אין ויוו הדמיה של עכברים כתב Cx3cr1gfp/gfp עם תחומים הספקטרום טומוגרפיה אופטית קוהרנטית, סריקת לייזר Ophthalmoscopy

Summary

פרוטוקול זה מתאר איך ברזולוציה גבוהה טכניקות הדמיה כגון טומוגרפיה אופטית קוהרנטית בתחום ספקטרלי, סריקת לייזר ophthalmoscopy יכול להיות מנוצל מכרסמים קטנים, באמצעות מערכת פלטפורמה אופטלמולוגיות הדמיה, כדי לקבל מידע על עובי רשתית, microglial תא הפצה, בהתאמה.

Abstract

טומוגרפיה אופטית קוהרנטית בתחום ספקטרלי (SD-אוקטובר) ו לייזר סריקה ophthalmoscopy (סלו) נמצאים בשימוש נרחב אופתלמולוגיה ניסיוני. בפרוטוקול הנוכחי, עכברים המבטאים ירוק (gfp) חלבון פלואורסצנטי תחת האמרגן של Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1^gfp/gfp) שימשו כדי התמונה מיקרוגלייה תאים ויוו ברשתית. מיקרוגלייה מקרופאגים תושב של הרשתית, היו מעורבים מספר מחלות רשתית^1,2,3,4,5,6. פרוטוקול זה מספקת גישה מפורטת לדור של B-הרשתית, עם SD-אוקטובר, הדמיה של התפלגות התא מיקרוגלייה בעכברים Cx3cr1^gfp/gfp עם סלו ויוו, באמצעות מערכת פלטפורמה אופטלמולוגיות הדמיה. הפרוטוקול יכול לשמש במספר שורות העכבר הכתב. עם זאת, ישנן כמה מגבלות בפרוטוקול המוצג כאן. ראשית, סלו וגם SD-אוקטובר, כאשר נעשה שימוש במצב ברזולוציה גבוהה, איסוף הנתונים עם מפוח ברזולוציה גבוהה אבל הרזולוציה לרוחב הוא נמוך (מיקרומטר 3.5 ו- 6 מיקרומטר, בהתאמה). יתר על כן, רמת המיקוד ורוויה סלו תלויה מאוד מבחר פרמטר, יישור נכון של העין. בנוסף, באמצעות התקנים שנועדו עבור חולים אנושיים בעכברים הוא מאתגר עקב גבוה סך כל הכוח האופטי של העין העכבר לעומת העין האנושית; זה יכול להוביל לרוחב ההגדלה אי דיוקים⁷, אשר תלויים גם ההגדלה שהעדשה העכבר בין היתר. עם זאת, למרות הסורק צירית במצב הזה הוא תלוי הגדלה לרוחב, המדידות SD-אוקטובר צירית מדויק⁸.

Introduction

עיניים ניסיוני, בחינת פתולוגיה ברשתית מחושבת בדרך כלל באמצעות טכניקות היסטולוגית. עם זאת, היסטולוגיה דורש euthanization בעלי חיים, עלול לגרום שינוי במאפיינים בפועל של הרקמה. SD-אוקטובר, סלו נעשה שימוש באופן שגרתי עיניים קליניים למטרות אבחון ועל הפיקוח על מחלות רשתית מספר כגון בצקת מקולרית סוכרתית⁹, קדמית נוירופתיה אופטית איסכמי¹⁰או רטיניטיס פיגמנטוזה¹¹ . SD-אוקטובר סלו טכניקות פולשני להפיק תמונות ברזולוציה גבוהה של הרשתית, אשר הם דמיינו דרך האישון מורחבים ללא התערבות נוספת בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. SD-אוקטובר מספק מידע של מבנה הרשתית ועובי הרשתית על ידי איסוף נתונים backscattering כדי ליצור תמונות חתך של הרשתית, בעוד סלו אוספת נתונים זריחה כדי להפיק תמונות חדות גבוהה סטריאוסקופי של הרשתית. כיום, בשתי הטכניקות משמשות יותר ויותר ניסיוני עיניים באמצעות מכרסמים קטנים^12,13,14,15 (או אפילו דג זברה^16,17) ויכול לספק גם מידע כמותיים^{12,17,18,19,20,21}.

הצטברות של אנדוגני fluorophores כמו lipofuscins או היווצרות של drusen ברשתית, ניתן לאבחן על ידי סלו כמו האות פלורסנט אוטומטית. תכונה זו הופכת סלו טכניקה יקר עבור אבחון וניטור של מחלות רשתית כמו ניוון מקולרי הקשור לגיל או רטיניטיס פיגמנטוזה^22,23. עיניים ניסיוני, זריחה אוטומטי הדמיה (AF) יכול לשמש עבור זיהוי סוגי תאים מסוים בקווים העכבר הכתב. לדוגמה, עכברים משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים עבור הביטוי של ה-gfp תחת האמרגן של Cx3cr1²⁴ הם יתרון עבור ויזואליזציה ויוו microglial תאים ברשתית נורמלי, החקירה של מיקרוגלייה/מקרופאג הדינמיקה של מחלות רשתית²¹. מיקרוגלייה הן המקרופאגים תושב של הרשתית, אשר לשחק תפקיד מכריע על הומאוסטזיס רקמות ותיקון רקמות על פציעה^1,25,26. מיקרוגלייה הפעלת ב הרשתית דווחה פגיעה ברשתית, איסכמיה, ניוון, רומז תפקיד של תאים אלה מחלות רשתית^{2,3,4,5, 6}.

מטרת הפרוטוקול הנוכחי היא לתאר שיטה פשוטה יחסית עבור הדמיה ברשתית ומדידה של עובי הרשתית בעזרת SD-אוקטובר ועבור ויזואליזציה של תאים מיקרוגלייה חיובי gfp באמצעות העכבר Cx3cr1^gfp/gfp רשתית סלו (היידלברג Spectralis HRA + OCT מערכת). פרוטוקול זה יכול להיות מנוצל עבור מדידות הדמיה ועובי של הרשתית בריא או חולה בקווים העכבר שונים. בנוסף, ניתן לבצע ניתוחים morphometric עבור וכימות של מספרים מיקרוגלייה והפעלה מיקרוגלייה ברשתית באמצעות סלו²¹. מיקרוגלייה התאים קשורים עם מחלות ניווניות של מערכת העצבים המרכזית (CNS), כולל^28,27,29הרשתית. כך, על ידי שילוב של שתי השיטות בשימוש בפרוטוקול הנוכחי, המתאם של מיקרוגלייה הפצה, ניוון הרשתית יכול להתבצע, אשר יכול להקל על חומרת המחלה ניטור או יעילות טיפולית גישות vivo.

Protocol

בכל ההליכים, BALB/c למבוגרים זכר ונקבה של עכברים אקספרס gfp תחת האמרגן של Cx3cr1 היו בשימוש ²⁴. עכברים טופלו על-פי ארוו שימוש בבעלי חיים של לרפואת עיניים ומחקר חזון ואושרו בכל ההליכים מהממשלה השוויצרי על פי הוראות השוויצרי הפדראלי על צער. עכברים היו ומורדמת באמצעות זריקה תת עורית של medetomidine הידרוכלוריד (0.75 מ ג/ק ג), קטמין (45 מ"ג/ק"ג). הרדמה. ראויה אושר ע י ניטור את קצב הנשימה ואת החיה ' s רפלקס נגד קמצוץ הזנב. בסוף הניסויים, עכברים היו מורדמים עם שאיפת ₂ CO.

הערה: לבצע כל מושב הדמיה בהקדם האפשרי (מקסימום 20 דקות), מאז היווצרות קטרקט הרדמה הבאות עשויה לרסן ויזואליזציה ברשתית ³⁰.

1. תצורת המערכת

1. להפעיל את המחשב.
2. הפעל את אספקת החשמל. ההודעה " מודול התחלה " יופיעו על המסך בלוח הבקרה של ההתקן.
3. לחיצה כפולה על קיצור הדרך בשולחן העבודה כדי להפעיל את התוכנה של התוכנה-
4. בתצוגה ' מסד נתונים ', לחץ " להוסיף החולה " סמל.
5. בחלון מוקפץ, להוסיף כל המידע הנחוץ (שם משפחה, שם פרטי, כותרת, תאריך לידה, סקס, החולה-ID) ולחץ על " טוב ". על חלון פופ מוגדר עקמומיות הקרנית של 2 מ מ, לחץ על " טוב ".
6. למקם עדשה מנורה רגיל חתוך ללא מגע אופטלמולוגיות 78D מול הראייה תקן 30 ° ותחברי אותו בבטחה עם קלטת.
7. לוודא כי המנוף מסנן בצד השמאלי של המכשיר מוצב הסימן " A " כדי לאפשר IR + OCT והן AF הדמיה ( איור 1).

2. העכבר הכנה

1. שימוש מנה הידרוכלוריד medetomidine של 0.75 mg/kg, קטמין מנה של 45 מ"ג/ק"ג ב באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS, pH 7.4) להכין פתרון הרדמה. לכן, בשביל עכבר 20 גרם, מערבבים 15 µL של medetomidine הידרוכלוריד עם 18 µL של קטמין לאמצעי הסופי של µL 50 ב- PBS. לאחסן את הפתרון ב 4 ° C עד לשבוע אחד.
2. לתפוס את העכבר יתלה ולהחיל טיפה אחת של tropicamide 0.5% + phenylephrine הידרוכלוריד 2.5% על כל עין כדי להשיג נורמאליות.
3. להשאיר את העכבר מאופקת, עם מזרק אינסולין קשורה מחט 30 גרם, להזריק µL 50 של הפתרון הרדמה subcutaneously. לשים את העכבר לכלוב הממוקמים מעל כרית החימום. יש להמתין 3-5 דקות עד העכבר הוא תרופות הרגעה. כדי להעריך את עומק הרדמה, לצבוט את הזנב של העכבר. בדוק את הקרנית על ידי נגיעה בעדינות את הקרנית העכבר באמצעות מקלון צמר גפן. אם אין רפלקס חיובי נצפית, המשך עם ההדמיה.
   הערה: חשוב לעקוב אחר קצב נשימה במהלך הרדמה. אם העכבר הוא לא תחת תרופות הרגעה, קצב הנשימה יגדל על גירוי מכאיב.
4. מימה הקרנית עכבר עם יישום של 2% hydroxypropylmethylcellulose טיפות על כל עין.

3. SD-אוקטובר

1. במקום תיקון ההתחממות של 32 ° C על פלטפורמת בהזמנה המצורפת במנוחה הסנטר של המכשיר ( איור 1).
2. את תמונת עין ימין, מקם את העכבר על החלק השמאלי של פלטפורמת ( איור 1). להבטיח כי המסלול הנכון של העכבר פונה העדשה, הגוף שלו טמון שכיבה על החלק השמאלי של פלטפורמת ה-
3. למרוח טיפה של hydroxypropylmethylcellulose על עין ימין ומקם בזהירות גז נוקשה +4 כוחן חדיר עדשות מגע על זה (כדורי כוח:-25.00 כדי +25.00 diopters). אחסן את עדשת המגע של תמיסת מלח מאוזנת (BSS). כדי לתפוס את העדשה, להשתמש מלקחיים פלסטיק או סיליקון כדי למנוע נזק.
4. הקש על התיבה הצהובה בפינה הימנית בתצוגת לוח הבקרה כדי להפעיל את המודול רכישה (הקופסה הירוקה על איור 2A). התיבה הצהובה יפנו ירוק, ' מתפריט החלונית ' בקרה ' יופיע על המסך ( איור 2 א).
5. עבור רכישת B סריקות, בחר את האפשרות IR + OCT בחלונית ' בקרה ' ( איור 2 א). הגדרות שנבחרו מסומנות בכחול על לוח הבקרה.
6. בחר " רשתית " תחת " יישום, מבנה " התוכנה ואת מהלך העדשה לכיוון העין העכבר באמצעות את micromanipulator על המכשיר ( איור 1). לפני התמקדות על הרשתית, בדוק את הסימן " OD " נבחרה בחלק השמאלי התחתון של המסך. התוכנה מזהה באופן אוטומטי משמאל (OS), העין הימנית (OD) בהתבסס על המיקום של המטרה.
   הערה: אם המטרה היא ממוצבת על האמצע של הפלטפורמה, הודעת שגיאה תופיע בתחתית המסך. במקרה כזה, ולמקם מחדש את העכבר מעט עד שהתוכנה מזהה את העין הנכונה.
7. עם הידית להתמקד, להתמקד על הרשתית עד כלי גדול נראים בבירור בתמונה הפונדוס בצד השמאל של מסך המחשב. להזיז את המצלמה על-ידי הפעלת את micromanipulator שמאלה או ימינה, כדי להעביר את המצלמה בכיוון הזה, או בכיוון השעון או נגד כיוון השעון, כדי להזיז את המצלמה למעלה או למטה, בהתאמה.
   הערה: מיקום העכבר על הפלטפורמה או להזיז את העדשה כלפי מעלה או כלפי מטה כדי להשיג לוקליזציה המועדפת של ראש עצב הראייה בתמונה אינפרא-אדום.
8. סובב את רגישות נגד כיוון השעון כדי להפחית או בכיוון השעון, כדי להגדיל את הבהירות של התמונה הפונדוס. כאשר ההתמקדות אופטימלית היא מושגת, SD-OCT B-בסריקה יופיע בצד ימין של המסך.
   הערה: אם B-הסריקה, לא ניתן לאבחן על ידי התאמת את המוקד, להקיש את הצירוף Ctrl + Alt + Shift + O במקלדת. בחלון הנפתח, התאם את הערך של הזרוע הפניה עד B-הסריקה מופיעה על המסך.
9. על החלק התחתון של המסך, בחר את הסריקה יחיד ' מתפריט ' תבנית (קו בודד באיור 2B).
10. להפוך את micromanipulator של המכשיר ( איור 1), שמאלה, ימינה, קדימה או לאחור (כדי להפעיל את המצלמה בכיוון הזה) על מנת להבטיח כי הסריקה B ממוקם בין החלק העליון והחלק התחתון פינות של ה-SD-OCT לסרוק חלון.
11. להגדיר את ערך בזמן אמת אוטומטיים (אמנות) לפחות 9 כדי להשיג תמונות באיכות גבוהה-
    הערה: אמנות משפר את איכות התמונה על-ידי חישוב ממוצע מספר סריקות רציפות. גבוה יותר " אמנות ", ערך, גבוה יותר את יחס אות לרעש ולכן איכות התמונה. עם זאת, על ידי הגדלת " אמנות " ערך, השלימה את רכישת זמן הוא גם גדל.
12. העיתונות " לרכוש " כפתור ( איור 2) על המסך בלוח הבקרה ולרכוש את התמונות.
13. ולמקם מחדש את העכבר תמונה של עין שמאל, חזור על השלבים 3.2-3.12.
14. להסיר את עדשות המגע עם פלסטיק/סיליקון מלקחיים ומניחים אותו לתוך BSS-
15. מימה הקרנית עכבר עם טיפת טריים hydroxypropylmethylcellulose ולהסיר את העודפים עם נייר טישו.
16. להסיר את הראייה תקן 30 מעלות על-ידי סיבוב נגד כיוון השעון.
17. הר העדשה 55 ° וחזור על שלבים 3.4-3.12 עבור כל עין.

4. אוטומטי פלורסצנטיות הדמיה

1. מבלי להזיז את העכבר על הרציף, בחר IR בלוח הבקרה.
2. עם הידית להתמקד, להתמקד בכלי הדם ברשתית גדול.
3. בלוח הבקרה בחר AF.
4. סובב את רגישות נגד כיוון השעון כדי להפחית או בכיוון השעון, כדי להגדיל את הבהירות של התמונה.
5. להקיש על כפתור רגישות ולהגדיר " אמנות " ערך לתמונות 67 או יותר כדי לקבל איכות גבוהה-
6. כאשר ערכת " אמנות " ערך הגיעה, הקש " לרכוש " בלוח הבקרה כדי לרכוש את התמונה. להקיש על כפתור רגישות שוב להפסיק בממוצע. להתאים את המוקד, לדמיין שכבות הרשתית שונות.
7. להסיר את העדשה 55° והר העדשה 102 מעלות שדה רחב. בצע שלבים 4.1 – 4.6 בשתי העיניים של כל עכבר ועבור כל עכבר.
8. לחץ “ לשמור תמונות ” בגבול העליון השמאלי של החלון ולאחר מכן לחץ על “ יציאה ”. כדי לשמור את התמונות במחשב, בחר את העכבר מתוך הרשימה החלק הימני של המסך על ידי לחיצה כפולה על שם העכבר. לחץ פעמיים על כל תמונה בנפרד ולאחר מכן לחץ על סמל התקליטור תקליטונים. לשמור את התמונה כקובץ. tif,. bmp,. jpg או. png על התיקיה הרצויה. כדי לצאת העיתונות תוכנה “ קובץ ” ו “ יציאה ”.

5. היפוך הרדמה

1. מימה עם טיפה אחת של hydroxypropylmethylcellulose העיניים העכבר ולהחזיר את העכבר על משטח חימום.
2. פתרון atipamezole להכין מנה של 2.25 מ"ג/ק"ג להיפוך ההשפעות הרגעה של medetomidine הידרוכלוריד. עכבר 20 גרם, להוסיף µL 9 של atipamezol נפח סופי של 150 µL PBS. לאחסן את הפתרון ב 4 ° C עד לשבוע אחד.
3. דקות לאחר ההזרקה בהרדמה (שלב 2.2), להזריק 150 µL של פתרון atipamezole subcutaneously.
4. לפקח על העכבר עד ההתאוששות מן ההרדמה. כאשר העכבר הוא התאושש באופן מלא (5-10 דקות לאחר ההזרקה atipamezole) להחזיר אותו בכלוב. שחזור שציין את היכולת של החיה כדי להפעיל את הגוף שלו הניח בצד אחד, החזרת של הליכה פעילות, ומגיבים בתגובה לגירוי סביבתי-

6. מדידת עובי הרשתית ידנית מתמונות SD-אוקטובר

1. לפתוח את הסריקה OCT על ידי לחיצה כפולה על השם של החיה.
2. פתח ב'-הסריקה שהושג עם העדשה 30 מעלות או 55 °-
3. בחר " עובי הפרופיל ".
4. העיתונות " לערוך שכבה Segmentations " סמל ( איור 2B). התוכנה באופן אוטומטי מזהה את הגבלת הפנימי, לבסס את הממברנה.
5. במידת הצורך, לתקן באופן ידני את המיקום של הגבלת הפנימי לבסס ממברנה. לשם כך, בחר את השכבה כדי להיות שונה מהצד השמאלי של המסך ולאחר מכן באפשרות עיגול אדום ( איור 2B). להזיז העיגול עם לחצן העכבר לחוץ כדי לשנות את הקו-
6. לשנות את הקו כדי למקם את השכבה המתאימה בצורה נכונה. לחץ על " שמור וסגור " כדי לצאת מהחלון.
   הערה: בשל השתקפות של דמית, התוכנה עשויה לזהות את קרום הבסיס באופן שגוי. לכן, עדיף להגדיר את זה באופן ידני לפני שתמשיך עובי הרשתית למדידות.
7. בחר " רשתית " תחת " שכבה " אפשרות. דיאגרמה של עובי הרשתית יופיע בתחתית המסך.
8. לחץ על עמדה שונה הדיאגרמה או על B-scan כדי להציג את עובי הרשתית (מסומן במיקרומטר) עבור המיקום שנבחר.
9. למדוד את עובי רשתית בהמרחק הרצוי בין ראש עצב הראייה, להעתיק את הערכים בגיליון.
10. חזור על השלבים 5.1-5.9 עבור כל בעכבר על 30 מעלות והן את העדשה 55 °-
11. לבצע ניתוח סטטיסטי בתוכנה הרצויה.

תוצאות

באמצעות פרוטוקול המובאת כאן, SD-אוקטובר ואבחון סלו תמונות התקבלו Cx3cr1^gfp/gfp עכברים במהלך אותה הפעלה של הדמיה. איור 3 כולל SD נציג-סריקות יחיד שהושג עם 30 מעלות או עדשה 55 ° (איור 3 א) ותמונות סלו נציג שהושג עם 55 ° או עדשה 102 °, איפה הם דמיינ?...

Discussion

המאמר הנוכחי מדגים פרוטוקול עבור הרכישה של הרשתית B והדמיה של הפצה חיובית מיקרוגלייה gfp ברשתית העכבר במהלך אותה הפעלה של הדמיה. SD-אוקטובר, סלו משמשים יותר ויותר במודלים חייתיים של מחלות רשתית לספק מידע של שינויים ברשתית מעל הזמן^10,14,17,

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectralis Imaging system (HRA+OCT)	Heidelberg Engineering, Germany	N/A	ophthalmic imaging platform system
Heidelberg Eye Explorer	Heidelberg Engineering, Germany	N/A	Version 1.9.13.0
78D standard ophthalmic non-contact slit lamp lens	Volk Optical Inc., Ohio, USA	V78C
Spectralis wide angle 55° lens	Heidelberg Engineering, Germany	50897-002
ultra widefield 102° lens	Heidelberg Engineering, Germany	50117-001
medetomidine hydrochloride 1 mg/mL (Domitor)	Provet AG, Lyssach, Switzerland	Swissmedic Nr. 50'590 - ATCvet: QN05CM91	anesthetic/analgesic
ketamine 50mg/ml (Ketalar)	Parke-Davis, Zurich, Switzerland	72276388	anesthetic
tropicamide 0.5% + phenylephrine HCl 2.5% (Augentropfen mix)	ISPI, Bern, Switzerland	N/A	pupil dilation
Omnican Insulin-50 0.5 ml G30 0.3 x 12mm	B. Braun Mesungen AG, Carl-Braun-Straße, Germany	9151125
hydroxypropylmethylcellulose (Methocel 2%)	OmniVision, Neuhausen, Switzerland	N/A
+4 dpt rigid gas permeable contact lens	Quantum I, Bausch + Lomb Inc., Rochester, NY	N/A	Base Curve: 7.20 to 8.40 mm Diameter: 9.00 / 9.60 / 10.20 mm Power: -25.00 to +25.00 Diopters
balanced salt solution (BSS)	Inselspital, Bern, Switzerland	N/A
silicon forceps	N/A	N/A
atipamezole 5 mg/mL (Antisedan)	Provet AG, Lyssach, Switzerland	N/A	α2 adrenergic receptor antagonist
GraphPad Prism 7	GraphPad Software, Inc, San Diego, CA, USA	N/A	statistical analysis software