Microscope Superfrost	Fisher Scientific	12-550-143
ProLong Gold Antifade Mountant	Fisher Scientific	P36930
Epifluorescence Microscope	Zeiss	Zeiss AxioImager M2
Fluorescence Confocal Microscope	Olympus	Olympus FV1000
Dextran	Polysciences, Inc	19411
AAV9-UBC-GFP	UCSD Viral Vector Core Laboratory