En Vivo Proyección de imagen de ratones de reportero Cx3cr1gfp/gfp con tomografía de coherencia óptica de dominio espectral y exploración oftalmoscopia de láser

Resumen

Este protocolo describe cómo alta resolución técnicas imagenológicas como una tomografía de coherencia óptica de dominio espectral y exploración oftalmoscopia de láser puede ser utilizada en pequeños roedores, utilizando un sistema de plataforma imagen oftálmica, para obtener información sobre espesor retiniano y microglía células distribución, respectivamente.

Resumen

Tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT) y exploración oftalmoscopia de láser (SLO) son ampliamente utilizados en Oftalmología experimental. En el presente Protocolo, los ratones que expresaban verde proteína fluorescente (gfp) bajo el promotor de Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1^gfp/gfp) fueron utilizados para una imagen de microglia células en vivo en la retina. Microglia son macrófagos residentes de la retina y han sido implicados en varias enfermedades de la retina^1,2,3,4,5,6. Este protocolo proporciona un enfoque detallado para la generación de retina B-SCAN, con SD-OCT y proyección de imagen de la distribución de células de la microglia en ratones Cx3cr1^gfp/gfp con SLO en vivo, utilizando un sistema de plataforma de imagen oftálmica. El protocolo puede utilizarse en varias líneas de ratón reportero. Sin embargo, existen algunas limitaciones en el protocolo presentado aquí. En primer lugar, SLO tanto SD-OCT, cuando se utiliza en el modo de alta resolución, recogemos datos con alta resolución axial, pero la resolución lateral son menores (3,5 μm y 6, respectivamente). Por otra parte, el nivel de enfoque y saturación en SLO es altamente dependiente de la selección de parámetros y la correcta alineación de los ojos. Además, uso de dispositivos diseñados para pacientes humanos en ratones es difícil debido al mayor poder óptico total del ojo de ratón en comparación con el ojo humano; Esto puede conducir al lateral aumento inexactitudes⁷, que también son dependientes en la magnificación de la lente del ratón entre otros. Sin embargo, a pesar de que la exploración axial posición depende del aumento lateral, las medidas de SD-OCT axiales son precisas⁸.

Introducción

En la oftalmología experimental, examen de patología retiniana se evalúa generalmente utilizando técnicas histológicas. Sin embargo, la histología requiere euthanization animal y puede causar alteración de las propiedades reales del tejido. SD-OCT y SLO se utilizan habitualmente en Oftalmología Clínica para el diagnóstico y para el control de varias enfermedades de la retina como el edema macular diabético⁹, neuropatía óptica isquémica anterior¹⁰o retinitis pigmentosa¹¹ . SD-OCT y SLO son técnicas no invasivas que generan imágenes de alta resolución de la retina, que se visualizan a través de la pupila dilatada sin otra intervención. SD-OCT proporciona información de la estructura retiniana y grueso retiniano por la recogida de datos de retrodispersión para crear imágenes transversales de la retina, mientras que SLO recoge datos de fluorescencia para producir imágenes estereoscópicas de alto contraste de la retina. En la actualidad, ambas técnicas son cada vez más utilizados en Oftalmología experimental con roedores pequeños^12,13,14,15 (o incluso de^16,de pez cebra¹⁷) y puede proporcionar tanto información cualitativa y cuantitativa^{12,17,18,19,20,21}.

Acumulación de fluoróforos endógenos como el lipofuscins o la formación de drusas en la retina puede ser visualizada por SLO como señal fluorescente auto. Esta característica hace que SLO una técnica valiosa para diagnóstico y seguimiento de enfermedades retinianas como la degeneración macular o retinosis pigmentaria^22,23. En la oftalmología experimental, fluorescencia automático (AF) la proyección de imagen puede utilizarse para la detección de tipos de células específicos en líneas de ratón reportero. Por ejemplo, los ratones heterocigotos para la expresión de gfp bajo el promotor de Cx3cr1²⁴ son ventajosas para la visualización en vivo de las células microgliales en la retina normal y para la investigación de microglia/macrófagos dinámica de la enfermedad retiniana²¹. Microglia son los macrófagos residentes de la retina, que juegan un papel fundamental en la homeostasis del tejido y reparación del tejido con lesión^1,25,26. Activación de la microglia en la retina se ha divulgado en lesiones de retina, isquemia y degeneración, sugiriendo un papel de estas células en la enfermedad retiniana^{2,3,4,5, 6}.

El objetivo del presente Protocolo es describir un método relativamente simple para la medición del espesor retiniano con SD-OCT y la proyección de imagen retiniana y para la visualización de gfp positivas microglía las células en la retina de ratón Cx3cr1^gfp/gfp utilizando SLO (sistema de Heidelberg Spectralis HRA + OCT). Este protocolo puede ser utilizado para medir la proyección de imagen y el grosor de retinas sanas o enfermas en varias líneas de ratón. Además, pueden realizarse análisis morfométricos para la identificación y cuantificación de números de microglia y activación de la microglia en la retina con SLO²¹. Las células de la microglia se asocian con enfermedades degenerativas de sistema nervioso central (SNC), incluyendo la retina^27,28,29. Así, combinando los dos métodos utilizados en el presente Protocolo, correlación de la distribución de la microglía y degeneración retiniana se puede hacer, que puede facilitar el monitoreo severidad de la enfermedad o la efectividad de la terapéutica aproxima en vivo.

Protocolo

en todos los procedimientos, ratones BALB/c adultos masculinos y femeninos que expresan gfp bajo el promotor de Cx3cr1 fueron usadas ²⁴. Ratones fueron tratados según la declaración de ARVO para el uso de animales en oftálmica y la investigación de la visión y todos los procedimientos fueron aprobados por el Gobierno suizo según las reglamentaciones federales suizos en Bienestar Animal. Ratones fueron anestesiados mediante una inyección subcutánea de hidrocloruro de medetomidina (0,75 mg/kg) y ketamina (45 mg/kg). Anestesia adecuada fue confirmada mediante el control de la frecuencia respiratoria y el animal ' reflejo de s contra una pizca de cola. Al final de los experimentos ratones fueron sacrificados con la inhalación de CO ₂.

Nota: realizar cada sesión de imagen lo antes posible (máximo 20 min), desde la formación de cataratas después de la anestesia pueden obstaculizar la visualización retina ³⁰.

1. configuración del sistema

1. encienda el ordenador.
2. Encender la fuente de alimentación. El mensaje de " módulo de adquisición de inicio " aparecerán en la pantalla del dispositivo control panel.
3. Haga doble clic en acceso directo del escritorio del software para operar el software.
4. En la vista de base de datos, haga clic en el " añadir paciente " icono.
5. En la ventana emergente, introduzca toda la información necesaria (apellido, nombre, título, fecha de nacimiento, sexo y paciente-ID) y haga clic en " ok ". En la ventana emergente selecciona la curvatura corneal 2 mm y haga clic en " ok ".
6. Colocar una lente de lámpara estándar oftálmico sin contacto raja D 78 frente a la óptica estándar 30 ° y fijarla con seguridad con cinta de.
7. Asegúrese de que la palanca del filtro a la izquierda del dispositivo se coloca en la indicación de " A " IR + OCT y AF imagen ( figura 1).

2. Preparación de mouse

1. uso una dosis de clorhidrato de medetomidina de 0,75 mg/kg y ketamina a dosis de 45 mg/kg en solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) a preparar la solución de la anestesia. Así, para un ratón de 20 g, mezcla 15 μl de hidrocloruro de medetomidina con 18 μL de ketamina a un volumen final de 50 μl de PBS. Almacenar la solución a 4 ° C hasta una semana.
2. Tome el ratón por el pescuezo y aplique una gota de tropicamida 0.5% + fenilefrina clorhidrato 2.5% en cada ojo para lograr la dilatación de la pupila.
3. Mantener el ratón refrenado y con una jeringa de insulina unida a una aguja de 30G, inyectar 50 μl de la solución de anestesia por vía subcutánea. Poner el ratón en su jaula que se coloca encima de una almohada. Espere 3-5 min hasta que el ratón es totalmente sedado. Evaluar la profundidad anestésica, pellizcar la cola del ratón. Comprobar el reflejo corneal al tocar suavemente la córnea de ratón con un hisopo de algodón. Si no se observa el reflejo positivo, continuar con la proyección de imagen de.
   Nota: Es importante controlar la frecuencia respiratoria durante la anestesia. Si el ratón no está totalmente sedado, la frecuencia respiratoria aumenta a un estímulo doloroso.
4. Hidrato de la córnea de ratón con una aplicación de hidroxipropilmetilcelulosa 2% gotas en cada ojo.

3. SD-OCT

1. Coloque un parche de calentamiento de aproximadamente 32 ° C en la plataforma a medida en resto de barbilla del dispositivo ( figura 1).
2. a la imagen del ojo derecho, coloque el ratón en la parte izquierda de la plataforma ( figura 1). Asegúrese de que la órbita derecha del ratón enfrenta a la lente y su cuerpo se encuentra propenso en la parte izquierda de la plataforma de.
3. Aplique una gota de hidroxipropilmetilcelulosa en el ojo derecho y coloque una lente de contacto de + 4 dioptrías rigidos gas permeable en él (energía esférica:-25.00 a +25,00 dioptrías). Guarde las lentes de contacto en solución salina balanceada (BSS). Para obtener el objetivo, usar pinzas de plástico o silicona para evitar daños.
4. Presione el cuadro amarillo en la esquina derecha de la pantalla del panel de control para iniciar el módulo de adquisición (recuadro verde en la figura 2A). El cuadro amarillo se vuelve verde y el menú del panel control aparecerá en la pantalla ( figura 2A).
5. Para la adquisición de B-SCAN, seleccione la opción IR + OCT en el panel de control ( figura 2A). Ajustes seleccionados se resaltarán en azul en el panel de control.
6. Select " Retina " bajo " aplicación y la estructura " en el software y mover la lente hacia el ojo de ratón utilizando el instrumental quirúrgico en el dispositivo ( figura 1). Antes de enfocar sobre la retina, verifique que la indicación " OD " se selecciona en la parte inferior izquierda de la pantalla. El software identifica automáticamente a la izquierda (SO) y el ojo derecho (OD) en función de la posición del objetivo.
   Nota: Si el objetivo está situado en el centro de la plataforma, un mensaje de error aparecerá en la parte inferior de la pantalla. En ese caso, vuelva a colocar el ratón ligeramente hasta que el software reconoce el ojo correcto.
7. Con la perilla de enfoque, enfoque en la retina hasta que los vasos grandes se ven claramente en la imagen de fondo a la izquierda de la pantalla del ordenador. Mover la cámara girando el micromanipulador izquierda o derecha para mover la cámara en esa dirección, o hacia la derecha o hacia la izquierda, para mover la cámara hacia arriba o abajo, respectivamente.
   Nota: Colocar el ratón en la plataforma o mover la lente hacia arriba o hacia abajo para lograr la localización preferida de la cabeza del nervio óptico en la imagen infrarroja.
8. Gire la perilla de sensibilidad hacia la izquierda para disminuir o hacia la derecha para aumentar el brillo de la imagen de fondo. Cuando se logra el enfoque óptimo, un SD-OCT B-scan aparecerá a la derecha de la pantalla.
   Nota: Si el B-scan no se pueden visualizar por ajustar el enfoque, presionar la combinación Ctrl + Alt + Mayús + O en el teclado. En la ventana emergente, ajustar el valor del brazo de referencia hasta que el B-scan aparece en la pantalla.
9. En la parte inferior derecha de la pantalla, seleccione la exploración solo en el menú de patrón (sola línea en la figura 2B).
10. Gire el micromanipulador del dispositivo ( figura 1) izquierda, derecha, adelante o hacia atrás (para apagar la cámara en ese sentido) para asegurarse de que el B-scan se encuentra entre la parte superior e inferior las esquinas de la SD-OCT exploración ventana.
11. Define el valor de automático en tiempo real (arte) por lo menos 9 para obtener imágenes de alta calidad.
    Nota: Arte mejora la calidad de la imagen promediando varias exploraciones consecutivas. Mayor el " arte " valor, cuanto mayor sea la relación señal a ruido y así la calidad de imagen. Sin embargo, al aumentar la " arte " valor, la adquisición también se aumenta el tiempo.
12. Prensa del " adquirir " botón ( figura 2) en la pantalla del panel de control y adquisición de las imágenes.
13. Volver a colocar el ratón para el ojo izquierdo de la imagen y repita los pasos 3.2-3.12.
14. Quitar la lente de contacto con pinzas de plástico/silicona y coloque en BSS.
15. Hidratar la córnea de ratón con una gota fresca de hidroxipropilmetilcelulosa y retirar el exceso con un papel de seda.
16. Quitar la óptica estándar 30 ° girando hacia la izquierda.
17. Montaje de la lente de 55 ° y repita los pasos 3.4-3.12 para cada ojo.

4. Auto fluorescencia de imagen

1. sin mover el ratón sobre la plataforma, seleccione IR en el panel de control.
2. Con la perilla de enfoque, centrarse en los grandes vasos retinianos.
3. En el panel de control seleccione AF.
4. Antihorario, la perilla de sensibilidad para reducir o derecha para aumentar el brillo de la imagen.
5. Presione la perilla de sensibilidad y ponga el " arte " valor a imágenes 67 o más para obtener alta calidad.
6. Cuando el conjunto " arte " alcanzado valor, presione " adquirir " del panel de control para la adquisición de la imagen. Presione la perilla de sensibilidad otra vez para dejar un promedio de. Ajustar el enfoque, para visualizar diferentes capas retinianas.
7. Quitar la lente de 55° y montaje de la lente de campo amplio 102°. Siga los pasos 4.1 – 4.6 para ambos ojos de cada ratón y para cada ratón.
8. Clic “ guardar imágenes ” en el borde superior izquierdo de la ventana y haga clic en “ salida ”. Para guardar las imágenes en el ordenador, seleccione el ratón de la lista en la parte derecha de la pantalla haciendo doble clic sobre el nombre de ratón. Haga doble clic en cada imagen por separado y luego haga clic en el icono del disco flexible. Guarda la imagen como .tif, .bmp, .jpg o .png en la carpeta deseada. Para salir de la prensa de software “ archivos ” y “ salir de ”.

5. Reversión de anestesia

1. hidratar los ojos del ratón con una gota de hidroxipropilmetilcelulosa y regresar el ratón sobre una almohadilla caliente.
2. Prepare solución de atipamezole en una dosis de 2,25 mg/kg para revertir los efectos sedativos de hidrocloruro de medetomidina. Para un ratón de 20 g, añadir 9 μl de atipamezol en un volumen final de 150 μL PBS. Almacenar la solución a 4 ° C hasta una semana.
3. min después de la inyección de anestesia (paso 2.2), inyectar en forma subcutánea 150 μL de solución de atipamezole.
4. Controlar el ratón hasta la recuperación de la anestesia. Cuando el ratón está totalmente recuperado (5-10 min después de la inyección de atipamezole) poner de nuevo en su jaula. Recuperación indica la capacidad del animal a su cuerpo cuando se colocan a un lado, recuperar de la poca actividad y reaccionando en respuesta a la estimulación ambiental.

6. Medición manual de espesor retiniano de imágenes SD-OCT

1. abrir la exploración OCT haciendo doble clic sobre el nombre de los animales.
2. Abrir el B-scan con la lente de 30 ° o 55 °.
3. Elegir " Perfil de espesor ".
4. Prensa del " editar capa segmentaciones " icono ( figura 2B). El software automáticamente identifica la limitación interna y membrana de la base.
5. Si es necesario, corregir manualmente la posición de la limitación interna y base de la membrana. Para hacerlo, seleccione la capa a modificar desde el lado izquierdo de la pantalla y luego la opción de círculo rojo ( figura 2B). Mover el círculo con el botón del ratón presionado para modificar la línea de.
6. Modifique la línea para posicionar correctamente la capa correspondiente. Haga clic " guardar y cerrar " para salir de la ventana.
   Nota: Debido a la reflectividad de la coroides, el software puede identificar incorrectamente la membrana base. Por lo tanto, es preferible definir manualmente antes de proceder a mediciones del espesor retiniano.
7. Elegir " Retina " en la " capa de " opción. Un diagrama del grueso retiniano aparece en la parte inferior de la pantalla.
8. Haga clic en una posición diferente en el diagrama o en el B-scan para ver el grosor retiniano (indicado en μm) para la posición seleccionada.
9. Medir el grosor retiniano en la distancia deseada de la cabeza del nervio óptico y copiar los valores de una hoja de cálculo.
10. Repita los pasos 5.1-5.9 de cada ratón por el 30 ° y la lente de 55 °.
11. Realizar el análisis estadístico con software deseada.

Resultados

Utilizando el protocolo presentado aquí, SD-OCT escanea y SLO imágenes fueron obtenidas de ratones Cx3cr1^gfp/gfp en la misma sesión de proyección de imagen. Figura 3 incluye representante SD-OCT solo exploraciones obtenidas con un 30 ° o una lente de 55 ° (Figura 3A) e imágenes representativas de SLO obtuvieron con 55 ° o a 102 ° del objetivo, donde se visualizan las células de microglía positivo d...

Discusión

El presente artículo muestra un protocolo para la adquisición de B-SCAN retiniana y la proyección de imagen de gfp distribución de positivo de la microglia en la retina de ratón en la misma sesión de proyección de imagen. SD-OCT y SLO utilizan cada vez más en modelos animales de enfermedad retiniana para proporcionar información de las alteraciones retinianas por tiempo^{10,14,17,18...}

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectralis Imaging system (HRA+OCT)	Heidelberg Engineering, Germany	N/A	ophthalmic imaging platform system
Heidelberg Eye Explorer	Heidelberg Engineering, Germany	N/A	Version 1.9.13.0
78D standard ophthalmic non-contact slit lamp lens	Volk Optical Inc., Ohio, USA	V78C
Spectralis wide angle 55° lens	Heidelberg Engineering, Germany	50897-002
ultra widefield 102° lens	Heidelberg Engineering, Germany	50117-001
medetomidine hydrochloride 1 mg/mL (Domitor)	Provet AG, Lyssach, Switzerland	Swissmedic Nr. 50'590 - ATCvet: QN05CM91	anesthetic/analgesic
ketamine 50mg/ml (Ketalar)	Parke-Davis, Zurich, Switzerland	72276388	anesthetic
tropicamide 0.5% + phenylephrine HCl 2.5% (Augentropfen mix)	ISPI, Bern, Switzerland	N/A	pupil dilation
Omnican Insulin-50 0.5 ml G30 0.3 x 12mm	B. Braun Mesungen AG, Carl-Braun-Straße, Germany	9151125
hydroxypropylmethylcellulose (Methocel 2%)	OmniVision, Neuhausen, Switzerland	N/A
+4 dpt rigid gas permeable contact lens	Quantum I, Bausch + Lomb Inc., Rochester, NY	N/A	Base Curve: 7.20 to 8.40 mm Diameter: 9.00 / 9.60 / 10.20 mm Power: -25.00 to +25.00 Diopters
balanced salt solution (BSS)	Inselspital, Bern, Switzerland	N/A
silicon forceps	N/A	N/A
atipamezole 5 mg/mL (Antisedan)	Provet AG, Lyssach, Switzerland	N/A	α2 adrenergic receptor antagonist
GraphPad Prism 7	GraphPad Software, Inc, San Diego, CA, USA	N/A	statistical analysis software