Vivo에서 스펙트럼-도메인 광학 일관성 단층 촬영 스캐닝 레이저 Ophthalmoscopy와 Cx3cr1gfp/gfp 기자 쥐의 이미징

요약

이 프로토콜 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 등 어떻게 고해상도 이미징 기술을 설명 하 고 스캐닝 레이저 ophthalmoscopy에 정보를 얻기 위해 안과 이미징 플랫폼 시스템을 사용 하 여 작은 설치류에 이용 될 수 있다 망막 두께 microglial 각각 유통, 셀.

초록

스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 (SD-10 월) 및 스캐닝 레이저 ophthalmoscopy (SLO) 실험 안과에 광범위 하 게 사용 됩니다. 현재 프로토콜에서 마우스 표현 녹색 형광 단백질 (gfp) Cx3cr1 의 발기인에서 (BALB/c-Cx3cr1^gfp/gfp) microglia 세포에서 vivo에서 망막에 이미지를 사용 했다. Microglia 상주 세포는 망막의 고 여러 망막 질환^1,2,3,4,,56에 연루 되었습니다. 이 프로토콜의 망막 B-스캔, SD-10 월과 SLO에서 vivo에서,와 함께 Cx3cr1^gfp/gfp 마우스 microglia 셀 배포판의 이미징 안과 이미징 플랫폼 시스템을 사용 하는 세대에 대 한 상세한 접근을 제공 합니다. 프로토콜은 여러 기자 마우스 라인에서 사용할 수 있습니다. 그러나, 여기에 제시 된 프로토콜 몇 가지 제한이 있습니다. 첫째, SLO 및 SD-10 월, 고해상도 모드에서 사용 될 때 높은 축 해상도 측면 해상도와 데이터 수집 낮습니다 (3.5 µ m와 6 µ m, 각각). 또한, SLO에 초점 및 채도 수준을 높은 매개 변수 선택 및 눈의 올바른 정렬에 의존 합니다. 또한, 인간의 눈;에 비해 쥐에서 인간 환자는 마우스 눈의 더 높은 총 광학 힘 인 도전 위해 고안 된 장치를 사용 하 여 이 또한 다른 사람의 사이에서 마우스 렌즈에 의해 확대에 따라 확대 부정확⁷, 측면을 발생할 수 있습니다. 그러나, 축 검사 위치에 불구 하 고 측면 배율에 따라 달라 집니다, 그리고 축 SD 10 월 측정은 정확 하 게⁸.

서문

실험적인 안과에서 망막 병 리의 검사 일반적으로 조직학 기술을 사용 하 여 평가 합니다. 그러나, 조직학 동물 euthanization를 요구 하 고 조직의 실제 속성 변경 발생할 수 있습니다. SD-10 월과 SLO 정기적으로 사용 됩니다 임상 안과에서 진단 목적을 위해 여러 망막 질환 당뇨 황 반 부 종⁹, 앞쪽 허 혈 성 시 신경 병¹⁰또는 망막 화^{11 등의 모니터링} . SD-10 월과 SLO 추가 개입 없이 넓혀 진된 눈동자를 통해 시각화 되는 망막의 고해상도 이미지를 생성 하는 비-침략 적 기술이 있습니다. SD-10 월 SLO 입체 이미지는 망막의 생산 형광 데이터를 수집 하는 동안 망막의 단면 이미지를 만들려고 backscattering 데이터를 수집 하 여 망막 구조와 망막 두께의 정보를 제공 합니다. 요즘, 모두는 점점 작은 설치류^12,13,,1415 (또는 심지어 zebrafish^16,17)를 사용 하 여 실험 안과에서 사용 기술과 수 있습니다. 모두 질적 및 양적 정보^{12,,1718,,1920,21}을 제공 합니다.

Lipofuscins 같은 내 생 fluorophores의 축적 또는 망막에 드루의 형성 자동 형광 신호 SLO에 의해 구상 될 수 있다. 이 특징은 SLO 진단 및 연령 관련 황 반 변성 등 망막 화^22,23망막 질병의 모니터링을 위한 귀중 한 기술. 실험적인 안과에 자동 형광 이미징 (AF) 기자 마우스 라인에서 특정 세포 유형의 탐지에 대 한 사용할 수 있습니다. 예를 들어 마우스 Cx3cr1²⁴ 의 발기인에서 gfp의 표현을 위한 heterozygous microglia/대 식 세포의 수사를 위해 정상적인 망막에 microglial 세포의 생체 내에서 시각화 한 유리는 망막 질병²¹역학입니다. Microglia는 조직의 항상성 및 부상^1,,2526시 조직 복구에 중요 한 역할을 하는 망막의 상주 대 식 세포는. Microglia 활성화는 망막에 허 혈, 망막 부상과 변성, 망막 질병^2,3,,45, 에서이 세포의 역할을 제안 보고 되었습니다. ⁶.

현재의 프로토콜의 목적은 망막 이미징 및 SD-10 월를 사용 하 여 망막 두께의 측정에 대 한 사용 하 여 Cx3cr1^gfp/gfp 마우스 망막 gfp 긍정적인 microglia 셀의 시각화를 위한 비교적 간단한 방법 설명 하는 SLO (하이델베르크 Spectralis HRA + 10 월 시스템). 이 프로토콜은 다양 한 마우스 라인에서 건강 또는 질병 망막의 이미징 및 두께 측정을 위해 활용할 수 있습니다. 또한, 형태학 분석 식별 및 정량화 microglia 숫자 및 SLO²¹을 사용 하 여 망막에 microglia 활성화에 대 한 수행할 수 있습니다. Microglia 세포 망막^27,,2829를 포함 하 여 중앙 신경 시스템 (CNS)에 퇴행 성 질환과 연결 됩니다. 따라서, 현재 프로토콜에서 사용 하는 두 가지 방법을 조합 하 여 microglia 유통 및 망막 변성의 상관 관계 만들 수 있는 모니터링 질병의 심각도 촉진할 수 있다 또는 vivo에서접근의 치료 효과.

프로토콜

모든 절차, BALB/c 성인 남성 및 여성 쥐 Cx3cr1의 발기인에서 gfp 익스프레스 누가 사용된 ²⁴ 했다. 마우스 ARVO 성명에 따르면 안과 및 비전 연구에 있는 동물의 사용에 대 한 치료 하 고 모든 절차는 동물 복지에 스위스 연방 규정에 따르면 스위스 정부에서 승인 했다. 마우스는 medetomidine 염 산 염 (0.75 mg/kg)과 케 타 민 (45 mg/kg)의 피하 주입에 의해 취 했다. 적절 한 마 취 호흡 속도 동물을 모니터링 하 여 확인 되었다 ' 꼬리 핀치에 대 한 s 반응. 실험의 끝에, 쥐와 CO ₂ 흡입 안락사 되었다.

참고: 이미징 각 세션 (최대 20 분) 가능한 한 빨리 수행, 백 내장 형성 이후 다음 마 취 망막 시각화 ³⁰을 방해 수 있습니다.

1. 시스템 구성

1. 컴퓨터를 켭니다.
2. 전원 공급 장치를 켭니다. 메시지 " 시작 수집 모듈 " 장치의 제어판 화면에 나타납니다.
3. 소프트웨어를 작동 하는 소프트웨어의 바탕 화면 바로 가기를 두 번 클릭.
4. 데이터베이스 보기에서 클릭는 " 환자를 추가 " 아이콘.
5. 팝업 창에서 필요한 모든 정보를 삽입 (성, 이름, 제목, 생년월일, 성별, 및 환자 ID)를 클릭 하 고 " 확인 ". 팝업 창에서 2 mm 각 막 곡률을 설정 하 고 " 확인 ".
6. 표준 30 ° 시 앞 78 D 표준 안과 콘택트 슬릿 램프 렌즈를 놓고 테이프로 안전 하 게 그것을 건다.
7. 장치의 왼쪽에 있는 필터 레버는 표시에 위치 확인 " A " IR + 10 월 및 ( 그림 1) 이미징 어.

2. 마우스 준비

1. 0.75 mg/kg와는 케 타 민 medetomidine 염 복용량을 사용 하 여 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS, pH 7.4) 마 취 솔루션 준비에 45 mg/kg의 복용량. 따라서, 20 g 마우스에 대 한 medetomidine 염 산의 15 µ L 18 µ L의 PBS에서 50 µ L의 최종 볼륨을 마 취 제와 혼합. 솔루션 4 ° C에서 최대 1 주일까지 저장.
2. 아저씨에 의해 마우스를 파악 하 고 눈동자 팽창 시킴을 달성 하기 위해 각각의 눈에 한 방울 tropicamide 0.5% + phenylephrine 염 2.5% 적용.
3. 구속, 마우스를 유지 하 고 30 G 바늘에 연결 된 인슐린 주사기, 피하 주사 마 취 솔루션의 50 µ L. 생리대 위에 배치 된 그것의 감 금에서 다시 마우스를 넣어. 마우스 완벽 하 게 진정 될 때까지 3-5 분을 기다립니다. 마 취 깊이 평가, 마우스의 꼬리를 꼬집어. 마우스 각 막을 면봉으로 부드럽게 터치 하 여 각 막 반사를 확인 합니다. 없는 긍정적인 반사를 관찰 하는 경우는 영상 계속.
   참고: 그것은 마 취 동안 호흡 속도 모니터링 하는 것이 중요입니다. 마우스 완벽 하 게 진정 하지 고통 스러운 자극에 따라 호흡 속도 증가 합니다.
4. 수화물 2 %hydroxypropylmethylcellulose 응용 프로그램과 함께 마우스 각 막 각 눈에 떨어진다.

3. SD-10 월

1. 소자의 턱 받침대 ( 그림 1)에 연결 된 맞춤 플랫폼에 약 32 ° C의 온난 화 패치를 배치.
2. 오른쪽 눈 이미지를 플랫폼 ( 그림 1)의 왼쪽된 부분에 마우스를 놓습니다. 마우스의 오른쪽 궤도 렌즈 얼굴과 신체 거짓말 플랫폼의 왼쪽된 부분에는 경향이 확인 하십시오.
3. 오른쪽 눈에 hydroxypropylmethylcellulose의 방울을 적용 하 고 신중 하 게 그것은 + 4 디 옵 터 엄밀한 가스 침투성 콘택트 렌즈 위치 (구형 전원: +25.00 디 옵 터에-25.00). 균형 잡힌된 소금 솔루션 (BSS)에 콘택트 렌즈를 저장 합니다. 렌즈를 잡아,를 사용 하 여 플라스틱 또는 실리콘 집게 손상을 방지.
4. 수집 모듈 ( 그림 2A에 녹색 상자)을 시작 하는 컨트롤 패널 디스플레이의 오른쪽에 노란 상자를 누릅니다. 노란색 상자는 녹색 켜 집니다 고 컨트롤 패널 메뉴 화면 ( 그림 2A)에 표시 됩니다.
5. B 검사의 인수, 컨트롤 패널 ( 그림 2A)에 IR + 10 월 옵션을 선택 합니다. 선택한 설정 컨트롤 패널에서 파란색으로 강조 표시 됩니다.
6. 선택 " 망막 "에서 " 응용 프로그램 및 구조 " 소프트웨어에 이동 마우스 눈으로 렌즈에 사용 하 여는 micromanipulator 장치 ( 그림 1). 망막에 초점을 맞추고, 전에 확인 표시 " OD " 스크린의 왼쪽된 하단 부분에 선택. 소프트웨어는 자동으로 왼쪽 (OS)를 식별 하 고 오른쪽 (OD) 눈은 목표의 위치에 따라.
   참고: 목표는 플랫폼의 중간에 위치 하는 경우 화면 하단에 오류 메시지가 표시 됩니다. 이 경우, 다시 마우스를 놓고 약간 때까지 올바른 눈을 인식 하는 소프트웨어.
7. 초점 손잡이와 초점을 망막에 큰 배는 명확 하 게 컴퓨터 화면 왼쪽에 저 이미지에서 볼 때까지. 카메라는 micromanipulator 왼쪽 또는 오른쪽, 그 방향으로 카메라를 이동 또는 시계 방향 또는 시계 반대 방향으로, 최대 또는 아래로, 각각 카메라를 이동 하 여 이동.
   참고: 플랫폼에서 마우스 위치를 변경 하거나 적외선 이미지에서 시 신경 머리의 선호 지역화를 달성 하기 위해 렌즈 위쪽으로 또는 아래쪽으로 이동.
8. 시계 반대 방향으로 줄이기 위해 또는 저 이미지의 밝기를 증가 하는 방향으로 감도 조절기를 돌립니다. 최적의 초점을 달성 하는 경우는 SD-10 월 B-스캔 화면 오른쪽에 나타납니다.
   참고: B-스캔 초점을 조정 하 여 구상 될 수 없습니다, 경우 키보드 조합 Ctrl + Alt + Shift + O를 누릅니다. 팝업 창에서 값을 조정 하는 참조 팔의 B-스캔 화면에 나타날 때까지.
9. 화면의 오른쪽 하단에 패턴 메뉴 (한 줄 그림 2b에서)에서 단일 검색을 선택 하십시오.
10. Micromanipulator 장치 ( 그림 1)의 왼쪽, 오른쪽, 앞으로, 또는 (그 방향으로 카메라를 설정)을 뒤로 돌려 B-스캔 위쪽과 아래쪽 사이 위치 되도록 모서리의 SD-스캔 창.
11. 적어도 9 높은 품질의 이미지를 자동 실시간 (미술) 값 설정.
    참고: 예술 여러 연속 스캔을 평균 하 여 이미지 품질을 향상 시킵니다. 높은 " 예술 " 가치, 높은 신호 대 잡음 비율 그리고 이렇게 이미지 품질. 그러나, 증가 하 여는 " 예술 "는 획득 가치 시간 또한 증가.
12. 보도 " 취득 " ( 그림 2) 제어판 화면에 버튼 하 고는 이미지.
13. 왼쪽된 눈 이미지 및 반복 단계 3.2-3.12 마우스 위치.
14. 플라스틱/실리콘 집게로 콘택트 렌즈를 제거 하 고 그것은 BSS.
15. Hydroxypropylmethylcellulose의 신선한 드롭 마우스 각 막 수 화와 티슈 페이퍼와 초과 제거.
16. 시계 반대 방향으로 회전 하 여 표준 30 ° 광 제거.
17. 55 ° 렌즈를 탑재 하 고 각 눈에 대 한 단계 3.4-3.12 반복.

4. 형광 이미징 자동

1. 플랫폼에서 마우스를 이동 하지 않고 제어판에서 IR을 선택 합니다.
2. 초점 손잡이와 큰 망막 혈관에 초점.
3. 컨트롤 패널에서 AF를 선택 합니다.
4. 감도 노브를 시계 반대 방향으로 줄이기 위해 설정 또는 이미지의 밝기를 증가 하는 방향으로.
5. 감도 손잡이 누르고 설정에 " 예술 " 67 이상의 높은 품질을 얻으려면 이미지 값.
6. 때 세트 " 아트 " 값에 도달 했습니다, 눌러 " 취득 " 이미지를 얻으려면 제어판에서. 감도 노브를 다시 평균 중지를 누릅니다. 다른 망막 레이어를 시각화 하려면 초점 조정.
7. 55 ° 렌즈를 제거 하 고 넓은 분야 102 ° 렌즈를 탑재. 4.1 단계 – 4.6 각 마우스의 두 눈에 대 한, 모든 마우스.
8. 클릭 “ 이미지 저장 ” 창과 클릭의 왼쪽된 상단 테두리에 “ 종료 ”. 컴퓨터에 이미지를 저장 하려면 마우스 이름을 두 번 클릭 하 여 마우스 화면 오른쪽 부분에 있는 목록에서 선택 합니다. 별도로 각 이미지를 두 번 클릭 한 다음 플로피 디스크 아이콘을 클릭 합니다. .Tif,.bmp,.jpg 또는.png 원하는 폴더에로 이미지를 저장 합니다. 소프트웨어 보도 종료 하려면 “ 파일 ” 및 “ 종료 ”.

5. 마 취 반전

1. 마우스 눈 hydroxypropylmethylcellulose의 한 방울을 수 화와 생리대에 마우스 반환.
2. 준비 atipamezole 솔루션 medetomidine 염 산 염의 진정 효과를 2.25 mg/kg의 복용량에. 20 g 마우스에 대 한 150 µ L PBS의 최종 볼륨을 사용 하 여 atipamezol의 9 µ L을 추가 합니다. 솔루션 4 ° C에서 최대 1 주일까지 저장.
3. 분 마 취 주입 (2.2 단계), atipamezole 솔루션의 150 µ L를 피하 주사 후.
4. 마 취에서 회복 될 때까지 마우스를 모니터링합니다. 때 마우스는 완전히 복구 (5-10 분 atipamezole 주입 후) 다시는 새 장에 넣어. 한쪽에 누워 때 그 시체를 설정 하는 동물의 능력에 의해 복구 표시 됩니다 활동, 산책 및 환경 자극에 대 한 응답에서 반응의 회복.

6. SD-10 월 이미지에서 수동 망막 두께 측정

1. OCT 검사는 동물의 이름에 더블 클릭 하 여 엽니다.
2. B-스캔 30 ° 또는 55 ° 렌즈와 함께 얻은 열.
3. 선택 " 두께 프로 파일 ".
4. 보도 " 레이어 세그먼트 편집 " 아이콘 ( 그림 2B). 소프트웨어 자동으로 내부 제한 식별 하 고 기지 막.
5. 필요한 경우는 수동으로 해결 한다 내부 제한의 위치 그리고 막 기초. 이렇게 하려면 화면 그리고 빨간색 동그라미 옵션 ( 그림 2B)의 왼쪽에서 수정할 레이어를 선택 합니다. 이동 마우스 버튼으로 원 선 수정 누르면.
6. 올바르게 해당 레이어를 줄을 수정 합니다. 클릭 " 저장 하 고 닫습니다 " 창 종료.
   참고: 맥락 막의 반사도, 인해 소프트웨어 식별할 수 있습니다 하지 기본 막 제대로. 따라서, 그것은 망막 두께 측정을 진행 하기 전에 그것을 수동으로 정의 하는 것이 좋습니다.
7. 선택 " 망막 " 아래는 " 계층 " 옵션. 망막 두께의 다이어그램 화면 하단에 표시 됩니다.
8. 망막 두께 (µ m에 표시 됨) 볼 B-스캔 또는 다이어그램에서 다른 위치에 선택 된 위치에 대 한 클릭 하십시오.
9. 시 신경 머리에서 원하는 거리에 망막 두께 측정 하 고 스프레드시트에 값 복사.
10. 5.1-5.9 30 °와 55 ° 렌즈 각 마우스에 대 한 단계를 반복.
11. 원하는 소프트웨어와 통계 분석을 수행.

결과

여기에 제시 된 프로토콜을 사용 하 여, SD-10 월 스캔 하 고 SLO 이미지 같은 이미징 세션에 Cx3cr1^gfp/gfp 마우스에서 입수 했다. 그림 3 에 대표 SD-10 월 단일 검사는 30 °와 55 ° 렌즈 (그림 3A) 또는 대표 SLO 이미지 얻은 gfp 긍정적인 microglia 셀 시각화는 55 ° 또는 102 ° 렌즈와 함께 얻은 포함 되어 있습니다. 맥락 막의 ?...

토론

현재 문서에서는 망막 B-스캔의 수집과 같은 이미징 세션에서 마우스 망막에 gfp 긍정적인 microglia 분포의 이미징에 대 한 프로토콜을 보여 줍니다. SD-10 월과 SLO는 점점 사용 망막 질환의 동물 모델에서^{10,,1417,18,21}이상 망막 변경의 정보를 제공 하. 이 프로토콜, Cx3cr1^gfp/g...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectralis Imaging system (HRA+OCT)	Heidelberg Engineering, Germany	N/A	ophthalmic imaging platform system
Heidelberg Eye Explorer	Heidelberg Engineering, Germany	N/A	Version 1.9.13.0
78D standard ophthalmic non-contact slit lamp lens	Volk Optical Inc., Ohio, USA	V78C
Spectralis wide angle 55° lens	Heidelberg Engineering, Germany	50897-002
ultra widefield 102° lens	Heidelberg Engineering, Germany	50117-001
medetomidine hydrochloride 1 mg/mL (Domitor)	Provet AG, Lyssach, Switzerland	Swissmedic Nr. 50'590 - ATCvet: QN05CM91	anesthetic/analgesic
ketamine 50mg/ml (Ketalar)	Parke-Davis, Zurich, Switzerland	72276388	anesthetic
tropicamide 0.5% + phenylephrine HCl 2.5% (Augentropfen mix)	ISPI, Bern, Switzerland	N/A	pupil dilation
Omnican Insulin-50 0.5 ml G30 0.3 x 12mm	B. Braun Mesungen AG, Carl-Braun-Straße, Germany	9151125
hydroxypropylmethylcellulose (Methocel 2%)	OmniVision, Neuhausen, Switzerland	N/A
+4 dpt rigid gas permeable contact lens	Quantum I, Bausch + Lomb Inc., Rochester, NY	N/A	Base Curve: 7.20 to 8.40 mm Diameter: 9.00 / 9.60 / 10.20 mm Power: -25.00 to +25.00 Diopters
balanced salt solution (BSS)	Inselspital, Bern, Switzerland	N/A
silicon forceps	N/A	N/A
atipamezole 5 mg/mL (Antisedan)	Provet AG, Lyssach, Switzerland	N/A	α2 adrenergic receptor antagonist
GraphPad Prism 7	GraphPad Software, Inc, San Diego, CA, USA	N/A	statistical analysis software