In Vivo Imagerie des souris journaliste Cx3cr1gfp/gfp avec domaine Spectral Optical Coherence Tomography et numérisation Laser ophtalmologique

Résumé

Ce protocole décrit comment haute résolution techniques d’imagerie comme la tomographie par cohérence optique de domaine spectral et numérisation laser ophtalmologique peut être utilisé dans les petits rongeurs, à l’aide d’un système de plate-forme d’imagerie ophtalmique, pour obtenir des informations sur épaisseur de la rétine et microgliales cellulaire distribution, respectivement.

Résumé

Tomographie en cohérence optique domaine spectral (SD-OCT) et balayage ophtalmoscopie laser (SLO) sont largement utilisés en ophtalmologie expérimentale. Dans le présent protocole, des souris exprimant le vert protéine fluorescente (gfp) sous le promoteur de Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1^gfp/gfp) ont été utilisés afin d’imager la microglie cellules in vivo dans la rétine. Les microglies sont des macrophages résidant de la rétine et ont été impliqués dans plusieurs maladies de la rétine^1,2,3,4,5,6. Ce protocole prévoit une approche détaillée pour la génération de rétiniens B-scans, avec SD-OCT et imagerie de distribution cellulaire microglies chez les souris Cx3cr1^gfp/gfp avec SLO in vivo, en utilisant un système de plate-forme d’imagerie ophtalmique. Le protocole peut être utilisé dans plusieurs lignées de souris de journaliste. Cependant, il y a certaines limitations au protocole présenté ici. Tout d’abord, les SLO et SD-OCT, lorsqu’il est utilisé en mode haute résolution, recueillir des données à haute résolution axiale mais la résolution latérale sont plus faible (3,5 µm et 6 µm, respectivement). En outre, le niveau de mise au point et la saturation dans SLO est fortement tributaire de la sélection des paramètres et un alignement correct de l’oeil. En outre, à l’aide de dispositifs conçus pour les patients humains chez la souris est difficile en raison de la puissance optique totale plus élevée de l’oeil de la souris par rapport à le œil humain ; Ceci peut mener au latéral grossissement inexactitudes⁷, qui dépendent aussi du grossissement de l’objectif de la souris entre autres. Cependant, malgré cette position le balayage axial dépend de grossissement latéral, les mesures de SD-OCT axiales sont exacts⁸.

Introduction

En ophtalmologie expérimentale, examen de la pathologie rétinienne est généralement évaluée à l’aide de techniques histologiques. Toutefois, histologie exige euthanasie animale et peut provoquer des modifications aux propriétés réelles du tissu. SD-OCT et SLO sont régulièrement utilisées en ophtalmologie clinique pour le diagnostic et pour le suivi de plusieurs maladies de la rétine comme le œdème maculaire diabétique,⁹,¹⁰de la neuropathie optique ischémique antérieure ou rétinite pigmentaire¹¹ . SD-OCT et SLO sont des techniques non invasives qui génèrent des images haute résolution de la rétine, qui sont visualisées à travers la pupille dilatée sans intervention supplémentaire. SD-OCT fournit des informations de structure rétinienne et épaisseur rétinienne en recueillant des données diffusantes pour créer des images en coupe de la rétine, alors que SLO recueille des données de fluorescence pour produire des images stéréoscopiques de contraste élevé de la rétine. De nos jours, les deux techniques sont de plus en plus utilisés en ophtalmologie expérimentale à l’aide de petits rongeurs^12,13,14,15 (ou même poisson zèbre^16,17) et peut fournir les informations qualitatives et quantitatives^{12,17,18,19,20,21}.

L’accumulation de fluorophores endogènes comme lipofuscins ou la formation de drusen dans la rétine peut être visualisée par SLO comme signal fluorescent auto. Cette caractéristique rend SLO une technique précieuse pour le diagnostic et la surveillance des maladies de la rétine comme la dégénérescence maculaire liée à l’âge ou la rétinite pigmentaire^22,23. En ophtalmologie expérimentale, fluorescence auto imaging (AF) peut être utilisé pour la détection des types spécifiques de cellules dans les lignées de souris journaliste. Par exemple, les souris hétérozygotes pour l’expression de la gfp sous le promoteur de Cx3cr1²⁴ sont avantageux pour in vivo visualisation des microglies dans la rétine normale et pour la recherche sur les cellules microgliales/macrophage dynamique dans la maladie de la rétine,²¹. Les microglies sont les macrophages résidents de la rétine, qui jouent un rôle crucial sur l’homéostasie tissulaire et la réparation des tissus après blessure^1,25,26. Activation des microglies dans la rétine a été signalée dans les lésions rétiniennes, ischémie et dégénérescence, suggérant un rôle de ces cellules dans la maladie de la rétine^{2,3,4,5, 6}.

Le but du présent protocole est de décrire une méthode relativement simple pour la mesure d’épaisseur rétinienne à l’aide de SD-OCT et imagerie rétinienne et pour la visualisation des cellules de la microglie positive gfp dans la rétine de souris Cx3cr1^gfp/gfp à l’aide SLO (système Spectralis Heidelberg HRA + OCT). Ce protocole peut être utilisé pour les mesures de l’imagerie et l’épaisseur des rétines sains ou malades dans diverses lignées de souris. En outre, les analyses morphométriques peuvent être exécutées pour l’identification et la quantification des microglies numéros et l’activation des microglies dans la rétine à l’aide de SLO²¹. Les cellules de la microglie sont associées à des maladies dégénératives dans le système nerveux central (CNS), dont la rétine^27,28,29. Ainsi, en combinant les deux méthodes utilisées dans le présent protocole, corrélation des microglies distribution et dégénérescence rétinienne peut être faite, ce qui peut faciliter la surveillance gravité de la maladie ou l’efficacité de la thérapeutique des approches in vivo.

Protocole

dans toutes les procédures, les souris BALB/c adultes mâles et femelles qui expriment la gfp sous le promoteur de Cx3cr1 étaient utilisé ²⁴. Souris ont été traitées conformément à la déclaration d’ARVO sur l’utilisation des animaux dans ophtalmique et Vision Research et toutes les procédures ont été approuvées par le gouvernement suisse conformément à la réglementation fédérale suisse sur le bien-être Animal. Souris ont été anesthésiés par une injection sous-cutanée de chlorhydrate de médétomidine (0,75 mg/kg) et la kétamine (45 mg/kg). Bonne anesthésie a été confirmée par la surveillance de la fréquence respiratoire et l’animal ' réflexe s contre un pincement de la queue. À la fin des expériences, les souris ont été euthanasiés avec l’inhalation de CO ₂.

Remarque : effectuer chaque séance d’imagerie aussi rapidement que possible (maximum 20 min), depuis la formation de cataractes anesthésie suivant risquent d’entraver visualisation rétinienne ³⁰.

1. Configuration du système

1. allumer l’ordinateur.
2. Allumez l’alimentation. Le message " module d’acquisition de départ " apparaîtra sur l’écran du périphérique contrôle panneau.
3. Double-clic sur le raccourci sur le Bureau du logiciel afin d’exploiter le logiciel.
4. Dans la vue de base de données, cliquez sur le " ajouter patient " icône.
5. Dans la fenêtre pop-up, insérer toutes les informations nécessaires (nom, prénom, titre, date de naissance, sexe et patient-ID), puis cliquez sur " OK ". Dans la fenêtre pop la valeur de la courbure cornéenne à 2 mm et cliquez sur " OK ".
6. Positionner une lentille de plafonnier 78D standard ophtalmique sans contact fente devant l’optique standard de 30 ° et la fixer en toute sécurité avec du ruban adhésif.
7. S’assurer que le levier de filtre sur la gauche de l’appareil est positionné sur l’indication " A " pour permettre aux IR + OCT et AF imaging ( Figure 1).

2. Préparation de souris

1. utiliser une dose de chlorhydrate de médétomidine de 0,75 mg/kg et une kétamine dose de 45 mg/kg dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4) pour préparer la solution d’anesthésie. Ainsi, pour une souris de 20 g, mélanger 15 µL de chlorhydrate de médétomidine 18 µl de la kétamine pour un volume final de 50 µL dans du PBS. Conserver la solution à 4 ° C pendant une semaine.
2. Saisir la souris par la peau et appliquer une goutte de tropicamide 0,5 % + chlorhydrate de phényléphrine 2,5 % sur chaque œil pour atteindre la dilatation de la pupille.
3. Garder la souris maîtrisée et avec une seringue à insuline attachée à une aiguille de 30G, injecter 50 µL de la solution d’anesthésie par voie sous-cutanée. Remettre la souris dans sa cage qui est placé au-dessus d’un coussin chauffant. Attendre 3-5 min jusqu'à ce que la souris est entièrement sous sédation. Afin d’évaluer la profondeur de l’anesthésie, pincer la queue de la souris. Vérifier le réflexe cornéen en appuyant doucement sur la cornée de souris avec un coton-tige. Si aucun réflexe positive n’est observée, passez à l’imagerie.
   Remarque : Il est important de surveiller la fréquence respiratoire pendant l’anesthésie. Si la souris n’est pas entièrement sous sédation, la fréquence respiratoire augmente à un stimulus douloureux.
4. Hydrate la cornée de souris avec une application de 2 % hydroxypropylméthylcellulose gouttes sur chaque œil.

3. SD-OCT

1. Placez un patch au réchauffement d’environ 32 ° C sur la plate-forme sur mesure fixée sur la mentonnière de l’appareil ( Figure 1).
2. à l’image de le œil droit, placez votre souris sur la partie gauche de la plate-forme ( Figure 1). Faire en sorte que l’orbite droite de la souris fait face à la lentille et son corps se trouve sujette sur la partie gauche de la plate-forme.
3. Verser une goutte d’hydroxypropylméthylcellulose sur le œil droit et positionner avec soin une lentille de contact perméables dioptrique + 4 gaz rigide dessus (puissance sphérique :-25.00 à +25,00 dioptries). Stocker la lentille de contact dans une solution saline équilibrée (BSS). Pour attraper la lentille, utiliser des pinces en plastique ou en silicone pour éviter tout dommage.
4. Appuyez sur la zone jaune sur le coin droit de l’affichage du panneau contrôle pour démarrer le module d’acquisition (boîte verte sur la Figure 2 a). La boîte jaune deviendra verte et le menu du panneau de contrôle s’affiche sur l’écran ( Figure 2 a).
5. Pour l’acquisition de B-scans, sélectionnez l’option IR + OCT sur le panneau de configuration ( Figure 2 a). Paramètres sélectionnés sont mis en surbrillance en bleu sur le panneau de commande.
6. Select " Retina " sous " Application et la Structure " dans le logiciel et déplacer l’objectif vers l’oeil de la souris en utilisant le micromanipulateur sur l’appareil ( Figure 1). Avant de se concentrer sur la rétine, vérifier que l’indication " OD " est sélectionnée dans la partie inférieure gauche de l’écran. Le logiciel identifie automatiquement la gauche (OS) et le œil droit de (OD) basé sur la position de l’objectif.
   Remarque : Si l’objectif est positionné sur le milieu de la plate-forme, un message d’erreur s’affiche au bas de l’écran. Dans ce cas, repositionner la souris légèrement jusqu'à ce que le logiciel reconnaît l’oeil correcte.
7. Avec la molette de mise au point, se concentrer sur la rétine jusqu'à ce que les gros vaisseaux sont bien visibles dans l’image de fond sur la gauche de l’écran de l’ordinateur. Déplacer la caméra en tournant le micromanipulateur gauche ou droite, de déplacer la caméra dans cette direction, ou vers la droite ou vers la gauche, pour déplacer la caméra haut ou bas, respectivement.
   Remarque : Déplacer la souris sur la plate-forme ou déplacer la lentille vers le haut ou vers le bas pour atteindre la localisation privilégiée de la tête du nerf optique dans l’image infrarouge.
8. Tourner le bouton de sensibilité vers la gauche pour réduire ou vers la droite pour augmenter la luminosité de l’image de fond d’oeil. Lorsque la mise au point optimale est obtenue, un SD-OCT B-scan apparaîtra à droite de l’écran.
   Remarque : Si le B-scan ne peut pas être visualisé en ajustant la mise au point, appuyez sur la combinaison Ctrl + Alt + Maj + O sur le clavier. Dans la fenêtre pop-up, ajuster la valeur du bras Référence jusqu'à ce que le B-scan apparaît à l’écran.
9. Sur le bas à droite de l’écran, choisir le balayage unique dans le menu de configuration (seule ligne dans la Figure 2 b).
10. Tourner le micromanipulateur du dispositif ( Figure 1) gauche, droite, vers l’avant ou vers l’arrière (pour tourner la caméra dans cette direction) pour s’assurer que le B-scan se situe entre le haut et le bas les coins du SD-PTOM scan fenêtre.
11. La valeur automatique en temps réel (ART) sur au moins 9 pour obtenir des images de haute qualité.
    NOTE : ART améliore la qualité de l’image en faisant la moyenne plusieurs analyses consécutives. Le plus élevé du " ART " valeur, plus le rapport signal-bruit et donc la qualité d’image. Cependant, en augmentant la " ART " de valeur, l’acquisition de temps est également augmentée.
12. Presse la " acquérir " bouton ( Figure 2) sur l’écran du panneau contrôle et acquérir les images.
13. Re-positionner la souris pour l’image de le œil gauche et répétez les étapes 3.2-3.12.
14. Enlever les lentilles de contact avec une pince en plastique/silicone et placez-le dans le BSS.
15. Hydrater la cornée de souris avec une nouvelle goutte d’hydroxypropylméthylcellulose et enlevez le surplus avec un papier de soie.
16. Retirer l’optique standard 30 ° en la tournant dans le sens antihoraire.
17. Monter l’objectif de 55 ° et répétez les étapes 3,4-3.12 pour chaque oeil.

4. Auto Fluorescence Imaging

1. sans bouger la souris sur la plate-forme, sélectionnez IR sur le panneau de commande.
2. Avec la molette de mise au point, se concentrer sur les gros vaisseaux rétiniens.
3. Sur le panneau de configuration, sélectionnez AF.
4. Tourner le bouton de sensibilité vers la gauche pour réduire ou vers la droite pour augmenter la luminosité de l’image.
5. Presse le bouton de sensibilité et de la " ART " valeur de 67 ou plus pour obtenir la haute qualité des images.
6. Lorsque l’ensemble " ART " valeur a été atteinte, appuyez sur " acquérir " sur le panneau de contrôle en vue d’acquérir l’image. Appuyez sur le bouton de sensibilité pour arrêter une moyenne. Ajuster la mise au point, afin de visualiser les différentes couches rétiniennes.
7. Enlever la lentille de 55° et monter l’objectif de 102° grand champ. Suivez les étapes 4.1 – 4.6 pour les deux yeux de chaque souris et pour chaque souris.
8. Click “ enregistrer des images ” sur le bord supérieur gauche de la fenêtre puis cliquez sur “ sortie ”. Pour enregistrer les images dans l’ordinateur, sélectionnez la souris dans la liste sur la partie droite de l’écran en double cliquant sur le nom de la souris. Double cliquez sur chaque image séparément et puis cliquez sur l’icône de la disquette. Enregistrer l’image sous .tif, .bmp, .jpg ou .png au dossier souhaité. Pour sortir du logiciel sur “ fichiers ” et “ sortie ”.

5. Inversion de l’anesthésie

1. hydrater les yeux de souris avec une goutte d’hydroxypropylméthylcellulose et retourner la souris sur un coussin chauffant.
2. Solution Atipamézole Prepare dans une dose de 2,25 mg/kg à inverser les effets sédatifs du chlorhydrate de la médétomidine. Pour une souris de 20 g, ajouter 9 µL d’atipamezol dans un volume final de 150 µL PBS. Conserver la solution à 4 ° C pendant une semaine.
3. min après injection d’anesthésie (étape 2.2), injecter par voie sous-cutanée de 150 µL de solution d’Atipamézole.
4. Contrôler la souris jusqu'à ce que de l’anesthésie. Lorsque la souris est entièrement récupéré (5-10 min après l’injection d’Atipamézole) remettre dans sa cage. Récupération est indiquée par la capacité de l’animal à tourner son corps quand posé sur un côté, reprise de l’activité de marche et réagit en réponse à la stimulation de l’environnementale.

6. Mesure de l’épaisseur rétinienne manuel des Images SD-OCT

1. ouvrir le scan OCT en double-cliquant sur le nom de l’animal.
2. Ouvrir le B-scan obtenu avec l’objectif de 30 ° ou 55 °.
3. Choisissez " profil d’épaisseur ".
4. Presse la " modifier les Segmentations de couche " icône ( Figure 2 b). Le logiciel identifie la limite intérieure et membrane de base automatiquement.
5. Si nécessaire, corriger manuellement la position de la limite intérieure et la membrane de base. Pour ce faire, choisissez la couche à modifier par le côté gauche de l’écran, puis sur l’option de cercle rouge ( Figure 2 b). Déplacer le cercle avec le bouton de la souris enfoncée pour modifier la ligne.
6. Modifier la ligne pour positionner le calque correspondant correctement. Cliquez sur " enregistrer et fermer " pour fermer la fenêtre.
   Remarque : En raison de la réflectivité de la choroïde, le logiciel peut identifier la membrane de base incorrecte. Ainsi, il est préférable de la définir manuellement avant de procéder à des mesures d’épaisseur rétinienne.
7. Choisissez " Retina " sous la " couche " option. Un diagramme d’épaisseur rétinienne apparaîtra au bas de l’écran.
8. Cliquez sur un autre poste ou sur le diagramme, ou sur le B-scan pour voir l’épaisseur rétinienne (indiqué en µm) pour la position sélectionnée.
9. Mesurer l’épaisseur rétinienne à la distance souhaitée entre la tête du nerf optique et copier les valeurs dans une feuille de calcul.
10. Répétez les points 5.1 à 5.9 pour chaque souris pour les 30 ° et la lentille 55 °.
11. Effectuer des analyses statistiques avec le logiciel désiré.

Résultats

En utilisant le protocole présenté ici, SD-OCT scanne et SLO images ont été obtenues chez des souris Cx3cr1^gfp/gfp dans la même session d’imagerie. Figure 3 comprend représentant SD-OCT simples scans obtenus avec un 30 ° ou 55 ° lentille (Figure 3 a) et images représentatives de SLO obtenues avec un 55 ° ou une lentille de 102 °, où les cellules de la microglie positive gfp sont visualisées. R?...

Discussion

Le présent article montre un protocole pour l’acquisition de B-scans rétiniens et l’imagerie de gfp microglie positive distribution dans la rétine de souris dans la même session d’imagerie. SD-OCT et SLO sont de plus en plus utilisés dans des modèles animaux de la maladie de la rétine à fournir des informations d’altérations rétiniennes fois^10,14,17,18,

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectralis Imaging system (HRA+OCT)	Heidelberg Engineering, Germany	N/A	ophthalmic imaging platform system
Heidelberg Eye Explorer	Heidelberg Engineering, Germany	N/A	Version 1.9.13.0
78D standard ophthalmic non-contact slit lamp lens	Volk Optical Inc., Ohio, USA	V78C
Spectralis wide angle 55° lens	Heidelberg Engineering, Germany	50897-002
ultra widefield 102° lens	Heidelberg Engineering, Germany	50117-001
medetomidine hydrochloride 1 mg/mL (Domitor)	Provet AG, Lyssach, Switzerland	Swissmedic Nr. 50'590 - ATCvet: QN05CM91	anesthetic/analgesic
ketamine 50mg/ml (Ketalar)	Parke-Davis, Zurich, Switzerland	72276388	anesthetic
tropicamide 0.5% + phenylephrine HCl 2.5% (Augentropfen mix)	ISPI, Bern, Switzerland	N/A	pupil dilation
Omnican Insulin-50 0.5 ml G30 0.3 x 12mm	B. Braun Mesungen AG, Carl-Braun-Straße, Germany	9151125
hydroxypropylmethylcellulose (Methocel 2%)	OmniVision, Neuhausen, Switzerland	N/A
+4 dpt rigid gas permeable contact lens	Quantum I, Bausch + Lomb Inc., Rochester, NY	N/A	Base Curve: 7.20 to 8.40 mm Diameter: 9.00 / 9.60 / 10.20 mm Power: -25.00 to +25.00 Diopters
balanced salt solution (BSS)	Inselspital, Bern, Switzerland	N/A
silicon forceps	N/A	N/A
atipamezole 5 mg/mL (Antisedan)	Provet AG, Lyssach, Switzerland	N/A	α2 adrenergic receptor antagonist
GraphPad Prism 7	GraphPad Software, Inc, San Diego, CA, USA	N/A	statistical analysis software