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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt wie hochauflösende bildgebende Verfahren wie spectral-Domain optische Kohärenztomographie und scanning Laser Ophthalmoskopie in kleine Nagetiere, mit einer ophthalmologischen Bildgebung Plattform-System, um Auskunft über genutzt werden Netzhautdicke und Microglial Zelle Verteilung, beziehungsweise.

Zusammenfassung

Spectral-Domain optische Kohärenztomographie (SD-OCT) und scanning Laser Ophthalmoskopie (SLO) werden ausführlich in experimentelle Ophthalmologie eingesetzt. In diesem Protokoll, Mäuse, die mit dem Ausdruck grün fluoreszierenden Proteins (Gfp) unter den Promotor des Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1GLP/GLP) wurden verwendet, um Bild-Mikroglia Zellen in Vivo in der Netzhaut. Mikroglia sind resident Makrophagen der Netzhaut und haben verschiedene Netzhauterkrankungen1,2,3,4,5,6in Verbindung gebracht. Dieses Protokoll bietet einen detaillierten Ansatz zur Erzeugung von retinalen B-Scans, mit SD-OCT und Bildgebung der Mikroglia Zelle Verteilung in Cx3cr1GLP/Gfp Mäuse mit SLO in Vivomit einer ophthalmologischen Bildgebungssystem Plattform. Das Protokoll kann in mehrere Reporter Mauslinien verwendet werden. Es gibt jedoch einige Einschränkungen des Protokolls, die hier vorgestellt. Erstens, SLO und SD-OCT, im hochauflösenden Modus, sammeln von Daten mit hohe axiale Auflösung aber die laterale Auflösung ist geringer (3,5 µm und 6 µm, beziehungsweise). Darüber hinaus ist die Fokus und Sättigung Ebene in SLO hängt stark von Parameter-Auswahl und korrekte Ausrichtung des Auges. Zusätzlich, im Vergleich mit Geräten, die für menschliche Patienten bei Mäusen ist schwierig wegen der höheren optischen Gesamtleistung des Auges Maus entworfen für das menschliche Auge; kann dies um zu lateralen Vergrößerung Ungenauigkeiten7, die auch die Vergrößerung durch die Maus Linse u.a. abhängig sind. Jedoch trotz, die position der axiale Scan ist abhängig von lateralen Vergrößerung, die axialen SD-OCT Messungen sind genaue8.

Einleitung

In experimentelle Ophthalmologie Untersuchung der Netzhaut Pathologie mit histologischen Techniken in der Regel ausgewertet. Jedoch Histologie erfordert tierischen Euthanization und Änderung der tatsächlichen Eigenschaften des Gewebes verursachen. SD-OCT und SLO werden routinemäßig in der klinischen Ophthalmologie zu diagnostischen Zwecken und für die Überwachung von mehreren Netzhauterkrankungen wie diabetischen Makulaödems9, anteriore ischämische optische Neuropathie10oder Retinitis Pigmentosa11 verwendet . SD-OCT und SLO sind nicht-invasive Techniken, die hochauflösende Bilder von der Netzhaut zu erzeugen, die durch den erweiterten Pupille ohne weiteres Zutun visualisiert werden. SD-OCT informiert der Netzhaut Struktur und Netzhautdicke Datensammlung Photons um Schnittbilder der Netzhaut zu erstellen, während SLO Fluoreszenz Daten sammelt um stereoskopische kontrastreiche Bilder der Netzhaut zu erzeugen. Heute, beide Techniken werden zunehmend in experimentelle Ophthalmologie mit kleinen Nagetieren12,13,14,15 (oder sogar Zebrafisch16,17) verwendet und können bieten Sie sowohl qualitative und quantitative Informationen12,17,18,19,20,21.

Ansammlung von endogenen Fluorophore wie Lipofuscins oder die Bildung von Drusen in der Netzhaut kann durch SLO als Auto Fluoreszenzsignal visualisiert werden. Diese Eigenschaft macht SLO eine wertvolle Technik zur Diagnose und Überwachung von Netzhauterkrankungen wie altersbedingte Makula-Degeneration oder Retinitis Pigmentosa22,23. In experimentelle Ophthalmologie kann Auto-Fluoreszenz-imaging (AF) zur Erkennung von bestimmten Zelltypen Reporter Mauslinien verwendet werden. Zum Beispiel sind Mäuse heterozygot für die Ausprägung der Gfp unter den Promotor des Cx3cr124 vorteilhaft für in Vivo Visualisierung der Mikroglia-Zellen in die normale Netzhaut und zur Untersuchung der Mikroglia/Makrophagen Dynamik in Netzhauterkrankung21. Mikroglia sind die ansässigen Makrophagen der Netzhaut, die eine entscheidende Rolle spielen auf Gewebe Homöostase und Gewebereparatur bei Verletzung1,25,26. Mikroglia-Aktivierung in der Netzhaut berichtet in der Netzhaut Verletzung, Ischämie und Degeneration, was eine Rolle dieser Zellen im Netzhauterkrankung2,3,4,5, 6.

Ziel dieses Protokolls ist es, eine relativ einfache Methode zur retinale Bildgebung und Messung der Netzhautdicke mit SD-OCT und zur Visualisierung der Gfp positive Mikroglia Zellen in den Cx3cr1GLP/Gfp Netzhaut Maus beschreiben SLO (Heidelberg Spectralis HRA + OCT-System). Dieses Protokoll kann für Bildgebung und Dicke Messungen des gesunden oder Kranken retinae in verschiedenen Mauslinien genutzt werden. Darüber hinaus können morphometrische Analysen zur Identifizierung und Quantifizierung der Mikroglia Zahlen und Mikroglia-Aktivierung in der Netzhaut mit SLO21durchgeführt werden. Mikroglia-Zellen sind mit degenerativen Erkrankungen in das zentrale Nervensystem (ZNS), einschließlich der Netzhaut27,28,29verbunden. So durch die Kombination der beiden Methoden verwendet in diesem Protokoll, Korrelation der Mikroglia Verbreitung und Degeneration der Netzhaut kann vorgenommen werden, die Überwachung Krankheitschwierigkeit erleichtern kann, oder die Wirksamkeit der therapeutischen Ansätze in Vivo.

Protokoll

in allen Verfahren waren BALB/c Erwachsene männliche und weibliche Mäusen, die Gfp unter den Promotor des Cx3cr1 Ausdrücken verwendeten 24. Mäuse wurden nach der ARVO-Anweisung für den Einsatz von Tieren in Ophthalmic und Vision Research behandelt und alle Verfahren wurden von der Schweizer Regierung nach den Eidgenössischen Schweizer Vorschriften über Tierschutz genehmigt. Mäuse wurden durch eine subkutane Injektion von Medetomidine Hydrochlorid (0,75 mg/kg) und Ketamin (45 mg/kg) betäubt. Ordnungsgemäße Betäubung wurde bestätigt durch die Überwachung der Atemfrequenz und dem Tier ' s Reflex gegen eine Prise Schweif. Am Ende der Versuche wurden Mäuse mit CO 2 Inhalation eingeschläfert.

Hinweis: ausführen jedes bildgebende Sitzung so schnell wie möglich (max. 20 min), seit Kataraktentstehung kann folgende Anästhesie retinalen Visualisierung 30 behindern.

1. Systemkonfiguration

  1. den Computer einschalten.
  2. Schalten Sie die Stromversorgung. Die Nachricht " Erwerb Modul Start " erscheint auf dem Bildschirm des Geräts Control Panel.
  3. Klicken Sie doppelt auf das Software desktop-Verknüpfung zum Betrieb der Software.
  4. Klicken Sie auf die Datenbank-View, die " Patienten hinzufügen " Symbol.
  5. Im Popup-Fenster, fügen Sie alle notwendigen Informationen (name, Vorname, Titel, Geburtsdatum, Geschlecht und Patienten-ID) und klicken Sie auf " ok ". Das Pop-Fenster der Hornhautkrümmung auf 2 mm festgelegt und klicken Sie auf " ok ".
  6. Eine 78D standard ophthalmologischen berührungslose Schlitz Lampe Objektiv vor die standard 30 °-Optik zu positionieren und befestigen Sie ihn sicher mit Klebeband.
  7. Stellen Sie sicher, dass der Filter-Hebel auf der linken Seite des Gerätes über die Angabe positioniert ist " A " erlauben IR + OCT und AF imaging ( Abbildung 1).

2. Maus-Vorbereitung

  1. Verwendung eine Medetomidine Hydrochlorid Dosis von 0,75 mg/kg und ein Ketamin-Dosis von 45 mg/kg in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4), Anästhesie-Lösung vorzubereiten. Also für eine Maus 20 g mischen Sie 15 µL Medetomidine-Hydrochlorid mit 18 µL von Ketamin zu einem Endvolumen von 50 µL mit PBS-Puffer. Speichern Sie die Lösung bei 4 ° C bis zu einer Woche.
  2. Die Maus durch das Genick zu erfassen und geben Sie einen Tropfen Tropicamid 0,5 % + Phenylephrin-Hydrochlorid 2,5 % auf jedes Auge, Erweiterung der Pupille zu erreichen.
  3. Halten Sie die Maustaste, zurückhaltend und mit einer Insulin-Spritze an einer 30G-Nadel befestigt, 50 µL der Anästhesie-Lösung subkutan injiziert. Setzen Sie die Maus zurück in seinen Käfig, die über ein Heizkissen gesetzt wird. Warten Sie die Maus völlig sediert ist ca. 3-5 min. Zur Beurteilung der Narkose Tiefe Kneifen Sie Ende der Maus. Überprüfen Sie die Hornhaut Reflex durch die Maus Hornhaut mit einem Wattestäbchen sanft berühren. Wenn keine positive Reflex beobachtet wird, fahren Sie mit der Bildgebung.
    Hinweis: Es ist wichtig, Atemfrequenz während der Narkose überwachen. Wenn die Maus nicht vollständig sediert ist, erhöht sich die Atemfrequenz auf einen schmerzhaften Reiz.
  4. Maus Hornhaut mit einer Anwendung von 2 % Hydroxypropylmethylcellulose auf jedes Auge fällt Hydrat.

3. SD-OCT

  1. legen einen wärmenden Patch von ca. 32 ° C auf die maßgeschneiderte Plattform befestigt auf dem Gerät Kinnhalter ( Abbildung 1).
  2. Bild des rechten Auges, platzieren Sie den Mauszeiger auf den linken Teil der Plattform ( Abbildung 1). Sicherzustellen, dass die richtige Umlaufbahn der Maus steht vor der Linse und der Körper anfällig auf der linken Seite der Plattform liegt.
  3. Geben Sie einen Tropfen der Hydroxypropylmethylcellulose auf dem rechten Auge und + 4 Dioptrien starre Gas durchlässige Kontaktlinsen sorgfältig drauf zu positionieren (sphärische macht:-25.00, +25,00 Dioptrien). Speichern Sie die Kontaktlinse in ausgeglichene Salzlösung (BSS). Um das Objektiv zu ergreifen, Kunststoff oder Silikon Zange verwenden, um Beschädigungen zu vermeiden.
  4. Drücken Sie die gelbe Box in der rechten Ecke der Bedienfeldanzeige Erwerb Modul (Greenbox auf Abbildung 2A) zu starten. Das gelbe Feld Grün und das Control-Panel-Menü erscheint auf dem Bildschirm ( Abbildung 2A).
  5. Für die Übernahme von B-Scans, wählen Sie die Option IR + OCT auf dem Bedienfeld ( Abb. 2A). Ausgewählten Einstellungen werden auf das Control Panel blau hervorgehoben.
  6. Select " Netzhaut " unter " Anwendung und Struktur " in den Software und bewegen Sie das Objektiv auf das Maus-Auge über die Defekte am Gerät ( Abbildung 1). Überprüfen Sie vor der Fokussierung auf die Netzhaut, die Angabe " OD " auf den linken Unterteil des Bildschirms ausgewählt ist. Die Software erkennt automatisch die Links (OS) und das rechte Auge (OD) basierend auf der Position des Ziels.
    Hinweis: Wenn das Ziel in der Mitte der Plattform positioniert ist, wird eine Fehlermeldung am unteren Rand des Bildschirms angezeigt. In diesem Fall neu positionieren Sie den Mauszeiger etwas bis die Software das richtige Auge erkennt.
  7. Mit den Fokussierknopf auf der Netzhaut zu konzentrieren, bis die großen Gefäße des Augenhintergrundes Bildes auf der linken Seite des Bildschirms deutlich zu erkennen sind. Bewegen Sie die Kamera durch Drehen der Mikromanipulator, nach links oder rechts, um die Kamera in diese Richtung zu bewegen oder im Uhrzeigersinn oder gegen den Uhrzeigersinn, um die Kamera zu bewegen, oben oder unten, bzw..
    Hinweis: Positionieren Sie die Maus auf die Plattform oder das Objektiv nach oben oder unten zu bewegen, die bevorzugte Lokalisation des Sehnervenkopfes im Infrarot-Bild zu erreichen.
  8. Den Drehknopf Empfindlichkeit zu senken gegen den Uhrzeigersinn oder im Uhrzeigersinn, um die Helligkeit des Augenhintergrundes Bildes zu erhöhen. Wenn optimale Scharfeinstellung erzielt wird, ein SD-OCT B-Scan erscheint auf der rechten Seite des Bildschirms.
    Hinweis: Wenn der B-Scan kann nicht durch Einstellung des Fokus visualisiert werden, drücken Sie die Tastenkombination Strg + Alt + Shift + O auf der Tastatur. Im Pop-up-Fenster, passen Sie den Wert der Referenzarm bis B-Scan auf dem Bildschirm angezeigt wird.
  9. Auf der Unterseite rechts auf dem Bildschirm, wählen Sie die einzelnen Scan im Muster (einzelne Linie in Abbildung 2 b).
  10. Drehen die Mikromanipulator des Geräts ( Abbildung 1), links, rechts, vorwärts oder rückwärts (nach schalten die Kamera in diese Richtung) um sicherzustellen, dass der B-Scan befindet sich zwischen der oberen und unteren Ecken des SD-OCT scan Fenster.
  11. Legen Sie die automatische Echtzeit-(Kunst) Wert auf mindestens 9 Bilder in hoher Qualität zu erhalten.
    Hinweis: Kunst verbessert die Bildqualität durch Mittelung mehrere aufeinander folgende Scans. Je höher die " Kunst " Wert ist, desto höher das Signal-Rausch-Verhältnis und damit die Bildqualität. Jedoch durch eine Erhöhung der " Kunst " Wert, der Erwerb von Zeit steigt auch.
  12. Drücken Sie die " erwerben " Taste ( Abbildung 2) auf dem Display des Bedienfelds und erwerben Sie die Bilder.
  13. Neu positionieren Sie den Mauszeiger um das Bild des linken Auges und wiederholen die Schritte 3.2-3.12.
  14. Sie die Kontaktlinse mit Kunststoff/Silikon Zange entfernen und legen Sie sie in BSS.
  15. Die Maus Hornhaut mit einem frischen Tropfen Hydroxypropylmethylcellulose Hydrat und entfernen Sie das überschüssige mit einem Papiertuch.
  16. Entfernen Sie die standard 30 °-Optik durch Drehen gegen den Uhrzeigersinn.
  17. Setzen Sie das Objektiv 55 ° und wiederholen Sie die Schritte 3,4-3.12 für jedes Auge.

4. Auto-Fluoreszenz Imaging

  1. ohne bewegen der Maus auf der Plattform wählen Sie IR auf dem Bedienfeld.
  2. Mit den Fokussierknopf konzentrieren sich auf die großen Netzhautgefäße.
  3. Auf das Control Panel wählen Sie AF.
  4. Drehknopf die Empfindlichkeit gegen den Uhrzeigersinn zu reduzieren oder im Uhrzeigersinn, um die Helligkeit des Bildes erhöhen.
  5. Die Empfindlichkeit Knopf drücken, und legen Sie die " Kunst " Wert auf 67 oder mehrere erhalten qualitativ hochwertige Bilder.
  6. Wenn das Set " Kunst " Wert erreicht wurde, drücken Sie " erwerben " auf dem Bedienfeld, das Bild zu erwerben. Drücken Sie die Empfindlichkeit Knopf wieder zu stoppen, im Durchschnitt. Stellen Sie den Fokus, um die verschiedene Schichten der Netzhaut zu visualisieren.
  7. 55° Linse zu entfernen und das weite Feld 102° Objektiv montieren. Führen Sie die Schritte 4.1 – 4.6 für beide Augen jede Maus und für jede Maus.
  8. Klicken Sie “ Bilder speichern ” am linken oberen Rand des Fensters und klicken Sie dann auf “ verlassen ”. Um die Bilder auf dem Computer zu speichern, wählen Sie die Maus aus der Liste auf der rechten Seite des Bildschirms durch einen Doppelklick auf das Maus-Namen. Doppelklick auf jedes Bild separat und klicken Sie dann auf das Disketten-Symbol. Speichern Sie das Bild als TIF, BMP, JPG oder PNG in den gewünschten Ordner. Zum Beenden der Software Press “ Datei ” und “ beenden ”.

5. Anästhesie-Umkehr

  1. Hydrat die Maus Augen mit einem Tropfen Hydroxypropylmethylcellulose und Rückkehr die Maus auf ein Heizkissen.
  2. Vorbereiten Atipamezol Lösung in einer Dosis von 2,25 mg/kg, die beruhigende Wirkung der Medetomidine Hydrochlorid rückgängig zu machen. Fügen Sie für eine 20 g Maus 9 µL Atipamezol in einem Endvolumen von 150 µL PBS hinzu. Speichern Sie die Lösung bei 4 ° C bis zu einer Woche.
  3. min nach Narkose Injektion (Schritt 2.2), injizieren 150 µL Atipamezol Lösung subkutan.
  4. Überwachen die Maus bis zur Genesung aus der Narkose. Wenn die Maus ist vollständig wiederhergestellten (5-10 min nach Atipamezol Injektion) steckte es wieder in seinen Käfig. Erholung wird durch die Fähigkeit des Tieres, seinen Körper als auf der einen Seite legte drehen Wiedererlangung der Aktivität Wandern, und in Reaktion auf die Umwelt Stimulation reagieren.

6. Manuelle Retinal Dickenmessung von SD-OCT-Bilder

  1. den OCT-Scan durch einen Doppelklick auf den Namen des Tieres zu öffnen.
  2. Öffnen den B-Scan mit 30° oder 55 ° Linse erhalten.
  3. Wählen Sie " Dickenprofil ".
  4. Drücken Sie die " bearbeiten Schicht Segmentationen " Symbol ( Abb. 2 b). Die Software automatisch identifiziert, die innere Begrenzung und Basis Membran.
  5. , Manuell korrigieren Sie ggf. die Position der inneren Begrenzung und Membran. Wählen Sie dazu den Layer von der linken Seite des Bildschirms und dann die roten Kreis-Option ( Abb. 2 b) geändert werden. Umzug des Kreises mit der Maustaste gedrückt, um die Zeile ändern,.
  6. Ändern Sie die Zeile die entsprechende Ebene richtig positionieren. Klicken Sie " speichern und schließen Sie " um das Fenster zu verlassen.
    Hinweis: Aufgrund der Reflektivität der Aderhaut, kann die Software die Basis Membran falsch identifiziert. So ist es vorzuziehen, es manuell zu definieren, bevor Sie mit Messungen der Netzhautdicke.
  7. Wählen Sie " Netzhaut " unter die " Schicht " Option. Auf den unteren Rand des Bildschirms erscheint ein Diagramm der Netzhautdicke.
  8. Klicken Sie auf eine andere Position auf dem Diagramm oder auf der B-Scan der Netzhautdicke (in µm angegeben) anzeigen für die ausgewählte Position.
  9. Messung der Netzhautdicke in den gewünschten Abstand des Sehnervenkopfes und kopieren Sie die Werte in einer Kalkulationstabelle.
  10. Wiederholen Sie die Schritte 5.1-5.9 für jede Maus für die 30 ° und 55° Objektiv.
  11. Führen Sie statistische Analyse mit der gewünschten Software.

Ergebnisse

Mit den hier vorgestellten Protokoll, SD-OCT scannt und SLO Bilder stammen aus Cx3cr1GLP/Gfp Mäuse in der gleichen Sitzung imaging. Abbildung 3 umfasst Vertreter SD-OCT Einzelscans erhalten mit einem 30° oder ein 55 ° Objektiv (Abbildung 3A) und repräsentative SLO Bilder mit einem 55 ° oder ein 102 ° Objektiv erhalten, wo Gfp-positiven Mikroglia-Zellen sichtbar gemacht. Höhere Reflektivität der Aderha...

Diskussion

Der vorliegende Artikel zeigt ein Protokoll für den Erwerb von retinalen B-Scans und Bildgebung der Gfp positive Mikroglia Verteilung in der Maus Netzhaut in der gleichen Sitzung imaging. SD-OCT und SLO werden zunehmend in Tiermodellen der Netzhauterkrankung zur retinalen Veränderungen über Zeit10,14,17,18,21informieren. Mit diesem Protokoll, Cx3cr1

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt durch ein Stipendium des Schweizerischen Nationalfonds (SNF; #320030_156019). Die Autoren erhielten nichtfinanzielle Unterstützung von Heidelberg Engineering GmBH, Deutschland.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Spectralis Imaging system (HRA+OCT)Heidelberg Engineering, GermanyN/Aophthalmic imaging platform system
Heidelberg Eye ExplorerHeidelberg Engineering, GermanyN/AVersion 1.9.13.0
78D standard ophthalmic non-contact slit lamp lensVolk Optical Inc., Ohio, USAV78C
Spectralis wide angle 55° lensHeidelberg Engineering, Germany50897-002
ultra widefield 102° lensHeidelberg Engineering, Germany50117-001
medetomidine hydrochloride 1 mg/mL (Domitor)Provet AG, Lyssach, SwitzerlandSwissmedic Nr. 50'590 - ATCvet: QN05CM91anesthetic/analgesic
ketamine 50mg/ml (Ketalar)Parke-Davis, Zurich, Switzerland72276388anesthetic
tropicamide 0.5% + phenylephrine HCl 2.5% (Augentropfen mix)ISPI, Bern, SwitzerlandN/Apupil dilation
Omnican Insulin-50 0.5 ml G30 0.3 x 12mmB. Braun Mesungen AG, Carl-Braun-Straße, Germany9151125
hydroxypropylmethylcellulose (Methocel 2%)OmniVision, Neuhausen, SwitzerlandN/A
+4 dpt rigid gas permeable contact lensQuantum I, Bausch + Lomb Inc., Rochester, NYN/ABase Curve: 7.20 to 8.40 mm
Diameter: 9.00 / 9.60 / 10.20 mm
Power: -25.00 to +25.00 Diopters
balanced salt solution (BSS)Inselspital, Bern, SwitzerlandN/A
silicon forcepsN/AN/A
atipamezole 5 mg/mL (Antisedan)Provet AG, Lyssach, SwitzerlandN/Aα2 adrenergic receptor antagonist
GraphPad Prism 7GraphPad Software, Inc, San Diego, CA, USAN/Astatistical analysis software

Referenzen

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