In Vivo Imaging dei topi Reporter Cx3cr1gfp/gfp con tomografia a coerenza ottica Spectral-domain e scansione Laser oftalmoscopia

Riepilogo

Questo protocollo descrive come ad alta definizione tecniche di imaging come la tomografia ottica di coerenza di dominio spettrale e scansione laser oftalmoscopia può essere utilizzata in piccoli roditori, utilizzando un sistema di piattaforma di imaging oftalmico, per ottenere informazioni su lo spessore retinico e microglial cellula distribuzione, rispettivamente.

Abstract

Tomografia a coerenza ottica dominio spettrale (SD-OCT) e oftalmoscopia di scansione laser (SLO) sono ampiamente utilizzati in Oftalmologia sperimentale. Nel presente protocollo, topi che esprimono verde proteina fluorescente (gfp) sotto il promotore di Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1^gfp/gfp) sono stati utilizzati per immagine microglia cellule in vivo nella retina. Le microglia sono macrofagi residenti della retina e sono stati implicati in diverse patologie retiniche^1,2,3,4,5,6. Questo protocollo fornisce un approccio dettagliato per la generazione di retinica B-Scan, con SD-OCT e la formazione immagine di distribuzione delle cellule di microglia in topi Cx3cr1^gfp/gfp con SLO in vivo, utilizzando un sistema di piattaforma di imaging oftalmico. Il protocollo può essere utilizzato in diverse linee di reporter del mouse. Tuttavia, esistono alcune limitazioni del protocollo presentato qui. In primo luogo, sia SLO e SD-OCT, quando usato in modalità ad alta risoluzione, raccogliere dati con alta risoluzione assiale ma la risoluzione laterale sono più bassi (3,5 µm e 6 µm, rispettivamente). Inoltre, il livello di messa a fuoco e saturazione in SLO è fortemente dipendente dalla selezione dei parametri ed il corretto allineamento dell'occhio. Inoltre, utilizzando dispositivi progettati per pazienti umani in topi è impegnativo a causa della maggiore potenza totale ottica dell'occhio del mouse rispetto all'occhio umano; Questo può portare a laterale ingrandimento imprecisioni⁷, che dipendono anche l'ingrandimento con la lente del mouse tra gli altri. Tuttavia, nonostante che la scansione assiale posizione dipende dall'ingrandimento laterale, le misurazioni di SD-OCT assiale sono accurati⁸.

Introduzione

In Oftalmologia sperimentale, l'esame di patologia retinica viene solitamente valutato utilizzando tecniche istologiche. Tuttavia, l'istologia richiede euthanization animale e può causare alterazione per le proprietà effettive del tessuto. SD-OCT e SLO sono abitualmente utilizzati in Oftalmologia clinica a fini diagnostici e per il monitoraggio delle diverse patologie retiniche quali l'edema maculare diabetico⁹, neuropatia ottica ischemica anteriore¹⁰o retinite pigmentosa¹¹ . SD-OCT e SLO sono tecniche non invasive che generano immagini ad alta risoluzione della retina, che sono visualizzati attraverso la pupilla dilatata senza ulteriori interventi. SD-OCT fornisce informazioni della struttura retinica e lo spessore retinico raccogliendo dati di retrodiffusione per creare immagini a sezione trasversale della retina, mentre SLO raccoglie i dati di fluorescenza per produrre immagini stereoscopiche ad alto contrasto della retina. Al giorno d'oggi, entrambe le tecniche sono sempre più utilizzate in Oftalmologia sperimentale utilizzando piccoli roditori^12,13,14,15 (o anche zebrafish^16,17) e può fornire sia informazioni qualitative e quantitative^{12,17,18,19,20,21}.

Accumulo di fluorofori endogeni come lipofuscine o la formazione di drusen nella retina possa essere visualizzata da SLO come segnale fluorescente automatico. Questa caratteristica rende SLO una tecnica importante per la diagnosi e il monitoraggio delle patologie retiniche come la degenerazione maculare senile o retinite pigmentosa^22,23. In Oftalmologia sperimentale, fluorescenza auto imaging (AF) può essere utilizzato per il rilevamento di tipi cellulari specifici nelle linee di reporter del mouse. Ad esempio, topi eterozigoti per l'espressione della gfp sotto il promotore di Cx3cr1²⁴ sono vantaggiosi per la visualizzazione in vivo di cellule microgliali nella retina normale e per l'indagine di microglia/macrofagi dinamica nella malattia retinica²¹. Le microglia sono i macrofagi residenti della retina, che svolgono un ruolo cruciale su omeostasi tissutale e riparazione tissutale su lesioni^1,25,26. Attivazione della microglia nella retina è stata segnalata in lesione retinica, l'ischemia e la degenerazione, suggerendo un ruolo di queste cellule nella malattia retinica^{2,3,4,5, 6}.

L'obiettivo del presente protocollo è di descrivere un metodo relativamente semplice per l'imaging retinico e misurazione dello spessore retinico con SD-OCT e per la visualizzazione delle cellule di microglia positivo di gfp nel mouse retina utilizzando Cx3cr1^gfp/gfp SLO (sistema di Heidelberg Spectralis HRA + OCT). Questo protocollo può essere utilizzato per misure di imaging e spessore delle retine sane o malate in varie linee del mouse. Inoltre, le analisi morfometriche possono essere eseguite per l'identificazione e la quantificazione dei numeri di microglia e attivazione di microglia nella retina utilizzando SLO²¹. Cellule di microglia sono associate con malattie degeneranti nel sistema nervoso centrale (CNS), compreso la retina^27,28,29. Così, combinando i due metodi utilizzati nel presente protocollo, correlazione della distribuzione di microglia e degenerazione retinica può essere fatto, che può facilitare il monitoraggio la gravità della malattia o l'efficacia di terapeutica si avvicina in vivo.

Protocollo

in tutte le procedure, topi BALB/c adulti maschi e femminili che esprimono gfp sotto il promotore di Cx3cr1 erano usate ²⁴. Topi sono stati trattati secondo la dichiarazione di ARVO per l'uso degli animali in oftalmica e Vision Research e tutte le procedure sono state approvate dal governo svizzero secondo la normativa federale svizzero sul benessere degli animali. Topi sono stati anestetizzati da un'iniezione sottocutanea di medetomidina cloridrato (0,75 mg/kg) e ketamina (45 mg/kg). L'anestesia adeguata è stata confermata mediante il monitoraggio della frequenza respiratoria e l'animale ' riflesso di s contro un pizzico di coda. Alla fine degli esperimenti, i topi sono stati eutanasizzati con inalazione di CO ₂.

Nota: eseguire ogni sessione di imaging più rapidamente possibile (massimo 20 min), poiché la formazione di cataratta anestesia seguente può ostacolare la visualizzazione della retina ³⁰.

1. configurazione del sistema

1. accendere il computer.
2. Attivare l'alimentazione elettrica. Il messaggio " inizio modulo di acquisizione " appariranno sulla schermata Pannello di controllo del dispositivo.
3. Fare doppio clic sul collegamento sul desktop del software per funzionare il software.
4. La visualizzazione del database, scegliere il " aggiungere paziente " icona.
5. Nella finestra pop-up, inserire tutte le informazioni necessarie (nome, cognome, titolo, data di nascita, sesso e paziente-ID) e fare clic su " ok ". La finestra pop impostare la curvatura cornea a 2 mm e fare clic su " ok ".
6. Posizionare una 78D standard oftalmico senza contatto fessura lampada lente davanti l'ottica standard 30 ° e fissarlo in modo sicuro con del nastro adesivo.
7. Assicurarsi che la leva di filtro sulla sinistra del dispositivo è posizionata sull'indicazione " A " per consentire sia IR + OCT e AF di immagine ( Figura 1).

2. Preparazione del mouse

1. uso una dose di medetomidina cloridrato di 0,75 mg/kg e un ketamina dose di 45 mg/kg in soluzione tampone fosfato (PBS, pH 7.4) per preparare la soluzione di anestesia. Così, per un mouse 20g, mescolare 15 µ l di medetomidina cloridrato con 18 µ l di ketamina ad un volume finale di 50 µ l di PBS. Conservare la soluzione a 4 ° C fino a una settimana.
2. Afferrare il mouse per la collottola e applicare una goccia di tropicamide 0,5% + fenilefrina cloridrato 2,5% su ogni occhio per ottenere la dilatazione della pupilla.
3. Tenere il mouse trattenuto e con una siringa da insulina associata ad un ago 30g, iniettare per via sottocutanea 50 µ l della soluzione anestesia. Mettere il mouse indietro nella sua gabbia che è posto sopra una piastra elettrica. Attendere 3-5 min fino a quando il mouse è completamente sedato. Per valutare la profondità anestetica, pizzicare la coda del mouse. Controllare il riflesso corneale toccando delicatamente la cornea del mouse con un batuffolo di cotone. Se non si è osservato nessun riflesso positivo, continuare con l'imaging.
   Nota: È importante monitorare la frequenza respiratoria durante l'anestesia. Se il mouse non è completamente sedato, la frequenza respiratoria aumenterà a uno stimolo doloroso.
4. Idrato la cornea mouse con un'applicazione di 2% idrossipropilmetilcellulosa gocce su ogni occhio.

3. SD-OCT

1. inserire una patch di riscaldamento di circa 32 ° C sulla piattaforma su misura attaccata sul resto di mento del dispositivo ( Figura 1).
2. All'immagine l'occhio destro, posizionare il mouse sulla parte sinistra della piattaforma ( Figura 1). Assicurarsi che la giusta orbita del mouse si trova di fronte la lente e il suo corpo si trova incline sulla parte sinistra della piattaforma.
3. Applicare una goccia di idrossipropilmetilcellulosa sull'occhio di destra e posizionare attentamente una lente a contatto + 4 diottrie rigida gas permeabile su di esso (potenza sferica:-25.00 a +25,00 diottrie). Conservare le lenti a contatto in soluzione salina bilanciata (BSS). Per afferrare la lente, utilizzare pinze di plastica o silicone per evitare danni.
4. Premere la scatola gialla nell'angolo destro del display del pannello di controllo per avviare il modulo di acquisizione (scatola verde sulla Figura 2A). La scatola gialla diventa verde e il menu del pannello di controllo verrà visualizzato sullo schermo ( Figura 2A).
5. Per l'acquisizione di B-Scan, selezionare l'opzione IR + OCT sul pannello di controllo ( Figura 2A). Le impostazioni selezionate sono evidenziate in blu sul pannello di controllo.
6. Selezionare " Retina " sotto " applicazione e struttura " nel software e spostare l'obiettivo verso l'occhio del mouse utilizzando il micromanipolatore sul dispositivo ( Figura 1). Prima messa a fuoco sulla retina, controllare che l'indicazione " OD " è selezionata nella parte inferiore sinistra dello schermo. Il software identifica automaticamente la sinistra (OS) e l'occhio destro (OD) basato sulla posizione dell'obiettivo.
   Nota: Se l'obiettivo è posizionato al centro della piattaforma, verrà visualizzato un messaggio di errore nella parte inferiore dello schermo. In tal caso, ri-posizionare il mouse leggermente fino a quando il software riconosce l'occhio corretta.
7. Con la manopola di messa a fuoco, fuoco sulla retina fino a grossi vasi appaiono chiaramente nell'immagine del fondo sulla sinistra dello schermo del computer. Spostare la fotocamera ruotando il micromanipolatore sinistra o destra, per muovere la telecamera in quella direzione, o in senso orario o in senso antiorario, per spostare la telecamera su o giù, rispettivamente.
   Nota: Riposizionare il mouse sulla piattaforma o spostare l'obiettivo verso l'alto o verso il basso per raggiungere la localizzazione preferita della testa del nervo ottico nell'immagine termografica.
8. Girare la manopola della sensibilità in senso antiorario per ridurre o in senso orario per aumentare la luminosità dell'immagine del fondo. Quando viene raggiunta la messa a fuoco ottima, un SD-OCT B-scan apparirà sulla destra dello schermo.
   Nota: Se la B-scan non possono essere visualizzate regolando la messa a fuoco, premere la combinazione Ctrl + Alt + Maiusc + O sulla tastiera. Nella finestra a comparsa, regolare il valore del braccio di riferimento fino a quando sullo schermo appare la B-scan.
9. Sulla parte inferiore destra dello schermo, scegliere la singola scansione dal menu modello (singola riga nella Figura 2B).
10. Girare il micromanipolatore del dispositivo ( Figura 1) sinistra, destra, avanti o indietro (per accendere la fotocamera in quella direzione) per garantire che la B-scan si trova tra la parte superiore e inferiore angoli di SD-OCT scansione finestra.
11. Impostare il valore automatico in tempo reale (arte) di almeno 9 per ottenere immagini di alta qualità.
    Nota: Arte migliora la qualità dell'immagine calcolando varie scansioni consecutive. Più alto il " ART " valore, più alto il rapporto segnale-rumore e quindi la qualità dell'immagine. Tuttavia, aumentando il " ART " valore, l'acquisizione di tempo inoltre è aumentata.
12. Premere il " acquisire " pulsante ( Figura 2) sullo schermo del pannello di controllo e acquisizione delle immagini.
13. Ri-posizionare il mouse per l'occhio sinistro di immagine e ripetere i passaggi 3.2-3.12.
14. Rimuovere la lente a contatto con le pinzette di plastica/silicone e inserirlo BSS.
15. Idratare la cornea del mouse con una fresca goccia di idrossipropilmetilcellulosa e rimuovere l'eccesso con una velina.
16. Rimuovere l'ottica standard 30 ° ruotandolo in senso antiorario.
17. Montare l'obiettivo di 55 ° e ripetere i passaggi 3.4-3.12 per ogni occhio.

4. Auto fluorescenza Imaging

1. senza spostare il mouse sulla piattaforma, selezionare IR sul pannello di controllo.
2. Con la manopola di messa a fuoco, concentrarsi su grandi vasi retinici.
3. Il pannello di controllo selezionare AF.
4. Ruotare la manopola della sensibilità in senso antiorario per ridurre o in senso orario per aumentare la luminosità dell'immagine.
5. Premere la manopola della sensibilità e impostare il " ART " valore di 67 o più per ottenere alta qualità immagini.
6. Quando il set " arte " è stato raggiunto il valore, premere " acquisire " sul pannello di controllo per acquisire l'immagine. Premere la manopola di sensibilità per interrompere una media. Regolare la messa a fuoco, per visualizzare i diversi strati retinici.
7. Rimuovere la lente 55° e montare l'obiettivo di 102° ampio campo. Attenersi alla seguente procedura 4.1 – 4.6 per entrambi gli occhi di ogni mouse e per ogni mouse.
8. Clic “ salvare le immagini ” sul bordo superiore sinistro della finestra e quindi fare clic su “ uscita ”. Per salvare le immagini nel computer, selezionare il mouse dall'elenco nella parte destra dello schermo facendo doppio clic sul nome del mouse. Fare doppio clic su ogni immagine separatamente e quindi fare clic sull'icona del disco floppy. Salvare l'immagine come TIF, BMP,. jpg o. png nella cartella desiderata. Per uscire premere software “ File ” e “ uscire ”.

5. Inversione di anestesia

1. idratare gli occhi del mouse con una goccia di idrossipropilmetilcellulosa e restituire il mouse su un termoforo.
2. Soluzione di atipamezolo Prepare in una dose di 2,25 mg/kg per invertire gli effetti sedativi di medetomidina cloridrato. Per un mouse 20g, aggiungere 9 µ l di atipamezol in un volume finale di 150 µ l PBS. Conservare la soluzione a 4 ° C fino a una settimana.
3. min dopo l'iniezione di anestesia (punto 2.2), iniettare per via sottocutanea 150 µ l di soluzione di atipamezolo.
4. Monitorare il mouse fino al recupero dall'anestesia. Quando il mouse è completamente recuperato (5-10 min dopo l'iniezione di atipamezolo) rimetterlo nella sua gabbia. Recupero è indicato per la capacità dell'animale di trasformare il suo corpo quando posto su un lato, ricupero di camminare attività e di reagire in risposta alla stimolazione ambientale.

6. Misura di spessore retinico manuale da SD-OCT immagini

1. aprire la scansione OCT facendo doppio clic sul nome dell'animale.
2. Aprire il B-scan ottenute con la lente di 30 ° o 55 °.
3. Scegli " profilo spessore ".
4. Premere il " modificare Layer segmentazioni " icona ( Figura 2B). Il software automaticamente identifica la limitazione interna e base membrana.
5. Se necessario, correggere manualmente la posizione di limitazione interna e base della membrana. A tale scopo, scegliere il livello da modificare dal lato sinistro dello schermo e quindi l'opzione cerchio rosso ( Figura 2B). Spostare il cerchio con il pulsante del mouse premuto per modificare la riga.
6. Modificare la riga per posizionare correttamente il livello corrispondente. Fare clic su " salvare e chiudere " per uscire dalla finestra.
   Nota: A causa della riflettività della coroide, il software può identificare la membrana base in modo non corretto. Pertanto, è preferibile definire manualmente prima di procedere con le misurazioni dello spessore retinico.
7. Scegli " Retina " sotto il " strato " opzione. Un diagramma di spessore retinico appariranno sulla parte inferiore dello schermo.
8. Fare clic su una posizione diversa del diagramma o su B-scan per visualizzare lo spessore retinico (indicato in µm) per la posizione selezionata.
9. Misurare lo spessore retinico la distanza desiderata dalla testa del nervo ottico e copiare i valori in un foglio di calcolo.
10. Ripetere i passaggi da 5,1-5,9 per ogni mouse per sia il 30 ° e la lente di 55 °.
11. Eseguire analisi statistica con software desiderato.

Risultati

Utilizzando il protocollo presentato qui, SD-OCT analizza e SLO immagini sono state ottenute da topi Cx3cr1^gfp/gfp nella stessa sessione di imaging. Figura 3 include rappresentante SD-OCT singole scansioni ottenute con un 30 ° o una lente di 55 ° (Figura 3A) e rappresentante SLO immagini ottenute con un 55 ° o una lente di 102 °, dove sono visualizzate le cellule di microglia positivo di gfp. Più alta ri...

Discussione

Il presente articolo viene illustrato un protocollo per l'acquisizione di B-scansioni della retina e l'imaging di gfp positivo microglia distribuzione nella retina di topo nella stessa sessione di imaging. SD-OCT e SLO sono sempre più utilizzati nei modelli animali della malattia retinica per fornire informazioni di alterazioni retiniche sopra tempo^{10,14,17,18,21}

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectralis Imaging system (HRA+OCT)	Heidelberg Engineering, Germany	N/A	ophthalmic imaging platform system
Heidelberg Eye Explorer	Heidelberg Engineering, Germany	N/A	Version 1.9.13.0
78D standard ophthalmic non-contact slit lamp lens	Volk Optical Inc., Ohio, USA	V78C
Spectralis wide angle 55° lens	Heidelberg Engineering, Germany	50897-002
ultra widefield 102° lens	Heidelberg Engineering, Germany	50117-001
medetomidine hydrochloride 1 mg/mL (Domitor)	Provet AG, Lyssach, Switzerland	Swissmedic Nr. 50'590 - ATCvet: QN05CM91	anesthetic/analgesic
ketamine 50mg/ml (Ketalar)	Parke-Davis, Zurich, Switzerland	72276388	anesthetic
tropicamide 0.5% + phenylephrine HCl 2.5% (Augentropfen mix)	ISPI, Bern, Switzerland	N/A	pupil dilation
Omnican Insulin-50 0.5 ml G30 0.3 x 12mm	B. Braun Mesungen AG, Carl-Braun-Straße, Germany	9151125
hydroxypropylmethylcellulose (Methocel 2%)	OmniVision, Neuhausen, Switzerland	N/A
+4 dpt rigid gas permeable contact lens	Quantum I, Bausch + Lomb Inc., Rochester, NY	N/A	Base Curve: 7.20 to 8.40 mm Diameter: 9.00 / 9.60 / 10.20 mm Power: -25.00 to +25.00 Diopters
balanced salt solution (BSS)	Inselspital, Bern, Switzerland	N/A
silicon forceps	N/A	N/A
atipamezole 5 mg/mL (Antisedan)	Provet AG, Lyssach, Switzerland	N/A	α2 adrenergic receptor antagonist
GraphPad Prism 7	GraphPad Software, Inc, San Diego, CA, USA	N/A	statistical analysis software