Vedação subjugada Adeno-associada do vírus 9 (AAV9) em ratos adultos

Resumo

O objetivo do presente estudo foi desenvolver e validar a potência e a segurança da entrega de genes mediada pelo vírus adeno-associado à coluna vertebral (AAV9) usando uma nova técnica de entrega de genes subpial em camundongos adultos.

Resumo

O desenvolvimento bem-sucedido de uma técnica de entrega do vetor de adeno-associado subpial 9 (AAV9) em ratos adultos e porcos foi relatado anteriormente. Utilizando cateteres de polietileno colocados subpialmente (PE-10 ou PE-5) para a entrega de AAV9, demonstrou-se uma expressão potente do transgene através do parênquima espinhal (substância branca e cinzenta) em segmentos espinhais injetados subpialmente. Devido à ampla gama de modelos de ratos transgênicos de doenças neurodegenerativas, há um forte desejo pelo desenvolvimento de uma técnica de entrega de vetor segmentado do sistema nervoso central potente (SNC) em camundongos adultos. Consequentemente, o presente estudo descreve o desenvolvimento de um dispositivo de entrega de vetor subpial da coluna vertebral e técnica para permitir a administração segura e eficaz de AAV9 espinhal em ratos C57BL / 6J adultos. Nos ratinhos imobilizados e anestesiados, o pia mater (nível cervical 1 e segmentar 1-2) foi inciso com uma agulha afiada de 34 G usando um manipulador XYZ. Um segundo XYZ maO nipulador foi então usado para avançar uma agulha 36G brusca no espaço subpial lombar e / ou cervical. O vetor AAV9 (3-5 μL; 1,2 x 10 ¹³ cópias do genoma (gc)) que codificam a proteína fluorescente verde (GFP) foi então injetado subpialmente. Após as injeções, a função neurológica (motor e sensorial) foi avaliada periodicamente, e os animais foram fixados por perfusão 14 dias após a administração de AAV9 com paraformaldeído a 4%. A análise das seções da corda espinal horizontal ou transversal mostrou expressão do transgene em toda a medula espinhal, tanto em matéria cinza quanto em substância branca. Além disso, observou-se uma intensa expressão de GFP mediada por retrogradabilidade nos axônios motores descendentes e nos neurônios no córtex motor, no núcleo e na formatio reticular. Não foi observada nenhuma disfunção neurológica em nenhum animal. Esses dados mostram que a técnica de entrega do vetor subpial pode ser usada com sucesso em camundongos adultos, sem causar lesão da medula espinhal relacionada ao procedimento, e está associada a expressões de transgênese altamente potentesDurante toda a neuraxis da coluna vertebral.

Introdução

O uso de vetores de AAV para tratar uma variedade de distúrbios neurodegenerativos da medula espinhal e do SNC está se tornando uma plataforma bem aceita para efetivamente aumentar ou silenciar a expressão dos genes de interesse. Uma das principais limitações para a utilização mais efetiva desta tecnologia para o tratamento de distúrbios do SNC / medula espinhal é a capacidade limitada de fornecer vetores AAV para o cérebro profundo ou parênquima da medula espinhal em mamíferos adultos.

Foi demonstrado, por exemplo, que a distribuição sistêmica de AAV9 em roedores adultos, gatos ou primatas não humanos é apenas moderadamente eficaz para induzir a expressão do transgene nos neurônios do cérebro e da medula espinhal ^{1 , 2 , 3} . A administração intratecal mais efetiva de vetores AAV9 também mostrou que leva a apenas expressão limitada de transgenes em conjuntos de neurônios anatomicamente definidos. Mais especificamente, tem sido demôniosQue o fornecimento de AAV9 intracelular cisterno ou lumbo-sacral em primatas, porcos ou roedores não humanos leva a um alto nível de expressão do transgene nos motoneurônios α da espinha e neurônios ganglionares da raça dorsal segmentar. No entanto, observa-se uma expressão mínima ou nenhuma em interneurônios espinhais ou axônios ascendentes ou descendentes na matéria branca ^{4 , 5 , 6 , 7} . Coletivamente, esses dados mostram que existe uma barreira biológico-anatômica altamente efetiva, o que impede a difusão do AAV entregue por via intratéfica no parênquima espinhal mais profundo.

Em um estudo anterior, utilizando ratos e porcos adultos, desenvolveu-se uma nova técnica de entrega de vetor subpial ⁸ . Ao usar essa abordagem, a expressão de transgene altamente potente e multi-segmentar foi demonstrada após uma entrega de AAV9 subpial de bolus único. A expressão GFP intensa foi consistentemente vistaNos neurônios, células gliais e axônios descendentes / ascendentes através dos segmentos espinhais injetados. Este estudo demonstrou pela primeira vez que a pia mater representa a barreira principal que limita a difusão efetiva de AAV9 no parênquima espinhal do espaço intratecal. Embora esta técnica previamente desenvolvida e o dispositivo de injeção subpial sejam relativamente fáceis de usar em roedores grandes (como ratos) ou porcos adultos, o sistema não é adequado para uso em animais pequenos, como ratos adultos. Devido ao elevado número de modelos de ratos transgênicos disponíveis de uma variedade de distúrbios neurodegenerativos, existe uma necessidade clara de desenvolvimento de uma técnica efetiva de parto espinhal parenquimatoso em camundongos. A disponibilidade de tal técnica permitiria o estudo do efeito de silenciamento de genes específicos ( por exemplo, usando shRNA) ou upregulation usando células não específicas ( por exemplo, citomegalovírus-CMV ou Ubiquitin) ou específicas de células ( por exemplo, sinapsina ou glial Ácido fibrilarProteína (GFAP)) durante o desenvolvimento pós-natal inicial ou em condições doentes.

Conseqüentemente, no presente estudo, desenvolvemos e validamos um sistema de entrega de vetor subpial em miniatura que pode ser efetivamente usado em camundongos adultos. Da mesma forma, como em estudos anteriores de ratos e porcos, este trabalho demonstra uma expressão de transgênese potente ao longo do parênquima espinhal após uma entrega de AAV9 subpial de bolus único em camundongos. A simplicidade desta abordagem, a tolerabilidade muito boa dos ratos injetados à entrega de AAV9 subpial e a alta potência da expressão do transgene no parênquima espinal sugerem que esta técnica pode efetivamente ser implementada em qualquer configuração de laboratório e utilizada em experimentos visando a expressão do gene espinhal.

Protocolo

Esses estudos foram realizados sob um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal da Universidade da Califórnia, em San Diego, e estavam em conformidade com a Associação para Avaliação de diretrizes de Cuidados com animais de laboratório para uso em animais. Todos os estudos foram realizados de forma a minimizar o tamanho do grupo e o sofrimento dos animais.

1. Preparação geral de animais e cirurgiões

1. Antes de iniciar o procedimento cirúrgico, descongelar o vírus (AAV9-UBI-GFP, alíquotas de 5 μL) ⁸ . Prepare uma solução de 5% de dextrano (10 000 MW), misturando pó de dextrano em água destilada. Misture a solução de vírus com 5% de solução de dextrano 1: 1 até uma concentração final de dextrano de 2,5%.
   1. Armazene a solução de vírus em gelo (4 ° C).
2. Use ratos adultos C57BL / 6J (macho e fêmea, 20-30 g). Anestesiar os ratos usando 5% de isoflurano (em O ₂ , 1 L / min) e mantê-los aos 2-3% de isoflurano inalado (em O ₂ , 1 L / min) pelo cone do nariz durante a cirurgia, dependendo da taxa de respiração e da resposta da pitada da pata.
3. Raspar a parte de trás dos animais com cortadores de barbear e limpar a pele com 2% de clorhexidina.
4. Nos estudos de recuperação crônica, segue uma técnica estéril rigorosa.
5. Se as injeções subpiais lombares devem ser realizadas, corte a pele sobrepondo as vértebras Th8-L1 com um bisturi e separe o músculo paravertebral das vértebras espinhais Th10-12 usando uma tesoura.
   1. Monte o animal em uma armação estereotáxica padrão usando pinças espinhal de rato.
   2. Raspar os dois lados da lâmina das vértebras Th10-12 usando uma broca dental (broca: 0,9 mm, velocidade: 20,000 rpm) até aparecerem fissuras.
   3. Remova fragmentos de ossos rachados com fórceps e exponha a superfície dorsal da medula espinal lombar.
   4. Corte a duraçao de aproximadamente 1 cm usando uma agulha de aço inoxidável de 30 G e fórceps.
6. Se forem realizadas injeções subpiais cervicais, incise a pele do pescoço dorsal 1.5-2 cm usando tesoura e exponha os segmentos C1-C2.
   1. Remova a membrana atlanto-occipital da cisterna magna usando uma agulha de aço inoxidável 23G e fórceps.
   2. Limpe o local da incisão de qualquer tecido e detritos ósseos usando cotonetes de algodão.
   3. Corte a duraçao dura aproximadamente 2-3 mm usando uma agulha de aço inoxidável de 30 G e fórceps.

2. Abrindo a Membrana Pial e Inserindo a Agulha Subpial para AAV9 Delivery

1. Monte a agulha penetrante de 34 G no braço Z de um manipulador XYZ usando um suporte capilar de vidro ( Figura 1A e B ).
   NOTA: Para fabricar a agulha pia-penetrante, a ponta chanfrada original da agulha 34G é afiada usando um beveller capilar de vidro com placa abrasiva de diamante - grossa (tamanhos de ponta de 5,0 μm a 50 μm) e ângulo de moagem de15 - 20 °. A ponta da agulha (comprimento de 1 mm, medida a partir da ponta) é então dobrada suavemente para cerca de 90 ° ( Figura 1B , inserção esquerda).
2. Usando um escopo de dissecção cirúrgica, ajustado para ampliação 8-10 X, penetre a pia com a agulha penetrante pia em cerca de 1 mm ( Figura 1C ) usando o X-braço.
   1. Mantenha o ângulo da agulha penetrante na superfície do tecido a 5-10 °.
3. Após a abertura da pia, remova horizontalmente a agulha pia do espaço subpial ( Figura 1 D) usando o braço X.
   NOTA: Lembre-se do site penetrado por um marco, como um vaso sanguíneo.
4. Coloque uma agulha de injeção 36G com vírus AAV9-UBI-GFP utilizando uma micro-fenda de 50 μL conectada à agulha de injeção com tubos PE-10 ou PE-20.
5. Monte a agulha no braço Z de um segundo manipulador XYZ ( Figura 1A e B ) usando um suporte capilar de vidro ( Figura 1B , inserção direita).
   NOTA: Para fabricar a agulha de injeção subaural AAV9, a ponta sem corte de uma agulha 36 G é polida usando um beveller capilar de vidro com placa abrasiva de diamante - grosso (tamanhos de ponta de 5,0 μm a 50 μm) para remover as bordas afiadas. A ponta da agulha (2-3 mm de comprimento, medida a partir da ponta) é então dobrada suavemente para cerca de 90 °. As agulhas de injeção pia-penetrantes e subpiais são inseridas em tubos de aço inoxidável escravo 20G de 2 cm de comprimento (10 mm da extremidade da agulha) e colados com epóxi. O uso de tubos de 20 G (0,91 mm de diâmetro) é necessário para uma fixação segura ao suporte capilar de vidro.
6. Ao manipular os braços X, Y e Z do segundo manipulador, posicione a ponta da agulha de injeção AAV9 no local pia-penetrado e avance-o cerca de 2-3 mm para dentro do espaço subpial através da abertura anterior da membrana do pial usando o X-braço( Figura 1E e F ).
   NOTA: 1) O AAV9-UBI-GFP é preparado de acordo com os protocolos ^{9 , 10} , previamente relatados, e os títulos finais são ajustados para 1,2 x 10 ¹³ cópias do genoma por mL (gc / mL). 2) Não há necessidade de marcar o site da abertura do pial porque é facilmente identificável ( Figura 1D ).
7. Injecte o AAV9-UBI-GFP (1,5, 3 ou 5 μL) no espaço subpial usando uma micro-microfira de 50 μL (ver Tabela 1 para grupos experimentais).
8. Remova a agulha de injeção do espaço subpial depois que a injeção de AAV9-UBI-GFP estiver completa.
9. Feche o músculo e a pele usando sutura monofilamento 4.0 e clipes cirúrgicos.
   NOTA: Não é necessário selar a vértebra aberta.
10. Permitir que os animais se recuperem em uma almofada de aquecimento.
11. Para o controle da dor, injete Buprenorfina 0,05 mg / kg / sc a cada 12 h para2-3 dias após a cirurgia.

3. Fixação por perfusão, crioproteção de tecido e coloração por imunofluorescência

1. Em um ponto de tempo predeterminado após as injeções de AAV9 subpial, anestesiar profundamente os camundongos com solução de eutanásia (ver Tabela de Materiais , 0,3 mL) e perfundir transcardialmente com 20 mL de solução salina heparinizada seguida de 20 mL de paraformaldeído a 4% em PBS.
2. Dissecar as cordas espinhais e os cérebros usando um rongeur ósseo e depois corrigi-los em 4% de formaldeído em PBS durante a noite a 4 ° C.
3. Cryoprotect as cordas espinhais e os cérebros com 30% de sacarose em PBS por um período mínimo de 5-7 dias.
4. Cortar secções congeladas coronal, transversal ou longitudinal / horizontal (30 μm de espessura) em um criostato e armazená-las em PBS a 4 ° C.

4. Coloração por imunofluorescência das secções da medula espinhal e do cérebro (ver tabela de materiais)

1. Incubar secções flutuantes em primarAnticorpos durante a noite.
2. Após a incubação com anticorpos primários, lave as secções três vezes em PBS e incuba com anticorpos secundários anti-coelho, burro anti-frango e burro anti-cabra conjugados com fluorescência.
3. Montar as seções em lâminas de microscopia, secá-las à temperatura ambiente e cobri-las com um meio anti-fade.
4. Capture imagens usando microscópio de fluorescência de epifluorescência (objetivos: 10X, NA-0.3; 20X, NA-0.8 e 63X, NA-1.4).

Resultados

Expressão Transgene Potente em Subpialmente Segmentos Injetados com AAV9:
A análise da expressão de transgene (GFP) nas secções da medula espinhal aos 14 dias após a administração de AAV9 apresentou expressão de GFP dependente de AAV9 ao longo do parênquima espinhal. Primeiro, duas injeções bilaterais de 3 μL de AAV9-UBI-GFP injetadas no espaço subpial lombar superior foram associadas à infecção quase completa da matéria branca e cinzenta e...

Discussão

O presente estudo descreve uma técnica de entrega de vector subpial (AAV9) em camundongos adultos. Conforme demonstrado no vídeo acompanhante, esta abordagem e técnica podem ser efetivamente utilizadas, desde que os instrumentos necessários e a agulha pia penetrante e a agulha de injeção subpial sejam devidamente fabricadas, de acordo com as especificações estabelecidas e testadas.

Variáveis ​​técnicas críticas na realização de uma injeção subpial consistente e seg...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J Mice	Jackson Labs	664
Lab Standard Stereotaxic for Mice	Harvard Apparatus	72-9568
Mouse Spinal Adaptor	Harvard Apparatus	72-4811
XYZ Manipulator	Stoelting	51604
Manual Infusion Pump	Stoelting	51218
34G Beveled Nanofill Needle	World Precision Instruments	NF34BV-2
36G Blunt Nanofill needle	World Precision Instruments	NF-36BL-2
Fluriso, Isoflurane	MWI Veterinary Supply	502017
Chlorhexidine Solution	MWI Veterinary Supply	501027
20G Stainless Steel Needle	Becton-Dickinson	305175
23G Stainless Steel Needle	Becton-Dickinson	305145
30G Stainless Steel Needle	Becton-Dickinson	305128
Cotton Tipped Applicator	MWI Veterinary Supply	27426
Glass Capillary Beveller	Narishige International	SM-25B
Slide Microscope Superfrost	Leica Microsystems	M80
50μl Microsyringe	Hamilton	81242
BD Intramedic PE-20 Tubing	Becton, Dickinson	427406
BD Intramedic PE-10 Tubing	Becton, Dickinson	427401
4-0 monofilament suture	VetOne	V1D397
Glass Capillary Beveller	Narishige	Pipet Micro Grinder EG-40
5 min Epoxy (Epoxy Clear)	Devcon	14310
Euthanasia Solution	MWI Veterinary Supply	11168
Heparin Inj 1000U/mL	MWI Veterinary Supply	54254
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Anti NeuN Antibody	EMD-Millipore	ABN78	Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000
Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody	EMD-Millipore	AB144P	Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100
Anti GFP Antibody	Aves Labs	GFP-1020	Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A21207	Secondary Antibody, 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680	ThermoFisher Scientific	A10043	Secondary Antibody, 1:1000
Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Jackson Immunoresearch Labs	703-545-155	Secondary Antibody, 1:1000
Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647	Abcam	ab150131	Secondary Antibody, 1:1000
Slide Microscope Superfrost	Fisher Scientific	12-550-143
ProLong Gold Antifade Mountant	Fisher Scientific	P36930
Epifluorescence Microscope	Zeiss	Zeiss AxioImager M2
Fluorescence Confocal Microscope	Olympus	Olympus FV1000
Dextran	Polysciences, Inc	19411
AAV9-UBC-GFP	UCSD Viral Vector Core Laboratory