Subpial Adeno-assoziiertes Virus 9 (AAV9) Vektorlieferung in erwachsenen Mäusen

Zusammenfassung

Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die Potenz und Sicherheit der spinalen Adeno-assoziierten Virus 9 (AAV9) -vermittelten Genabgabe zu entwickeln und zu validieren, indem eine neuartige subpiale Genabgabetechnik bei erwachsenen Mäusen verwendet wurde.

Zusammenfassung

Die erfolgreiche Entwicklung eines subpialen Adeno-assoziierten Virus 9 (AAV9) Vektor-Delivery-Technik bei erwachsenen Ratten und Schweinen wurde bisher beschrieben. Unter Verwendung von subpial platzierten Polyethylenkathetern (PE-10 oder PE-5) für die AAV9-Abgabe wurde eine starke Transgenexpression durch das Spinalparenchym (weiße und graue Substanz) in sublimial injizierten Wirbelsäulensegmenten nachgewiesen. Wegen des breiten Spektrums der transgenen Mausmodelle von neurodegenerativen Erkrankungen besteht ein starker Wunsch nach der Entwicklung eines starken Nervensystems (ZNS), der in den erwachsenen Mäusen gezielt entwickelt wurde. Dementsprechend beschreibt die vorliegende Studie die Entwicklung einer spinalen Subpial-Vektor-Abgabevorrichtung und Technik, um eine sichere und wirksame Wirbelsäule-AAV9-Abgabe in erwachsenen C57BL / 6J-Mäusen zu ermöglichen. Bei spinell immobilisierten und anästhesierten Mäusen wurde die Pia mater (zervikale 1 und lumbale 1-2 Spinalsegmentstufe) mit einer scharfen 34 G-Nadel unter Verwendung eines XYZ-Manipulators eingeschnitten. Eine zweite XYZ maNipulator wurde dann verwendet, um eine stumpfe 36G-Nadel in den Lenden- und / oder Zervikal-subpialen Raum vorzurücken. Der AAV9-Vektor (3-5 & mgr; l, 1,2 × 10 ¹³ Genomkopien (gc)), der für grünes fluoreszierendes Protein (GFP) kodiert, wurde dann sublimiert. Nach Injektionen wurde die neurologische Funktion (motorisch und sensorisch) periodisch beurteilt und die Tiere wurden 14 Tage nach der AAV9-Abgabe mit 4% Paraformaldehyd perfusionsfest fixiert. Die Analyse von horizontalen oder transversalen Rückenmarksabschnitten zeigte eine transgene Expression während des gesamten Rückenmarks, sowohl in grauer als auch in weißer Substanz. Darüber hinaus wurde eine intensive retrogradvermittelte GFP-Expression in den absteigenden motorischen Axonen und Neuronen in der motorischen Kortex, Kernruber und formatio reticularis beobachtet. Bei jedem Tier wurde keine neurologische Dysfunktion festgestellt. Diese Daten zeigen, dass die Subpial-Vektor-Delivery-Technik erfolgreich bei erwachsenen Mäusen verwendet werden kann, ohne dass eine prozessbedingte Rückenmarksverletzung verursacht wird und mit hochwirksamen Transgenexpres assoziiert istWährend der spinalen Neuraxis.

Einleitung

Die Verwendung von AAV-Vektoren zur Behandlung einer Vielzahl von Rückenmark und ZNS-neurodegenerativen Erkrankungen wird zu einer gut akzeptierten Plattform, um die Expression von Gen (en) von Interesse effektiv zu regulieren oder zu stillen. Eine der Schlüsselbeschränkungen für die effektivere Nutzung dieser Technologie zur Behandlung von ZNS- / Rückenmarksstörungen ist die begrenzte Fähigkeit, AAV-Vektoren an das tiefe Gehirn oder das Rückenmark-Parenchym bei erwachsenen Säugetieren zu liefern.

Es wurde zum Beispiel gezeigt, dass die systemische Verabreichung von AAV9 bei adulten Nagetieren, Katzen oder nichtmenschlichen Primaten nur mäßig wirksam bei der Induktion der transgenen Expression in Neuronen im Gehirn und im Rückenmark ^{1 , 2 , 3 ist} . Die effektivere intrathekale Verabreichung von AAV9-Vektoren hat sich auch gezeigt, dass sie nur zu einer begrenzten Transgenexpression in anatomisch definierten Pools von Neuronen führen. Genauer gesagt, es war DämonenDass die cisternal- oder lumbo-sakrale intrathekale AAV9-Abgabe in nichtmenschlichen Primaten, Schweinen oder Nagetieren zu einem hohen Grad an transgener Expression in spinalen α-Motoneuronen und segmentalen Dorsalwurzelganglionneuronen führt. Allerdings ist ein minimaler oder kein Ausdruck in spinalen Interneuronen oder aufsteigenden oder absteigenden Axonen in der weißen Substanz ^{4 , 5 , 6 , 7 zu sehen} . Gemeinsam zeigen diese Daten, dass eine hochwirksame biologisch-anatomische Barriere existiert, die die Diffusion von intrathekal abgegebener AAV in tieferes Spinalparenchym verhindert.

In einer früheren Studie mit erwachsenen Ratten und Schweinen wurde eine neuartige Subpial-Vektor-Delivery-Technik entwickelt ⁸ . Unter Verwendung dieses Ansatzes wurde eine hochwirksame und multisegmentale Transgenexpression nach einer Ein-Bolus-Subpial-AAV9-Abgabe nachgewiesen. Intensive GFP-Expression wurde konsequent gesehenIn Neuronen, Gliazellen und absteigenden / aufsteigenden Axonen durch die injizierten Wirbelsäulensegmente. Diese Studie zeigte zum ersten Mal, dass die Pia mater die primäre Barriere darstellt, die die effektive AAV9-Diffusion in das Spinalparenchym aus dem intrathekalen Raum begrenzt. Während diese zuvor entwickelte Technik und die subpiale Injektionsvorrichtung bei großen Nagetieren (wie Ratten) oder erwachsenen Schweinen relativ einfach zu verwenden ist, ist das System nicht für den Einsatz bei kleinen Tieren, wie z. B. erwachsenen Mäusen, geeignet. Wegen der hohen Anzahl verfügbarer transgener Mausmodelle einer Vielzahl von neurodegenerativen Erkrankungen besteht ein klarer Bedarf an der Entwicklung einer wirksamen Spinal-Parenchym-Vektor-Verabreichungstechnik bei Mäusen. Die Verfügbarkeit einer solchen Technik würde die Untersuchung der Wirkung eines spezifischen Gen-Silens ( z. B. unter Verwendung von shRNA) oder einer Hochregulation unter Verwendung von zell-unspezifischen ( z. B. Cytomegalovirus-CMV oder Ubiquitin) oder zellspezifischen ( z. B. Synapsen oder Glia) ermöglichen Fibrillär sauerProtein (GFAP)) Promotoren während der frühen postnatalen Entwicklung oder unter kranken Bedingungen.

Dementsprechend haben wir in der vorliegenden Studie ein Miniatur-Subpial-Vektor-Delivery-System entwickelt und validiert, das effektiv bei erwachsenen Mäusen verwendet werden kann. Ähnlich wie bei früheren Ratten- und Schweinestudien zeigt diese Arbeit eine starke Transgenexpression während des gesamten Wirbelsäulenparenchyms nach einer Ein-Bolus-Subpial-AAV9-Abgabe bei Mäusen. Die Einfachheit dieses Ansatzes, die sehr gute Verträglichkeit von injizierten Mäusen zur subpialen AAV9-Abgabe und die hohe Potenz der Transgenexpression im Spinalparenchym deuten darauf hin, dass diese Technik in jeder Laborumgebung effektiv umgesetzt und in Experimenten verwendet werden kann, die auf die Spinalgenexpression abzielen.

Protokoll

Diese Studien wurden im Rahmen eines Protokolls durchgeführt, das vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of California, San Diego, genehmigt wurde und in Übereinstimmung mit der Vereinigung für die Bewertung von Labortierpflegerichtlinien für Tiernutzung war. Alle Studien wurden so durchgeführt, dass Gruppengröße und Tierleiden minimiert wurden.

1. Allgemeine tierische und chirurgische Vorbereitung

1. Vor Beginn des chirurgischen Eingriffs das Virus auftauen (AAV9-UBI-GFP; 5 μl Aliquote) ⁸ . Eine 5% Dextran (10.000 MW) Lösung durch Mischen von Dextranpulver in destilliertem Wasser vorbereiten. Mischen Sie die Viruslösung mit 5% Dextranlösung 1: 1 auf eine endgültige Dextrankonzentration von 2,5%.
   1. Die Viruslösung auf Eis (4 ° C) aufbewahren.
2. Verwenden Sie erwachsene C57BL / 6J Mäuse (männlich und weiblich, 20-30 g). Die Mäuse mit 5% Isofluran (in O ₂ , 1 L / min) betäubt und bei 2 aufbewahren-3% inhaliertes Isofluran (in O ₂ , 1 L / min) durch Nasenkonus während der Operation, abhängig von der Atemfrequenz und der Tatzendruckreaktion.
3. Rasieren Sie die Rückseite der Tiere mit Rasierklammern und reinigen Sie die Haut mit 2% Chlorhexidin.
4. In chronischen Erholungsstudien folgen eine strenge sterile Technik.
5. Wenn lumbale subpiale Injektionen durchgeführt werden sollen, schneide die Haut über die Th8-L1 Wirbel mit einem Skalpell und löst den paravertebralen Muskel von Th10-12 Wirbelsäule mit Schere.
   1. Montieren Sie das Tier in einen Standard-Stereotax-Rahmen mit Maus-Wirbelsäulen-Klemmen.
   2. Rasieren Sie die beiden Seiten der Lamellen der Th10-12 Wirbel mit einem Zahnbohrer (Bohrer: 0,9 mm, Geschwindigkeit: 20.000 U / min), bis Risse auftreten.
   3. Entfernen Sie geknackte Knochenfragmente mit einer Pinzette und setzen Sie die dorsale Oberfläche des Lendenwirbels ab.
   4. Die Dura ca. 1 cm mit einer 30 G Edelstahl Nadel und Pinzette aufschneiden.
6. Wenn zervikale subpiale Injektionen durchgeführt werden sollen, die dorsale Halshaut 1,5-2 cm mit einer Schere einführen und die C1-C2-Segmente freilegen.
   1. Entfernen Sie die atlanto-occipital Membran der cisterna magna mit einer 23G Edelstahl Nadel und Pinzette.
   2. Reinigen Sie die Inzisionsstelle von Gewebe- und Knochenschutt mit Wattestäbchen.
   3. Die Dura ca. 2-3 mm mit einer 30 G Edelstahl Nadel und Pinzette aufschneiden.

2. Eröffnung der Pial Membran und Einsetzen der Subpial Nadel für AAV9 Lieferung

1. Montieren Sie die 34 G-Pia-penetrierende Nadel in den Z-Arm eines XYZ-Manipulators mit einem Glas-Kapillar-Halter ( Abbildung 1A und B ).
   HINWEIS: Zur Herstellung der Pia-penetrierenden Nadel wird die ursprüngliche, abgeschrägte Spitze der 34G-Nadel mit einem Glas-Kapillar-Beveller mit Diamant-Schleifteller - grob (5,0 μm bis 50 μm Spitzengrößen) und Schleifwinkel von geschärft15 - 20 °. Die Spitze der Nadel (1 mm Länge, gemessen von der Spitze) wird dann sanft auf etwa 90 ° gebogen ( Abbildung 1B , linker Einsatz).
2. Unter Verwendung eines chirurgischen Sektionsbereichs, der auf eine 8-10-fache Vergrößerung eingestellt ist, durchdringen die Pia mit der Pia-penetrierenden Nadel um etwa 1 mm ( Abbildung 1C ) mit dem X-Arm.
   1. Halten Sie den Winkel der durchdringenden Nadel auf die Gewebeoberfläche bei 5-10 °.
3. Nach der Pia-Öffnung die Pia-Penetrationsnadel horizontal aus dem subpialen Raum ( Abbildung 1 D) mit dem X-Arm entfernen.
   HINWEIS: Denken Sie daran, die durchdringte Stelle durch ein Wahrzeichen, wie ein Blutgefäß.
4. Legen Sie eine stumpfe 36G Injektionsnadel mit AAV9-UBI-GFP-Virus mit einer 50-μL-Mikrospritze, die mit der Injektionsnadel mit PE-10 oder PE-20-Schlauch verbunden ist.
5. Montieren Sie die Nadel in den Z-Arm eines zweiten XYZ-Manipulators ( Abbildung 1A und B ) unter Verwendung eines Glaskapillarenhalters ( Bild 1B , rechter Einsatz).
   HINWEIS: Zur Herstellung der subpialen AAV9-Injektionsnadel wird die stumpfe Spitze einer 36 G-Nadel mit einem Glas-Kapillar-Beveller mit Diamant-Schleifteller - grob (5,0 μm bis 50 μm Spitzengrößen) poliert, um die scharfen Kanten zu entfernen. Die Spitze der Nadel (2-3 mm Länge, gemessen von der Spitze) wird dann sanft auf etwa 90 ° gebogen. Die pia-penetrierenden und subpialen Injektionsnadeln werden in 1-2 cm lange 20G-Slave-Edelstahlrohre (10 mm vom Ende der Nadel) eingefügt und mit Epoxy verklebt. Für die sichere Befestigung am Glaskapillarenhalter ist die Verwendung von 20 G (0,91 mm Durchmesser) Rohr erforderlich.
6. Durch die Manipulation der X-, Y- und Z-Arme des zweiten Manipulators positionieren Sie die Spitze der AAV9-Injektionsnadel in die pia-durchdringte Stelle und führen sie dann etwa 2-3 mm in den subpialen Raum durch die vorherige Pialmembranöffnung mit dem X-arm( Abbildung 1E und F ).
   HINWEIS: 1) Das AAV9-UBI-GFP wird nach den zuvor gemeldeten Protokollen ^{9 , 10 hergestellt} und die endgültigen Titer werden auf 1,2 x 10 ¹³ Genomkopien pro ml (gc / ml) eingestellt. 2) Es besteht keine Notwendigkeit, die Stelle der Pialöffnung zu markieren, weil sie leicht identifizierbar ist ( Abbildung 1D ).
7. Injizieren Sie die AAV9-UBI-GFP (1,5, 3 oder 5 μl) in den subpialen Raum mit einer 50 μl Mikrospritze (siehe Tabelle 1 für Versuchsgruppen).
8. Entfernen Sie die Injektionsnadel aus dem subpialen Raum, nachdem die AAV9-UBI-GFP-Injektion abgeschlossen ist.
9. Schließen Sie den Muskel und die Haut mit 4,0 Monofilament Naht und chirurgischen Clips.
   HINWEIS: Es besteht keine Notwendigkeit, den offenen Wirbel zu versiegeln.
10. Lassen Sie die Tiere auf einem Heizkissen erholen.
11. Für Schmerzkontrolle injizieren Buprenorphin 0,05 mg / kg / sc alle 12 h für2-3 Tage nach der Operation.

3. Perfusionsfixierung, Tissue Cryoprotection und Immunfluoreszenzfärbung

1. Zu einem vorgegebenen Zeitpunkt nach den subpialen AAV9-Injektionen werden die Mäuse mit einer Euthanasie-Lösung (siehe Tabelle der Materialien , 0,3 ml) tief betäubt und sie mit 20 ml heparinisiertem Salzlösung transkutiv perfundiert, gefolgt von 20 ml 4% Paraformaldehyd in PBS.
2. Die Wirbelsäule und das Gehirn mit einem Knochenrongeur zerkleinern und in 4% Formaldehyd in PBS über Nacht bei 4 ° C nachfüllen.
3. Kryoprotekt die Wirbelsäule und Gehirne mit 30% Saccharose in PBS für mindestens 5-7 Tage.
4. Schneiden Sie koronale, transversale oder longitudinale / horizontale gefrorene Abschnitte (30 μm dick) auf einem Kryostaten und speichern Sie sie in PBS bei 4 ° C.

4. Immunfluoreszenz-Färbung von Rückenmark und Gehirn-Sektionen (siehe Tabelle der Materialien)

1. Inkubieren Sie frei schwebende Abschnitte in PrimarY-Antikörper über Nacht.
2. Nach der Inkubation mit primären Antikörpern, waschen Sie die Schnitte dreimal in PBS und inkubieren Sie mit fluoreszenzkonjugierten Esel-Anti-Kaninchen, Esel-Antihuhn und Esel-Anti-Ziegen-Sekundärantikörpern.
3. Montieren Sie die Abschnitte auf Mikroskopie-Objektträgern, trocknen Sie sie bei Raumtemperatur und decken Sie sie mit einem Anti-Fade-Medium ab.
4. Erfassen von Bildern mit Epifluoreszenz-Fluoreszenzmikroskop (Ziele: 10X, NA-0.3; 20X, NA-0.8 und 63X, NA-1.4).

Ergebnisse

Potente Transgenexpression in subpialen AAV9-injizierten Segmenten:
Die Analyse der Transgen- (GFP) -Expression in den Rückenmarksabschnitten an 14 Tagen nach der AAV9-Abgabe zeigte eine AAV9-dosisabhängige GFP-Expression während des Spinalparenchyms. Zuerst wurden zwei bilaterale 3 & mgr; l Injektionen von AAV9-UBI-GFP, die in den oberen lumbalen subpialen Raum injiziert wurden, mit der nahezu vollständigen Infektion der weißen und grauen Substanz ...

Diskussion

Die aktuelle Studie beschreibt eine Technik der subpialen Vektor (AAV9) Lieferung bei erwachsenen Mäusen. Wie in dem begleitenden Video gezeigt, kann dieser Ansatz und die Technik effektiv genutzt werden, vorausgesetzt, dass die benötigten Instrumente und die pia-penetrierende Nadel und die subpiale Injektionsnadel entsprechend den etablierten und getesteten Spezifikationen ordnungsgemäß hergestellt werden.

Kritische technische Variablen bei der Durchführung einer konsistenten u...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J Mice	Jackson Labs	664
Lab Standard Stereotaxic for Mice	Harvard Apparatus	72-9568
Mouse Spinal Adaptor	Harvard Apparatus	72-4811
XYZ Manipulator	Stoelting	51604
Manual Infusion Pump	Stoelting	51218
34G Beveled Nanofill Needle	World Precision Instruments	NF34BV-2
36G Blunt Nanofill needle	World Precision Instruments	NF-36BL-2
Fluriso, Isoflurane	MWI Veterinary Supply	502017
Chlorhexidine Solution	MWI Veterinary Supply	501027
20G Stainless Steel Needle	Becton-Dickinson	305175
23G Stainless Steel Needle	Becton-Dickinson	305145
30G Stainless Steel Needle	Becton-Dickinson	305128
Cotton Tipped Applicator	MWI Veterinary Supply	27426
Glass Capillary Beveller	Narishige International	SM-25B
Slide Microscope Superfrost	Leica Microsystems	M80
50μl Microsyringe	Hamilton	81242
BD Intramedic PE-20 Tubing	Becton, Dickinson	427406
BD Intramedic PE-10 Tubing	Becton, Dickinson	427401
4-0 monofilament suture	VetOne	V1D397
Glass Capillary Beveller	Narishige	Pipet Micro Grinder EG-40
5 min Epoxy (Epoxy Clear)	Devcon	14310
Euthanasia Solution	MWI Veterinary Supply	11168
Heparin Inj 1000U/mL	MWI Veterinary Supply	54254
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Anti NeuN Antibody	EMD-Millipore	ABN78	Primary Rabbit Polyclonal Antibody, 1:1000
Anti-Choline Acetyltransferase (CHAT) Antibody	EMD-Millipore	AB144P	Primary Goat Polyclonal Antibody, 1:100
Anti GFP Antibody	Aves Labs	GFP-1020	Primary Chicken Polyclonal Antibody, 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A21207	Secondary Antibody, 1:1000
Donkey anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 680	ThermoFisher Scientific	A10043	Secondary Antibody, 1:1000
Donkey anti-Chicken IgY Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Jackson Immunoresearch Labs	703-545-155	Secondary Antibody, 1:1000
Donkey Anti-Goat IgG H&L (Alexa Fluor 647	Abcam	ab150131	Secondary Antibody, 1:1000
Slide Microscope Superfrost	Fisher Scientific	12-550-143
ProLong Gold Antifade Mountant	Fisher Scientific	P36930
Epifluorescence Microscope	Zeiss	Zeiss AxioImager M2
Fluorescence Confocal Microscope	Olympus	Olympus FV1000
Dextran	Polysciences, Inc	19411
AAV9-UBC-GFP	UCSD Viral Vector Core Laboratory