在成年小鼠中的亚型腺相关病毒9（AAV9）载体递送

摘要

本研究的目的是通过在成年小鼠中使用新的唾液基因传递技术来开发和验证脊髓腺相关病毒9（AAV9）介导的基因递送的效力和安全性。

摘要

已经报道了在成年大鼠和猪中成功开发涎腺腺相关病毒9（AAV9）载体递送技术。已经证明使用低位放置的聚乙烯导管（PE-10或PE-5）用于AAV9递送，通过脊髓实质（白色和灰色物质）在低水平注射的脊髓节段中的有效转基因表达。由于神经变性疾病的转基因小鼠模型的广泛范围，强烈希望在成年小鼠中发展有效的中枢神经系统（CNS） - 靶向载体递送技术。因此，本研究描述了在成年C57BL / 6J小鼠中开发脊髓辅助载体递送装置和技术以允许安全和有效的脊髓AAV9递送。在脊髓固定和麻醉的小鼠中，使用XYZ操纵器用尖锐的34G针切开皮肤（颈部1和腰部1-2脊柱节段水平）。第二个XYZ马然后使用咬合器将平坦的36G针推进到腰部和/或颈部的腋下空间中。然后，首先注射编码绿色荧光蛋白（GFP）的AAV9载体（3-5μL; 1.2×10 ^13个基因组拷贝（gc））。注射后，定期评估神经功能（运动和感觉），动物在用4％多聚甲醛递送AAV9后14天灌注固定。水平或横向脊髓切片的分析显示在整个脊髓中的转基因表达，包括灰色和白色物质。此外，在运动皮层，细胞核和网状细胞的下降的运动轴突和神经元中观察到强烈的逆行介导的GFP表达。任何动物均未观察到神经功能障碍。这些数据表明，唾液腺向量传递技术可以成功地用于成年小鼠，而不会引起与程序相关的脊髓损伤，并且与高效转基因表达有关整个脊髓神经轴突。

引言

使用AAV载体治疗各种脊髓和CNS神经退行性疾病正在成为一个被广泛接受的平台，可有效地上调或沉默感兴趣的基因的表达。更有效地利用该技术治疗CNS /脊髓障碍的关键限制之一是将AAV载体递送到成年哺乳动物的深部脑或脊髓实质的能力有限。

据证实，例如，AAV9的成年啮齿动物，猫，或非人灵长类动物的全身性递送是在脑和脊髓^1，2，3个神经元诱导转基因表达仅适度有效。 AAV9载体更有效的鞘内输送也已显示导致在解剖学定义的神经元池中只有有限的转基因表达。更具体地说，它已经是恶魔认为在非人灵长类动物，猪或啮齿动物中的顺式或骶 - 囊性鞘内AAV9传递导致脊髓α运动神经元和节段背根神经节神经元中高水平的转基因表达。然而，在脊柱的interneurons或升序或在白质下行轴突最小的或没有表达看到^{4个 ，5，6，7。}总的来说，这些数据表明，存在高度有效的生物解剖屏障，其防止鞘内递送的AAV扩散进入更深的脊髓实质。

在以前使用成年大鼠和猪的研究中，开发了一种新型的唾液腺载体递送技术⁸ 。使用这种方法，在单次推荐的subpial AAV9递送后证明了高效和多节段的转基因表达。一贯看到强烈的GFP表达在神经元，神经胶质细胞和下降/上升的轴突通过注射的脊髓段。这项研究首次表明，该皮肤表现出限制从鞘内空间扩散到脊髓实质的有效AAV9的主要障碍。虽然这种先前开发的技术和亚型注射装置相对容易在大型啮齿动物（如大鼠）或成年猪中使用，但该系统不适合用于小型动物，例如成年小鼠。由于各种神经变性疾病的可用转基因小鼠模型的数量很多，所以显然需要在小鼠中发展有效的脊髓实质载体递送技术。这种技术的可用性将允许研究特异性基因沉默（ 例如，使用shRNA）或使用细胞非特异性（ 例如巨细胞病毒-CNV或泛素）或细胞特异性（ 例如，突触素或胶质细胞）的上调的作用纤维酸性蛋白质（GFAP））启动子。

因此，在本研究中，我们开发和验证了一种可以有效地用于成年小鼠的微型载体递送系统。类似地，如在以前的大鼠和猪研究中，这项工作在小鼠中单次推注AAV9单次递送后，证明在整个脊髓实质中有力的转基因表达。这种方法的简单性，注射的小鼠对于亚临床AAV9递送的非常好的耐受性以及脊髓实质中转基因表达的高效力表明该技术可以在任何实验室设置中有效地实施并用于靶向脊髓基因表达的实验中。

研究方案

这些研究是根据加利福尼亚大学圣地亚哥分校动物保健和使用委员会批准的方案进行的，并符合动物实验动物保护评估指南。所有研究都以使组大小和动物痛苦最小化的方式进行。

一般动物和手术准备

1. 开始外科手术之前，解冻病毒（AAV9-UBI-GFP;5μL等分试样） ⁸ 。通过将葡聚糖粉末在蒸馏水中混合，制备5％葡聚糖（10,000 MW）溶液。将病毒溶液与1％的5％葡聚糖溶液混合至2.5％的最终葡聚糖浓度。
   1. 将病毒溶液储存在冰上（4℃）。
2. 使用成年C57BL / 6J小鼠（雄性和雌性，20-30克）。麻醉小鼠使用5％异氟烷（O _2，1 L / min），并保持在2-3％吸入异氟烷（O _2，1 L / min）由手术中的鼻锥，取决于呼吸频率和爪夹紧响应。
3. 用剃须刀剃刮动物的背部，并用2％氯己定清洁皮肤。
4. 在慢性恢复研究中遵循严格的无菌技术。
5. 如果要进行腰椎间盘注射，用手术刀切开覆盖Th8-L1椎骨的皮肤，并用剪刀从Th10-12脊椎椎骨上分离椎旁肌。
   1. 使用鼠标脊柱夹将动物装入标准立体定位框架。
   2. 使用牙钻（钻头:0.9mm，速度:20,000rpm）刮掉Th10-12椎骨椎板的两侧，直到出现裂缝。
   3. 用镊子去除破裂的骨碎片，暴露脊髓背脊表面。
   4. 使用30 G不锈钢针和镊子切开硬脑膜约1厘米。
6. 如果要进行子宫颈腋下注射，使用剪刀将背部颈部皮肤切开1.5-2厘米，并暴露C1-C2段。
   1. 使用23G不锈钢针头和镊子取出大the the to膜。
   2. 使用棉签清洁任何组织和骨碎片的切口部位。
   3. 使用30 G不锈钢针和镊子将硬膜切开约2-3毫米。

2.打开瓣膜并插入AAV9交付的腋下针

1. 使用玻璃毛细管支架将34 G穿刺针插入XYZ操纵器的Z形臂（ 图1A和B ）。
   注意:为了制造穿透针，使用具有金刚石研磨板的玻璃毛细管斜面（粗糙（5.0μm至50μm尖端尺寸））和34G针尖的原始斜角尖端磨削角度15 - 20°。然后将针的尖端（1mm长度，从尖端测量）轻轻地弯曲到约90°（ 图1B ，左插入物）。
2. 使用外科手术解剖范围，设置为8-10 X放大倍数，使用X型手臂将穿刺针穿透皮瓣约1 mm（ 图1C ）。
   1. 将穿刺针的角度保持在5-10°的组织表面。
3. 皮瓣打开后，使用X型手臂将ia穿刺针从水平空间（ 图 1D）水平取出。
   注意:记住由地标（例如血管）穿透的部位。
4. 使用与PE-10或PE-20管连接到注射针的50μL微量注射器，装入带有AAV9-UBI-GFP病毒的钝性36G注射针头。
5. 将针安装到第二XYZ操纵器的Z形臂上（ 图1A 和B ）使用玻璃毛细管支架（ 图1B ，右插入）。
   注意:为了制造亚型AAV9注射针，使用具有金刚石研磨板的玻璃毛细管斜面（粗糙（5.0μm至50μm尖端尺寸））抛光36 G针头的钝头，以去除尖锐边缘。然后将针的尖端（2-3mm长度，从尖端测量）轻轻弯曲至约90°。将穿刺和腋下注射针插入1-2厘米长的20G从属不锈钢管（距针头10毫米）并用环氧胶粘。需要使用20 G（0.91 mm直径）的管道，以确保与玻璃毛细管支架的连接。
6. 通过操纵第二操纵器的X，Y和Z臂，将AAV9注射针的尖端定位到穿刺部位，然后通过先前的膜片开口将其推进到约2-3mm的唾液空间中，使用X臂（ 图1E和F ）。
   注:1）AAV9-UBI-GFP是根据先前报道的协议^9，10中制备，并最终滴度每mL（GC /毫升）调节至1.2×10 ¹³个基因组拷贝。 2）由于容易识别，所以不需要标记小开口的位置（ 图1D ）。
7. 使用50μL微量注射器将AAV9-UBI-GFP（1.5,3或5μL）注入涎腺空间（参见实验组的表1 ）。
8. 在完成AAV9-UBI-GFP注射后，从唾液空间中取出注射针。
9. 使用4.0单丝缝合线和手术夹将肌肉和皮肤关闭。
   注意:没有必要密封开放的椎骨。
10. 让动物在加热垫上恢复。
11. 对于疼痛控制，每12小时注射丁丙诺啡0.05 mg / kg / sc术后2-3天

3.灌注固定，组织低温保护和免疫荧光染色

1. 在AAV9次注射后的预定时间点，用安乐死溶液深度麻醉小鼠（参见材料表 ，0.3mL），并用20mL肝素化盐水随后用20mL的4％多聚甲醛PBS溶液灌注。
2. 使用骨骨折解剖脊髓和脑，并在4℃下将其固定在4％甲醛的PBS中过夜。
3. 用30％蔗糖在PBS中冷冻保护脊髓和大脑至少5-7天。
4. 在低温恒温器上切割冠状，横向或纵向/横向冷冻切片（30μm厚），并将其储存在4°C的PBS中。

4.脊髓和脑切片的免疫荧光染色（参见材料表）

1. 孵化自由浮动部分在初级y抗体过夜。
2. 与初级抗体孵育后，在PBS中洗涤切片三次，并与荧光结合的驴抗兔，驴抗鸡和驴抗山羊二抗孵育。
3. 将显微镜载玻片放置在室温下干燥，并用抗褪色培养基覆盖。
4. 使用荧光荧光显微镜（目标:10X，NA-0.3; 20X，NA-0.8;和63X，NA-1.4）捕获图像。

结果

亚型AAV9注射片段中强有力的转基因表达:
在AAV9递送14天后脊髓切片中转基因（GFP）表达的分析显示整个脊髓实质中具有AAV9-剂量依赖性GFP表达。首先，注射到上腰椎间质空间中的两次双侧3μL注射AAV9-UBI-GFP与全部腰脊髓中白色和灰质的近完全感染相关，延伸至上胸段（ 图2A和2B ，左列和中间列）。两只双侧1.5μL注射AA...

讨论

目前的研究描述了一种在成年小鼠中的辅助载体（AAV9）递送技术。如所附视频所示，该方法和技术可以有效地被使用，只要根据既定和测试的规格，正确地制造所需的仪器和穿刺针和腋下注射针。

在小鼠中进行一致和安全的唾液注射的关键技术变量:
如所证明的，在背侧颈椎或腰椎板切除术后，可以在成年麻醉的小鼠中容易地进行支气管注射。有几个关键?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J Mice	Jackson Labs	664
Lab Standard Stereotaxic for Mice	Harvard Apparatus	72-9568
Mouse Spinal Adaptor	Harvard Apparatus	72-4811
XYZ Manipulator	Stoelting	51604
Manual Infusion Pump	Stoelting	51218
34G Beveled Nanofill Needle	World Precision Instruments	NF34BV-2
36G Blunt Nanofill needle	World Precision Instruments	NF-36BL-2
Fluriso, Isoflurane	MWI Veterinary Supply	502017
Chlorhexidine Solution	MWI Veterinary Supply	501027
20G Stainless Steel Needle	Becton-Dickinson	305175
23G Stainless Steel Needle	Becton-Dickinson	305145
30G Stainless Steel Needle	Becton-Dickinson	305128
Cotton Tipped Applicator	MWI Veterinary Supply	27426
Glass Capillary Beveller	Narishige International	SM-25B
Slide Microscope Superfrost	Leica Microsystems	M80
50μl Microsyringe	Hamilton	81242
BD Intramedic PE-20 Tubing	Becton, Dickinson	427406
BD Intramedic PE-10 Tubing	Becton, Dickinson	427401
4-0 monofilament suture	VetOne	V1D397
Glass Capillary Beveller	Narishige	Pipet Micro Grinder EG-40
5 min Epoxy (Epoxy Clear)	Devcon	14310
Euthanasia Solution	MWI Veterinary Supply	11168
Heparin Inj 1000U/mL	MWI Veterinary Supply	54254
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Anti NeuN Antibody	EMD-Millipore	ABN78	Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000
Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody	EMD-Millipore	AB144P	Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100
Anti GFP Antibody	Aves Labs	GFP-1020	Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A21207	Secondary Antibody, 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680	ThermoFisher Scientific	A10043	Secondary Antibody, 1:1000
Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Jackson Immunoresearch Labs	703-545-155	Secondary Antibody, 1:1000
Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647	Abcam	ab150131	Secondary Antibody, 1:1000
Slide Microscope Superfrost	Fisher Scientific	12-550-143
ProLong Gold Antifade Mountant	Fisher Scientific	P36930
Epifluorescence Microscope	Zeiss	Zeiss AxioImager M2
Fluorescence Confocal Microscope	Olympus	Olympus FV1000
Dextran	Polysciences, Inc	19411
AAV9-UBC-GFP	UCSD Viral Vector Core Laboratory