Subnial Adeno הקשורים וירוסים 9 (AAV9) וקטור משלוח ב עכברים למבוגרים

Summary

מטרת המחקר הנוכחי הייתה לפתח ולאמת את העוצמה והבטיחות של נגיף השד הקשור ל- Adeno-9 (AAV9), באמצעות שימוש בטכניקה חדשה של מתן גנים תת-גנטי בעכברים בוגרים.

Abstract

פיתוח מוצלח של וירוס adpo המשויך וירוס 9 (AAV9) טכניקת משלוח וקטור ב עכברים בוגרים וחזירים כבר דיווחו בעבר. באמצעות צנתרים פוליאתילן ממוקמים subpially (PE-10 או PE-5) עבור משלוח AAV9, ביטוי transgene עוצמה דרך parenchyma השדרה (חומר לבן ואפור) ב subpially מוזרק קטעי השדרה הוכח. בשל מגוון רחב של מודלים עכבר מהונדס של מחלות נוירודגנרטיב, יש רצון עז בפיתוח של מערכת העצבים המרכזית המרכזית (CNS), ממוקד טכניקת משלוח וקטור בעכברים בוגרים. בהתאם לכך, המחקר הנוכחי מתאר את התפתחותו של המכשיר השולחני וקטורית מתן וקטור וטכניקה כדי לאפשר בטוח ויעיל משלוח AAV9 בעמוד השדרה C57BL בוגרים / 6J. ב spinally משותקת ו הרדמה עכברים, pia mater (צוואר הרחם 1 ו המותני 1-2 השדרה מקטע השדרה) היה חתוך עם מחט 34 G חד באמצעות מניפולטור XYZ. שנייה XYZ MANipulator שימש אז כדי לקדם מחט בוטה 36G לתוך המותניים ו / או שטח תת-עורקי. וקטור AAV9 (3-5 μL, 1.2 x 10 ¹³ עותקים הגנום (gc)) קידוד חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) הוזרק אז subpially. לאחר זריקות, תפקוד נוירולוגי (מוטורי וחושני) הוערך מעת לעת, ובעלי חיים היו זלוף קבוע 14 ימים לאחר משלוח AAV9 עם paraformaldehyde 4%. ניתוח של חלקי חוט שדרה אופקיים או רוחביים הראה ביטוי transgene לאורך חוט השדרה כולו, בחומר אפור ולבן. בנוסף, ביטוי retrogradely בתיווך GFP בתיווך נתפס ב אקסונים מנוע נופל יורד נוירונים בקליפת המוח, גרעין ruber, ו formatio reticularis. לא נצפתה שום תפקוד נוירולוגי אצל בעלי חיים. נתונים אלה מראים כי טכניקת העברת הווקטוריה התת-קרקעית יכולה לשמש בהצלחה בעכברים בוגרים, מבלי לגרום לפגיעה בחוט השדרה הקשורה לפרוצדורה, והיא קשורה לתגובות טרנסגניות חזקותSion לאורך neuraxis השדרה.

Introduction

השימוש של וקטורים AAV לטפל במגוון של חוט השדרה והפרעות העצבים המרכזית CNS הופכת פלטפורמה היטב קיבל ביעילות upregulate או להשתיק את הביטוי של הגן (ים) של עניין. אחת המגבלות העיקריות לניצול יעיל יותר של טכנולוגיה זו לטיפול במחלות חוט השדרה (CNS) / עמוד השדרה היא היכולת המוגבלת לספק וקטור AAV למוח העמוק או לחוט השדרה אצל יונקים מבוגרים.

זה הוכח, למשל, כי המסירה המערכתי של AAV9 במכרסמים, חתולים או פרימטים לא אנושיים היא רק די מתונה בהפיכת ביטוי טרנסג'ן בנוירונים במוח ובחוט השדרה ^{1 , 2 , 3} . משלוח intrathecal יעיל יותר של וקטורים AAV9 הוכח גם להוביל ביטוי transgene מוגבל בבריכות מוגדרים אנטומית של נוירונים. ליתר דיוק, זה היה שדיםTrated כי cisternal או lumbo-sacral intrathecal AAV9 משלוח ב primates שאינם אנושיים, חזירים, או מכרסמים מוביל לרמה גבוהה של ביטוי transgene מוטורי α-motoneurons ו נוירונים הגזע השורש הגבי. עם זאת, ביטוי מינימלי או ללא inintereurons בעמוד השדרה או אקסונים עולה או יורד החומר הלבן הוא ראה ^{4 , 5 , 6 , 7} . באופן קולקטיבי, נתונים אלה מראים כי קיים מחסום ביולוגי-אנטומי יעיל ביותר, המונע דיפוזיה של AAV נמסר תוך כדי לתוך פרנכימה בעמוד השדרה עמוק יותר.

במחקר קודם באמצעות חולדות בוגרות וחזירים, טכניקת משלוח וקטור subpial רומן פותחה ^8. באמצעות גישה זו, ביטוי רב עוצמה transgene רב פלחי הודגמה לאחר משלוח בולוס יחיד AAV9 subfial. ביטוי GFP אינטנסיבי נראה בעקביותב נוירונים, תאים גליה, ואת אקסונים עולה / עולה דרך מקטעים השדרה מוזרק. מחקר זה הוכיח לראשונה כי pia mater מייצג את המכשול העיקרי הגבלת AAV9 דיפוזיה יעילה לתוך parenchyma השדרה מהחלל intrathecal. בעוד טכניקה זו שפותחה בעבר והתקן הזרקה subpial הוא יחסית קל לשימוש מכרסמים גדולים (כמו חולדות) או חזירים מבוגרים, המערכת אינה מתאימה לשימוש בבעלי חיים קטנים, כגון עכברים בוגרים. בגלל המספר הגבוה של דגמי עכבר מהונדס זמין של מגוון של הפרעות ניווניות, יש צורך ברור לפיתוח של טכניקת העברת וקטור parenchymal השדרה יעיל בעכברים. הזמינות של טכניקה כזו תאפשר את המחקר של ההשפעה של השתקה גנים ספציפיים ( למשל, באמצעות shRNA) או upregulation באמצעות תא שאינו ספציפי ( למשל, cytomegalovirus-CMV או Ubiquitin) או תא ספציפי ( למשל, סינפסה או glial חומצי פיברילריחלבון (GFAP)) היזמים במהלך התפתחות מוקדמת לאחר הלידה או תחת מצבים חולים.

בהתאם לכך, במחקר הנוכחי, פיתחנו ואמתנו מערכת מינימלית של משלוח וקטור תת-מיני, שניתן להשתמש בה ביעילות בעכברים בוגרים. באופן דומה, כמו מחקרים קודמים חולדה חזיר, עבודה זו מוכיח ביטוי transgene עוצמה לאורך פרנכימה בעמוד השדרה לאחר משלוח בולוס יחיד AAV9 subpial בעכברים. הפשטות של גישה זו, את הסבילות טוב מאוד של הזריקו עכברים לאספקה ​​AAV9 subpial, ואת העוצמה הגבוהה של ביטוי transgene ב parenchyma השדרה מרמזים כי טכניקה זו יכולה למעשה להיות מיושם בכל הגדרה במעבדה ומשמש בניסויים מיקוד ביטוי הגן השדרה.

Protocol

מחקרים אלה בוצעו על פי פרוטוקול שאושר על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש של אוניברסיטת קליפורניה, סן דייגו ועמדו בקנה אחד עם האגודה להערכת הנחיות מעבדה טיפול בבעלי חיים לשימוש בבעלי חיים. כל המחקרים נעשו באופן שמטרתו למזער את גודל הקבוצה וסבל בעלי החיים.

1. כללי הכנה חיה וכירורגי

1. לפני תחילת הליך כירורגי, להפשיר את הנגיף (AAV9-UBI-GFP, 5 aliquots μL) ⁸ . הכן 5% dextran (10,000 MW) פתרון על ידי ערבוב אבקת dextran במים מזוקקים. מערבבים את פתרון וירוסים עם פתרון 5% dextran 1: 1 לריכוז dextran הסופי של 2.5%.
   1. חנות הפתרון וירוס על הקרח (4 ° C).
2. השתמש C57BL למבוגרים עכברים 6J (זכר ונקבה, 20-30 גרם). להרדים את העכברים באמצעות 5% isoflurane (ב O ₂ , 1 L / min) ולשמור אותם 23% ishlurane בשאיפה (ב O ₂ , 1 L / min) על ידי חרוט האף במהלך הניתוח, בהתאם קצב הנשימה ואת התגובה צביטה כפות.
3. לגלח את הגב של החיות עם קוצץ גילוח לנקות את העור עם chlorhexidine 2%.
4. במחקרים התאוששות כרונית בצע טכניקה סטרילית קפדנית.
5. אם זריקות תחתונות מותני הם להתבצע, לחתוך את העור המכסה את חוליות Th8-L1 עם איזמל לנתק את השריר parvertebral מ חוליות עמוד השדרה Th10-12 באמצעות מספריים.
   1. הר החיה למסגרת stereotaxic סטנדרטי באמצעות מלחצי השדרה העכבר.
   2. לגלח את שני הצדדים של lamina של חוליות Th10-12 באמצעות מקדחה שיניים (מקדחה: 0.9 מ"מ, מהירות: 20,000 סל"ד) עד סדקים להופיע.
   3. הסר שברי עצם סדוק עם מלקחיים לחשוף את פני הגבי של חוט השדרה המותני.
   4. לחתוך את הדורה על 1 ס"מ באמצעות מחט 30 G נירוסטה מלקחיים.
6. אם זריקות subpial צוואר הרחם הם להתבצע, לחתוך את העור הצוואר הגב 1.5-2 ס"מ באמצעות מספריים לחשוף את הקטעים C1-C2.
   1. הסר את הממברנה atlanto-occitital של cisterna מגנה באמצעות מחט נירוסטה 23G ו מלקחיים.
   2. נקו את אתר החתך של כל רקמות ופסולת עצם באמצעות צמר גפן.
   3. לחתוך את הדורה על 2-3 מ"מ באמצעות מחט 30 G נירוסטה מלקחיים.

2. פתיחת קרום Pial והכנסת מחט תת-קרקעית עבור משלוח AAV9

1. הר 34 G מחט חודר מחט לתוך זרוע Z של מניפולטור XYZ באמצעות מחזיק נימי זכוכית ( איור 1A ו- B ).
   הערה: כדי לייצר את המחט חודר פיה, קצה משופע המקורי של מחט 34G הוא חידד באמצעות beveller נימי זכוכית עם צלחת שוחקים יהלום - גס (5.0 מיקרומטר עד 50 מיקרומטר עצה הגדלים) וזווית שחיקה של15 - 20 °. קצה המחט (1 מ"מ אורך, נמדד מהקצה) הוא כפוף בעדינות אז על 90 מעלות ( איור 1B , הכנס שמאל).
2. באמצעות היקף ניתוח כירורגי, מוגדר הגדלה 8-10 X, לחדור פיא עם מחט חודר פיה על ידי 1 מ"מ ( איור 1C ) באמצעות X- זרוע.
   1. שמור את הזווית של המחט חודר אל משטח רקמות 5-10 מעלות.
3. לאחר פתיחת הפיה, להסיר את המחט חודר פיה אופקית מן החלל תת-קרקעית ( איור 1 ד ') באמצעות X- הזרוע.
   הערה: זכור את האתר החודר על ידי ציון דרך, כגון כלי דם.
4. טען מחט הזרקת 36G קהה עם AAV9-UBI-GFP וירוס באמצעות microsyringe 50 μL מחובר המחט הזרקת עם PE-10 או PE-20 צינורות.
5. הר את המחט לתוך זרוע Z של מניפולטור XYZ השני ( איור 1 א ו- B ) באמצעות מחזיק זכוכית נימי ( איור 1 ב , להוסיף ימין).
   הערה: כדי לייצר את מחט הזריקה AAV9 subpial, קצה קהה של מחט G 36 מלוטש באמצעות beveller נימי זכוכית עם צלחת שוחקים יהלום - גס (5.0 מיקרומטר עד 50 מיקרומטר עצה הגדלים) כדי להסיר את הקצוות החדים. קצה המחט (2-3 מ"מ אורך, נמדד מהקצה) הוא אז כפוף בעדינות על 90 מעלות. מחט הזרקת פיא ומחט הזרקת מוחדר לתוך 1-2 ס"מ אורך 20G שפופרת נירוסטה צינורות (10 מ"מ מקצה המחט) מודבק אפוקסי. השימוש של 20 G (0.91 מ"מ קוטר) צינורות נדרש עבור מצורף מאובטח על הזכוכית נימי בעל.
6. על ידי מניפולציה של X, Y, ו- Z זרועות של מניפולטור השני, למקם את קצה המחט הזרקת AAV9 לתוך האתר חודר פיא ולאחר מכן לקדם אותו על 2-3 מ"מ לתוך החלל מתחת לסף דרך פתח קרום pial הקודם באמצעות זרוע X( איור 1E ו F ).
   הערה: 1) AAV9-UBI-GFP מוכן על פי פרוטוקולים שפורסמו בעבר ^{9 , 10} , ואת titers הסופי מותאמים 1.2 x 10 ¹³ עותקים הגנום לכל מ"ל (gc / mL). 2) אין צורך לסמן את האתר של פתיחת pial כי זה מזוהה בקלות ( איור 1D ).
7. להזריק את AAV9-UBI-GFP (1.5, 3, או 5 μL) לתוך שטח subpial באמצעות microsyringe 50 μL (ראה טבלה 1 עבור קבוצות ניסיוניות).
8. הסר את המחט הזרקת מהחלל subpial לאחר הזרקת AAV9-UBI-GFP הוא שלם.
9. סגור את השרירים ואת העור באמצעות תפר monofilament 4.0 ו קליפים כירורגיים.
   הערה: אין צורך לאטום את החוליה הפתוחה.
10. אפשר החיות להתאושש על כרית חימום.
11. עבור בקרת כאב להזריק Buprenorphine 0.05 מ"ג / ק"ג / sc כל 12 שעות עבור2-3 ימים לאחר הניתוח.

3. קיבוע-זלוף, רקמות Cryoprotection, מכתים Immunofluorescence

1. בנקודת זמן קבועה מראש לאחר זריקות AAV9 subpial, להרדים עמוק את העכברים עם פתרון המתת חסד (ראה טבלה של חומרים , 0.3 מ"ל) ו transcardially perfuse אותם עם 20 מ"ל של מלח מלוחים ולאחר מכן 20 מ"ל של paraformaldehyde 4% PBS.
2. לנתח את חוט השדרה ואת המוח באמצעות רונגול עצם שלאחר לתקן אותם פורמלדהיד 4% PBS לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
3. Cryoprotect את מיתרי השדרה ואת המוח עם סוכרוז 30% PBS עבור מינימום של 5-7 ימים.
4. חותכים את העטרה העטרה, או רוחביים / אופקיים חלקים קפואים (30 מיקרומטר עבה) על cryostat ולאחסן אותם PBS ב 4 ° C.

4. מכתים Immunofluorescence של עמוד השדרה ואת המוח חלקים (ראה טבלה של חומרים)

1. דגירה חופשית קטעי צף פרימארנוגדנים בין לילה.
2. לאחר הדגירה עם נוגדנים ראשוניים, לשטוף את המדורים שלוש פעמים PBS ו לדגור עם ארנבת פלואורסצנטי נגד חמור ארנב, חמור נגד עוף, וחמור אנטי עזים נוגדנים משני.
3. הר את החלקים על שקופיות מיקרוסקופ, יבש אותם בטמפרטורת החדר, ולכסות אותם עם בינוני נגד דהייה.
4. לכידת תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי epifluorescence (מטרות: 10X, NA-0.3, 20X, NA-0.8; ו 63X, NA-1.4).

תוצאות

ביטוי טרנסג'ני חזק ב- AAV9 מוזרק:
ניתוח של ביטוי transgene (GFP) בקטעי חוט השדרה ב 14 ימים לאחר משלוח AAV9 הראה AAV9- מינון ביטוי GFP תלוי בכל parenchyma השדרה. ראשית, שתי זריקות דו צדדיות 3 μL של AAV9-UBI-GFP מוזרק לתוך החלל התחתון התחתון המותני היו קשורים עם זי...

Discussion

המחקר הנוכחי מתאר טכניקה של משלוח וקטורי (AAV9) במבוגרים עכברים. כפי שמוצג בסרטון הנלווה, ניתן להשתמש בגישה זו ובטכניקה זו באופן יעיל, בתנאי שהמכשירים הדרושים והמחט החודרת ומחט הזריקה התת - קרקעית מיוצרים כראוי, בהתאם למפרטים שנקבעו ונבדקו.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J Mice	Jackson Labs	664
Lab Standard Stereotaxic for Mice	Harvard Apparatus	72-9568
Mouse Spinal Adaptor	Harvard Apparatus	72-4811
XYZ Manipulator	Stoelting	51604
Manual Infusion Pump	Stoelting	51218
34G Beveled Nanofill Needle	World Precision Instruments	NF34BV-2
36G Blunt Nanofill needle	World Precision Instruments	NF-36BL-2
Fluriso, Isoflurane	MWI Veterinary Supply	502017
Chlorhexidine Solution	MWI Veterinary Supply	501027
20G Stainless Steel Needle	Becton-Dickinson	305175
23G Stainless Steel Needle	Becton-Dickinson	305145
30G Stainless Steel Needle	Becton-Dickinson	305128
Cotton Tipped Applicator	MWI Veterinary Supply	27426
Glass Capillary Beveller	Narishige International	SM-25B
Slide Microscope Superfrost	Leica Microsystems	M80
50μl Microsyringe	Hamilton	81242
BD Intramedic PE-20 Tubing	Becton, Dickinson	427406
BD Intramedic PE-10 Tubing	Becton, Dickinson	427401
4-0 monofilament suture	VetOne	V1D397
Glass Capillary Beveller	Narishige	Pipet Micro Grinder EG-40
5 min Epoxy (Epoxy Clear)	Devcon	14310
Euthanasia Solution	MWI Veterinary Supply	11168
Heparin Inj 1000U/mL	MWI Veterinary Supply	54254
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Anti NeuN Antibody	EMD-Millipore	ABN78	Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000
Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody	EMD-Millipore	AB144P	Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100
Anti GFP Antibody	Aves Labs	GFP-1020	Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A21207	Secondary Antibody, 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680	ThermoFisher Scientific	A10043	Secondary Antibody, 1:1000
Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Jackson Immunoresearch Labs	703-545-155	Secondary Antibody, 1:1000
Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647	Abcam	ab150131	Secondary Antibody, 1:1000
Slide Microscope Superfrost	Fisher Scientific	12-550-143
ProLong Gold Antifade Mountant	Fisher Scientific	P36930
Epifluorescence Microscope	Zeiss	Zeiss AxioImager M2
Fluorescence Confocal Microscope	Olympus	Olympus FV1000
Dextran	Polysciences, Inc	19411
AAV9-UBC-GFP	UCSD Viral Vector Core Laboratory