في فيفو التصوير من "الفئران مراسل" Cx3cr1التجارة والنقل/التجارة والنقل مع المجالات الطيفية الضوئية التماسك التصوير المقطعي وفحص تنظير العين الليزر

Summary

ويصف هذا البروتوكول عالية الدقة كيف تقنيات التصوير مثل التصوير المقطعي التماسك الضوئية المجال الطيفي وفحص تنظير العين الليزر يمكن أن تستخدم في القوارض الصغيرة، باستخدام نظام منصة تصوير العيون، للحصول على معلومات حول ميكروجليال وسمك الشبكية خلية التوزيع، على التوالي.

Abstract

التصوير المقطعي بالتماسك الضوئية المجال الطيفي (SD--أكتوبر) والمسح الضوئي الليزر تنظير العين (سلوفاكيا) تستخدم على نطاق واسع في طب العيون التجريبية. في هذا البروتوكول، الأخضر الفئران معربا عن بروتين فلوري (بروتينات فلورية خضراء) تحت مروج Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1^{التجارة والنقل/التجارة والنقل}) واستخدمت صورة microglia الخلايا في الجسم الحي في الشبكية. Microglia الضامة المقيمين من الشبكية وقد تورط في عدة أمراض الشبكية^{1،2،3،4،،}من⁵⁶. يوفر هذا البروتوكول نهجاً مفصلة لجيل من الشبكية ب-عمليات المسح، مع التنمية المستدامة، تشرين الأول/أكتوبر، وتصوير microglia خلية التوزيع في الفئران Cx3cr1^{التجارة والنقل/التجارة والنقل} مع سلوفاكيا في فيفو، باستخدام نظام منصة تصوير العيون. يمكن استخدام البروتوكول في العديد من خطوط الماوس مراسل. ومع ذلك، توجد بعض القيود على البروتوكول المعروضة هنا. أولاً، كل من سلوفاكيا والتنمية المستدامة، تشرين الأول/أكتوبر، عند استخدامها في وضع عالي الاستبانة، وجمع البيانات مع ارتفاع القرار المحوري ولكن القرار الأفقي أدنى (3.5 ميكرون و 6 ميكرومتر، على التوالي). وعلاوة على ذلك، مستوى التركيز والتشبع في سلوفاكيا تعتمد اعتماداً كبيرا على اختيار المعلمة والمحاذاة الصحيحة للعين. بالإضافة إلى ذلك، استخدام أجهزة مصممة للمرضى البشرية في الفئران صعبة بسبب قوة العين الماوس الضوئية مجموع أعلى مقارنة بالعين البشرية؛ هذا يمكن أن يؤدي إلى الوحشي التكبير المغالطات⁷، التي تعتمد أيضا على نسبة التكبير بالعدسة الماوس بين أمور أخرى. ومع ذلك، وبالرغم من هذا الموقف المسح المحوري مرهون بالتكبير الأفقي، القياسات SD--أكتوبر المحوري دقيقة⁸.

Introduction

في طب العيون التجريبية، يتم عادة تقييم الفحص الباثولوجي الشبكية باستخدام تقنيات نسيجية. ومع ذلك، علم الأنسجة يتطلب يوثانيزيشن الحيوانية وقد يسبب تغيير في الخصائص الفعلية للأنسجة. SD--أكتوبر وسلوفاكيا بشكل روتيني وتستخدم في طب العيون السريري لأغراض التشخيص والرصد لعدة أمراض الشبكية مثل السكري وذمة بقعيه⁹أو اعتلال الأعصاب البصرية الدماغية الأمامية¹⁰التهاب الشبكية الصباغي¹¹ . SD--أكتوبر وسلوفاكيا هي تقنيات غير الغازية التي تولد صور عالية الاستبانة للشبكية، التي هي تصور عن طريق التلميذ المتوسعة دون أي تدخل آخر. SD--أكتوبر معلومات البنية الشبكية وسمك الشبكية عن طريق جمع البيانات باكسكاتيرينج لإنشاء الصور المقطعية الشبكية، بينما سلوفاكيا يجمع البيانات الأسفار لإنتاج صور عالية التباين مجسمة الشبكية. في الوقت الحاضر، تستخدم بشكل متزايد في طب العيون تجريبية باستخدام القوارض الصغيرة^12،13،،من¹⁴¹⁵ (أو^16،الزرد حتى¹⁷) كلا التقنيات ويمكن تقديم كل المعلومات النوعية والكمية^12،17،،من^1819،،من²⁰²¹.

يمكن تصور تراكم fluorophores الذاتية مثل ليبوفوسسينس أو تشكيل دروسين في الشبكية بسلوفاكيا كإشارة السيارات الفلورسنت. هذه الميزة يجعل سلوفاكيا تقنية قيمة لتشخيص ورصد الأمراض الشبكية مثل البقعي المرتبطة بالسن أو التهاب الشبكية الصباغي^22،23. في طب العيون التجريبية، يمكن استخدام صف السيارات التصوير (بالعربية) للكشف عن أنواع الخلايا المحددة في خطوط الماوس مراسل. على سبيل المثال، الفئران متخالف للتعبير عن التجارة والنقل تحت مروج Cx3cr1²⁴ مفيدة للتصور في فيفو خلايا microglial في الشبكية العادي والتحقيق في microglia/بلعم الديناميات في أمراض الشبكية²¹. Microglia هي الضامة المقيم الشبكية، التي تلعب دوراً حاسما في التوازن الأنسجة وإصلاح الأنسجة عند الإصابة^1،،من²⁵²⁶. وأفيد في إصابة الشبكية، الاسكيمية، وانحطاط، يشير إلى دور هذه الخلايا في أمراض الشبكية^2،3،،من^45، Microglia التنشيط في شبكية العين ⁶.

ويهدف هذا البروتوكول وصف طريقة بسيطة نسبيا لتصوير الشبكية، وقياس سمك الشبكية باستخدام SD، تشرين الأول/أكتوبر، والتصور للتجارة والنقل microglia إيجابية الخلايا في Cx3cr1^{التجارة والنقل/التجارة والنقل} الماوس الشبكية باستخدام سلوفاكيا (نظام "سبيكتراليس هايدلبرغ" HRA + OCT). ويمكن استخدام هذا البروتوكول لقياسات التصوير وسمك شبكية العين سليمة أو مريضة في خطوط الماوس المختلفة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء تحليل شكلي للتعرف على والتحديد الكمي لأرقام microglia و microglia التنشيط في الشبكية باستخدام سلوفاكيا²¹. Microglia الخلايا المرتبطة بالأمراض التنكسية في الجهاز العصبي المركزي (CNS)، بما في ذلك الشبكية^27،،من²⁸²⁹. وهكذا، من خلال الجمع بين الطريقتين المستخدمة في هذا البروتوكول، يمكن إجراء ارتباط توزيع microglia وتنكس الشبكية، التي يمكن أن تيسر رصد شدة المرض أو النهج فعالية علاجية في فيفو.

Protocol

في جميع الإجراءات، بالب/ج الفئران الذكور والإناث الكبار الذين يعربون عن التجارة والنقل تحت مروج Cx3cr1 كانت تستخدم ²⁴. الفئران يعاملون وفقا "البيان آرفو" "استخدام الحيوانات" في أوفثالميك وأبحاث الرؤية ووافق جميع الإجراءات من الحكومة السويسرية وفقا "اللوائح الاتحادية السويسرية" شأن "الرفق بالحيوان". تم تخديره الفئران الحقن تحت الجلد ميديتوميديني هيدروكلوريد (0.75 مغ/كغ) والكيتامين (45 مغ/كغ). وأكد التخدير المناسب رصد معدل التنفس والحيوان ' منعكس s ضد قرصه ذيل. في نهاية هذه التجارب، وقد euthanized الفئران مع استنشاق أول أكسيد الكربون ₂.

ملاحظة: أداء كل دورة التصوير، في أسرع وقت ممكن (20 دقيقة كحد أقصى)، ومنذ تشكيل الساد التخدير التالية قد يعيق التصور الشبكية ³⁰-

1-"تكوين نظام"

1. تشغيل الكمبيوتر-
2. تشغيل إمدادات الطاقة. الرسالة " ابدأ الحصول على الوحدة النمطية " سوف تظهر على شاشة لوحة التحكم الخاصة بالجهاز-
3. انقر نقراً مزدوجاً فوق اختصار سطح المكتب للبرنامج لتشغيل البرنامج-
4. على عرض قاعدة البيانات، انقر فوق " إضافة المريض " رمز-
5. في إطار منبثق، أدخل جميع المعلومات اللازمة (اسم العائلة، الاسم الأول، والعنوان، وتاريخ الميلاد، والجنس، ومعرف المريض)، وانقر فوق " طيب ". على نافذة البوب تعيين انحناء القرنية إلى 2 مم، ثم انقر فوق " طيب "-
6. ضع عدسة د 78 مصباح قياسي شق عدم الاتصال العيون أمام البصرية القياسية 30 °، وربط ذلك بأمان مع الشريط.
7. تأكد من أن يتم وضع ذراع عامل التصفية على الجهة اليسرى الجهاز على الإشارة إلى " A " للسماح للأشعة تحت الحمراء + أكتوبر والتصوير ( الشكل 1) بالعربية-

2. إعداد الماوس

1. استخدام جرعة هيدروكلوريد ميديتوميديني 0.75 ملغ/كغ والكيتامين جرعة من 45 مغ/كغ في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS، درجة الحموضة 7.4) لإعداد حل التخدير. وهكذا، ماوس ز 20، مزيج 15 ميليلتر من هيدروكلوريد ميديتوميديني مع 18 ميليلتر من الكيتامين إلى وحدة تخزين نهائي من 50 ميليلتر في برنامج تلفزيوني. تخزين الحل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
2. أمسك الماوس بالقفا وتطبيق قطره واحدة من تروبيكاميدي 0.5% + فينيليفريني هيدروكلوريد 2.5% في كل عين لتحقيق تمدد التلميذ.
3. الاحتفاظ بالماوس ضبط النفس، ومع حقنه الأنسولين تعلق بإبرة ز 30، 50 ميليلتر من الحل التخدير حقن تحت الجلد. وضع الماوس مرة أخرى في قفصة التي يتم وضعها فوق وسادة تدفئة. الانتظار 3-5 دقائق حتى الماوس هو مخدراً تماما. لتقييم عمق مخدر، قرصه ذيل الماوس. تحقق منعكس القرنية بلمس القرنية الماوس مع مسحه القطن بلطف. إذا كان يتم ملاحظة لا رد فعل إيجابي، تواصل مع التصوير-
   ملاحظة: من المهم رصد معدل التنفس أثناء التخدير. إذا لم يتم مخدراً الماوس تماما، سوف تزيد معدل التنفس عند حافزا مؤلمة.
4. هيدرات قطرات القرنية الماوس مع تطبيق هيدروكسيبروبيلميثيلسيلولوسي 2% على كل عين-

3. SD--أكتوبر

1. وضع تصحيح الاحترار حوالي 32 درجة مئوية على منصة مصنوعة خصيصا تعلق على بقية الذقن للجهاز ( الشكل 1).
2. الصورة في العين اليمنى، ضع الماوس على الجزء الأيسر من النظام الأساسي ( الشكل 1). التأكد من أن يواجه المدار الصحيح للماوس العدسة والهيئة يكمن عرضه في الجزء الأيسر من المنهاج.
3. تطبيق قطره هيدروكسيبروبيلميثيلسيلولوسي على العين اليمنى وموقف الديوبتر + 4 جامدة غاز نفاذية اتصال عدسة بعناية على أنها (قوة كروية:-25.00 إلى +25.00 ديوبتر). تخزين العدسات اللاصقة في حل متوازن الملح (BSS). للاستيلاء على العدسة، استخدام الملقط من البلاستيك أو السيليكون لتفادي الضرر.
4. اضغط على المربع الأصفر في الزاوية اليمنى من شاشة لوحة التحكم بدء تشغيل الوحدة النمطية اقتناء (الصندوق الأخضر في الشكل 2 ألف). المربع الأصفر سوف يتحول إلى اللون الأخضر وسوف تظهر قائمة لوحة التحكم على الشاشة ( الشكل 2A).
5. للحصول على فحص ب، حدد خيار الأشعة تحت الحمراء + أكتوبر على لوحة التحكم ( الشكل 2A). يتم تمييز الإعدادات المحددة باللون الأزرق على لوحة التحكم-
6. تحديد " الشبكية " تحت " التطبيق وهيكل " في البرمجيات وتحرك العدسة نحو العين الماوس باستخدام في ميكرومانيبولاتور على الجهاز ( الشكل 1). قبل التركيز على شبكية العين، تحقق من أن الإشارة إلى " OD " المحددة في الجزء الأيسر السفلي من الشاشة. يحدد البرنامج تلقائياً في اليسار (نظام التشغيل) والعين اليمنى (OD) استناداً إلى موضع الهدف.
   ملاحظة: إذا تم وضع الهدف في وسط المنصة، سوف تظهر رسالة خطأ في الجزء السفلي من الشاشة. وفي هذه الحالة، إعادة وضع الماوس قليلاً حتى البرمجيات تسلم العين الصحيحة.
7. مع مقبض التركيز، التركيز على شبكية العين حتى السفن الكبيرة التي يتم رؤيتها بوضوح في صورة النظارة على الجهة اليسرى شاشة الكمبيوتر. تحريك الكاميرا بتحويل ميكرومانيبولاتور اليسار أو اليمين، تحريك الكاميرا في هذا الاتجاه، أو اتجاه عقارب الساعة أو عكس اتجاه عقارب الساعة، لتحريك الكاميرا أعلى أو لأسفل، على التوالي.
   ملاحظة: قم بتغيير موضع الماوس على المنصة أو تحريك العدسة صعودا أو هبوطاً لتحقيق التعريب المفضل رأس العصب البصري في صورة الأشعة تحت الحمراء-
8. أدر حساسية عكس اتجاه عقارب الساعة لتخفيض أو عكس اتجاه عقارب الساعة لزيادة سطوع الصورة النظارة. عندما يتحقق التركيز الأمثل، للتنمية المستدامة-أكتوبر ب-مسح سوف تظهر على يمين الشاشة-
   ملاحظة: إذا كان لا يمكن تصور ب-المسح الضوئي عن طريق ضبط التركيز، اضغط تركيبة على لوحة المفاتيح Ctrl + Alt + Shift + O. في النافذة المنبثقة، قم بضبط قيمة الذراع مرجع حتى ب-الفحص يظهر على الشاشة.
9. في أسفل يمين الشاشة، اختر مسح واحد من قائمة نمط (سطر واحد في الشكل 2)-
10. تشغيل ميكرومانيبولاتور للجهاز ( الشكل 1)، اليسار، اليمين، إلى الأمام أو الخلف (لتشغيل الكاميرا في هذا الاتجاه) لضمان أن ب-المسح الضوئي يقع بين الجزء العلوي والسفلي أركان التنمية المستدامة-OCT تفحص النافذة.
11. تعيين القيمة تلقائياً في الوقت الحقيقي (الفن) على الأقل 9 للحصول على صور ذات جودة عالية-
    ملاحظة: فن يحسن جودة الصورة بحساب متوسط مسح متتالية عدة. أعلى " الفن " القيمة، وكلما زادت نسبة الإشارة إلى الضجيج، ومن ثم جودة الصورة. ومع ذلك، عن طريق زيادة " الفن " القيمة، واكتساب كما يتم زيادة الوقت.
12. صحفي " الحصول على " زر ( الشكل 2) على شاشة لوحة التحكم واقتناء الصور.
13. إعادة وضع مؤشر الماوس صورة العين اليسرى وكرر الخطوات 3.2-3.12.
14. إزالة العدسات اللاصقة مع الملقط البلاستيك/السليكون ووضعه داخل BSS.
15. هيدرات القرنية الماوس مع قطره جديدة من هيدروكسيبروبيلميثيلسيلولوسي وإزالة الزائدة مع ورقة الأنسجة.
16. إزالة الألياف البصرية القياسية 30 ° بالتناوب من عكس اتجاه عقارب الساعة.
17. جبل العدسة 55 ° وكرر الخطوات 3.4-3.12 لكل عين-

4. السيارات Fluorescence التصوير

1. دون تحريك الماوس على النظام الأساسي، حدد الأشعة تحت الحمراء في لوحة التحكم.
2. مع مقبض التركيز، التركيز على الأوعية الشبكية الكبيرة.
3. في "لوحة التحكم" حدد AF.
4. أدر حساسية عكس اتجاه عقارب الساعة للحد أو عكس اتجاه عقارب الساعة لزيادة سطوع الصورة.
5. اضغط مقبض حساسية وتعيين " الفن " القيمة إلى 67 أو أكثر للحصول على نوعية عالية من الصور.
6. عند المجموعة " الفن " تم التوصل إلى القيمة، اضغط على " الحصول على " في لوحة التحكم للحصول على الصورة. اضغط مقبض حساسية مرة أخرى التوقف عن المتوسط. ضبط التركيز، تصور مختلف طبقات الشبكية.
إزالة العدسة 55°
7. وجبل عدسة 102° الميدانية على نطاق واسع. اتبع الخطوات 4.1 – 4.6 لكلتا العينين لكل الماوس والماوس كل.
8. انقر فوق “ حفظ الصور ” على الحد العلوي الأيسر من النافذة ثم انقر فوق “ الخروج ”. لحفظ الصور في جهاز الكمبيوتر، حدد الماوس من القائمة الموجودة في الجزء الأيمن من الشاشة بالنقر المزدوج على اسم الماوس. انقر نقراً مزدوجاً فوق كل صورة على حدة، وثم انقر على أيقونة القرص المرن. حفظ الصورة ك.tif أو.bmp أو.jpg أو.png في المجلد الذي تريده. لإنهاء برنامج الصحافة “ ملف ” و “ الخروج ”.

5. عكس التخدير

1. هيدرات عيون الماوس مع قطره واحدة من هيدروكسيبروبيلميثيلسيلولوسي والعودة الماوس على لوحة تدفئة.
2. تحضير أتيباميزولي الحل في جرعة من 2.25 مغ/كغ لعكس آثار المسكنات هيدروكلوريد ميديتوميديني. ماوس ز 20، إضافة 9 ميليلتر من أتيباميزول في وحدة تخزين نهائي من 150 ميليلتر PBS. تخزين الحل عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
3. دقيقة بعد حقن التخدير (الخطوة 2، 2)، ضخ 150 ميليلتر من حل أتيباميزولي تحت الجلد.
4. رصد الماوس حتى التعافي من التخدير. عندما يكون الماوس تماما المستردة (5-10 دقيقة بعد الحقن أتيباميزولي) وضعه مرة أخرى في قفصة. تتم الإشارة إلى الانتعاش بقدرة الحيوان على تحويل الهيئة عندما وضعت على جانب واحد، استعادت يمشي النشاط، والاستجابة استجابة للتحفيز البيئي.

6. دليل "قياس سمك الشبكية" من "صور" التنمية المستدامة، تشرين الأول/أكتوبر

1. فتح الفحص OCT بالنقر المزدوج على اسم الحيوان.
2. فتح ب-المسح الضوئي التي تم الحصول عليها مع عدسة 30 ° أو 55 °-
3. اختيار " الشخصية سمك ".
4. صحفي " "تحرير طبقة الانقسامات" " الرمز ( الشكل 2). البرنامج تلقائياً يحدد الحد الداخلي وقاعدة الغشاء.
5. إذا لزم الأمر، يدوياً تصحيح موقف الحد الداخلي وقاعدة الغشاء. للقيام بذلك، اختر الطبقة إلى تعديل من الجانب الأيسر من الشاشة، ومن ثم خيار دائرة حمراء ( الشكل 2). تحرك الدائرة مع زر الماوس الضغط لتعديل الخط.
6. تعديل الخط موقف الطبقة المقابلة بشكل صحيح. انقر فوق " حفظ وإغلاق " للخروج من النافذة-
   ملاحظة: سبب انعكاسية المشيمية، البرنامج قد تحدد الغشاء القاعدة بشكل غير صحيح. وهكذا، فمن الأفضل لتعريفه يدوياً قبل المتابعة إلى قياسات سمك الشبكية.
7. اختيار " الشبكية " تحت " طبقة " الخيار. رسم تخطيطي لسمك الشبكية سوف تظهر في الجزء السفلي من الشاشة.
8. فوق في موضع آخر أما على الرسم التخطيطي أو ب-المسح الضوئي لعرض سمك الشبكية (المشار إليها في ميكرومتر) للمنصب المحدد.
9. قياس سماكة الشبكية في المسافة المطلوبة من رأس العصب البصري ونسخ القيم في جدول بيانات.
10. كرر الخطوتين 5.1-5.9 للماوس كل 30 ° والعدسة 55 °.
11. إجراء تحليل إحصائي بالبرامج المطلوب.

النتائج

باستخدام بروتوكول المعروضة هنا، يمسح SD، تشرين الأول/أكتوبر وتم الحصول على صور سلوفاكيا من الفئران Cx3cr1^{التجارة والنقل/التجارة والنقل} في نفس جلسة التصوير. ويشمل الرقم 3 الممثل SD--أكتوبر مسح واحد حصل 30 ° أو عدسة 55 ° (الشكل 3A) وممثل س?...

Discussion

هذه المادة يوضح بروتوكول لاقتناء الشبكية ب-المسح والتصوير للتجارة والنقل التوزيع microglia الإيجابية في الشبكية الماوس في نفس جلسة التصوير. يتزايد استخدام SD، تشرين الأول/أكتوبر وسلوفاكيا في نماذج حيوانية من أمراض الشبكية لتوفير معلومات للتعديلات الشبكية عبر الوقت^10،،

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectralis Imaging system (HRA+OCT)	Heidelberg Engineering, Germany	N/A	ophthalmic imaging platform system
Heidelberg Eye Explorer	Heidelberg Engineering, Germany	N/A	Version 1.9.13.0
78D standard ophthalmic non-contact slit lamp lens	Volk Optical Inc., Ohio, USA	V78C
Spectralis wide angle 55° lens	Heidelberg Engineering, Germany	50897-002
ultra widefield 102° lens	Heidelberg Engineering, Germany	50117-001
medetomidine hydrochloride 1 mg/mL (Domitor)	Provet AG, Lyssach, Switzerland	Swissmedic Nr. 50'590 - ATCvet: QN05CM91	anesthetic/analgesic
ketamine 50mg/ml (Ketalar)	Parke-Davis, Zurich, Switzerland	72276388	anesthetic
tropicamide 0.5% + phenylephrine HCl 2.5% (Augentropfen mix)	ISPI, Bern, Switzerland	N/A	pupil dilation
Omnican Insulin-50 0.5 ml G30 0.3 x 12mm	B. Braun Mesungen AG, Carl-Braun-Straße, Germany	9151125
hydroxypropylmethylcellulose (Methocel 2%)	OmniVision, Neuhausen, Switzerland	N/A
+4 dpt rigid gas permeable contact lens	Quantum I, Bausch + Lomb Inc., Rochester, NY	N/A	Base Curve: 7.20 to 8.40 mm Diameter: 9.00 / 9.60 / 10.20 mm Power: -25.00 to +25.00 Diopters
balanced salt solution (BSS)	Inselspital, Bern, Switzerland	N/A
silicon forceps	N/A	N/A
atipamezole 5 mg/mL (Antisedan)	Provet AG, Lyssach, Switzerland	N/A	α2 adrenergic receptor antagonist
GraphPad Prism 7	GraphPad Software, Inc, San Diego, CA, USA	N/A	statistical analysis software