تعريب كمية البروتين غولجي بالتصوير كتلته مركز الأسفار

Summary

توطين سكان غولجي دقيقة أمر ضروري لفهم وظائف غولجي الخلوي. المجهر الضوئي التقليدية غير قادر على تحليل هيكل sub-غولجي. هنا يمكننا وصف البروتوكول لأسلوب الفحص المجهري التقليدي على أساس قرار فائقة لتحديد الكمية الترجمة sub-غولجي بروتين.

Abstract

ويتكون المجمع غولجي من الغشاء متسلسل مكدسة cisternae التي يمكن تصنيفها أيضا إلى مناطق فرعية-غولجي، بما في ذلك رابطة الدول المستقلة-غولجي، الآنسي-غولجي، عبر-غولجي و عبر-شبكة غولجي. الوظائف الخلوية من غولجي تتحدد بتوزيع المميزة البروتينات المقيم. القرار المكانية للفحص المجهري الخفيفة التقليدية منخفض جداً لحل الهيكل الفرعي-غولجي أو سيستيرناي. وهكذا، الميكروسكوب الإلكتروني المناعية والذهب أسلوب المفضل لترجمة بروتين على المستوى الفرعي-غولجي. ومع ذلك، تقنية وأداة تتجاوز قدرة معظم المعامل بيولوجيا الخلية. يصف لنا هنا لدينا طريقة وضعت مؤخرا القرار عظمى تسمى غولجي البروتين التعريب بالتصوير مراكز للإعلام (جليم) منهجياً وكمياً تعريب بروتين غولجي. جليم يستند إلى البروتوكولات القياسية fluorescence التوسيم والتقليدية واسع المجال أو مجاهر [كنفوكل]. أنها تنطوي على معايرة زيغ لوني تحول منظومة المجهرية، والحصول على صورة وتحليل ما بعد اكتساب. الترجمة sub-غولجي بروتين الاختبار كمياً يعبر كحاصل التعريب. وهناك أربع مزايا رئيسية من جليم؛ أنها سريعة، استناداً إلى الأساليب التقليدية وأدوات والتعريب والنتيجة الكمية، وأنه يتيح ~ 30 نانومتر القرار العملي على طول المحور غولجي. هنا يمكننا وصف البروتوكول مفصلاً من جليم إلى ترجمة اختبار البروتين غولجي.

Introduction

مجمع غولجي تلعب أدواراً أساسية في الاتجار الافرازية/اندوسيتيك للبروتينات والدهون (يشار إليها فيما بعد من الشحنات) في خلايا الثدييات^1،،من²³. في غولجي، الشحنات لا فرز لمختلف المكونات الخلوية دون بل أيضا تعديل بواسطة أنواع مختلفة من جليكوسيليشن. يتألف المجمع غولجي الثدييات عديدة مكدسات غولجي المتصلة جانبياً، الذي يتكون عادة من 4-11 الحويصلات غشاء محكم المتاخمة ومسطحة تسمى سيستيرناي. سيستيرناي غولجي متسلسل مكدسة تصنف مزيد، من واحدة من نهاية إلى أخرى، رابطة الدول المستقلة، والانسي و عبر-سيستيرناي. في ترانس-الجانب كدسة غولجي، عبر-معظم غشاء الكيس يتطور إلى شبكة أنبوبية والشبكة غشاء يسمى ترانس-شبكة غولجي (TGN)⁴. في مسار الافرازية، إدخال الشحنات المستمدة من هيولى (ER) مكدس غولجي في رابطة الدول المستقلة-الجانب وثم التتابع يمر الآنسي و عبر-سيستيرناي. الشحنات في نهاية المطاف إنهاء غولجي في ترانس-ديستينينج غولجي أو TGN إلى غشاء البلازما أو اندوسوميس أو حبيبات افرازية.

الآليات الجزيئية والخلوية كيفية عبور الشحنات كدسة غولجي وكيف يحافظ غولجي تنظيم cisternal تظل غامضة ولا يزال قيد نقاش المحتدم¹حاليا. واحدة من الصعوبات في هذا المجال أن cisternae غولجي يمكن حلها إلا تحت المجهر الإلكتروني (م) منذ حل المجهر الضوئي (~ 200 nm) غير كاف لحل cisternae غولجي الفردية (< 100 نانومتر في كلا سمك سيستيرنال والمسافة). ولذلك، تتحدد الترجمة sub-غولجي البروتينات المقيمين وعبور الشحنات تقليديا م المناعية والذهب. بيد أن م المناعية والذهب وتطالب جداً من الناحية الفنية وأنها تتجاوز قدرة معظم المعامل بيولوجيا الخلية. على الرغم من أن يمكن حل م نانومتر الفرعية، والقرار تتيحها م المناعية والذهب يعوقها كثيرا حجم جسم المعقدة (الابتدائية بالإضافة إلى الأجسام المضادة الثانوية) وجسيمات الذهب، ويمكن أن يكون أسوأ من 20 نانومتر. وعلاوة على ذلك، يتم الحصول على صور م من شرائح رقيقة 2D بدلاً من عرض ثلاثي الأبعاد عالمية غولجي، يمكن أن تؤدي إلى استنتاجات خاطئة استناداً إلى الموضع النسبي والتوجه ل قسم 2D⁵. على سبيل المثال، دراسة مقطع واحد م غير قادر على موثوق التفريق حويصلة من وجهة نظر متعامد أنبوب حيث يمكن أن يعرض كل ملامح الغشاء جولة مماثلة. الأخيرة ظهور تقنيات مجهرية فائقة القرار، مثل منظم 3D إضاءة مجهرية (3D-سيم)، وحفز الانبعاثات استنفاد (STED)، فوتواكتيفاتيد التعريب مجهرية (النخيل) والتعمير البصرية العشوائية مجهرية ( العاصفة)، يجعل من الممكن لحل الهياكل الفرعية-غولجي تحت المجهر الخفيفة⁶. ومع ذلك، هناك مالا يقل عن أربعة من السلبيات التي يمكن أن تحد بشكل كبير استخداماتها في دراسة الخلية البيولوجية غولجي. 1) تقنيات فائقة القرار الحالي يتطلب تكوين الأجهزة باهظة الثمن وخاصة الذي أبعد من معظم المعامل بيولوجيا الخلية. 2) بروتوكولات التوسيم الأسفار الخاصة اللازمة لبعض التقنيات فائقة القرار. 3) وعلى الرغم من هذه التقنيات بموجب الشرط أفضل، المطالبة نانومتر 20-110 في القرار المكانية، القرار عملية الحصول على عينات حقيقية يمكن أن تكون أسوأ بكثير. 4) بالمقارنة بالفحص المجهري التقليدي، هذه التقنيات فائقة القرار لا تزال تواجه صعوبات في إجراء متعدد الألوان، 3D أو يعيش خلية التصوير، أما منفردة أو مجتمعة. ربما الأهم من ذلك، م المناعية والذهب وتقنيات مجهرية فائقة القرار العائد النوعي بدلاً من البيانات الكمية ومسلم.

محاولة جزئيا في حل المشاكل المذكورة أعلاه، وقد وضعنا مؤخرا أسلوب الفحص المجهري خفيفة تقليدية على أساس، الذي يدعى غولجي البروتين التعريب بالتصوير مراكز للإعلام (جليم)، منهجياً وكمياً تعريب غولجي البروتين بدقة تعادل م المناعية والذهب⁷. في هذا الأسلوب، ينتشر غولجي في خلايا الثدييات مثقف غولجي ميني-مداخن بمعاملة نوكودازولي، دواء ديبوليميريزينج ميكروتوبولي. وقد أثبتت الدراسات الواسعة أن الناجمة عن نوكودازولي غولجي ميني-مداخن (يشار إليها فيما بعد غولجي ميني-مداخن) تشبه مكدسات غولجي الأصلية في كل من المنظمة والوظائف الخلوية^8،،من^{910، 11}. حاصل التعريب (LQ) لاختبار البروتين يمكن الحصول عليها عن طريق جليم وأنها ترمز إلى الترجمة sub-غولجي الكمية. ويمكن مقارنة القيم العددية ل LQs وقاعدة LQ أكثر من 25 غولجي علامات كانت متاحة.

في جليم، غولجي ميني-مداخن المسماة ثلاثية GM130 الذاتية أو عن مناشئ وجالت مشري واختبار بروتين (x). GM130 وجالت-مشري، رابطة الدول المستقلة-و عبر-علامات غولجي على التوالي^12،13، توفر نقطة مرجعية. الأخضر ثلاثية الأسفار، الأحمر (R)، (ز) واستعملنا (ب)، يتم عرض صورة مصطنعة كالأحمر والأخضر والأزرق، على التوالي. هو اعتمد مركز الكتلة الفلورية (يشار إليها فيما بعد مركز) لتحقيق القرار الفرعي بكسل. ويعرف المحور غولجي المتجه من مركز GM130 لتلك التي جالت مشري. وعلى غرار المكدس غولجي المصغر كهيكل أسطواني مع إنهائيه التماثل دوران حول محور غولجي. ولذلك، يمكن زيادة غرار غولجي كومة صغيرة كهيكل أحادي المحور غولجي. LQ من البروتين اختبار يعرف س د_س/d₁، الذي د_x هو المسافة من المركز العاشر إلى من GM130، بينما د₁ هي المسافة من مركز جالت-مشري لمن GM130. إذا كان مركز العاشر خارج المحور، يتم استخدام المسافة المحورية الإسقاط للحساب. المتغيرات، بما في ذلك غولجي المحور وزاوية المحوري، د_س، د₁، α زاوية وزاوية β، جليم تخطيطياً موضحة في الشكل 1. LQ مستقل من زاوية المحوري غولجي لو غولجي ميني-مداخن توجيه عشوائياً في خلية.

غولجي ميني-مداخن تظهر متنافرة في الصور. قمنا بتطوير ثلاثة معايير لتحديد أناليزابل غولجي ميني-مداخن جليم. 1) معيار نسبة الإشارة إلى الضجيج، الذي هو نسبة إجمالي كثافة غولجي كومة صغيرة للانحراف المعياري (SD) للخلفية ≥ 30 في كل قناة. هذا المعيار هو ضمان دقة تحديد المواقع الشامل للمركز، الذي يعتمد على نسبة إشارة إلى الضجيج غولجي ميني-مداخن. 2) معيار زاوية أو المسافة المحورية، الأمر الذي يتطلب د₁≥ 70 نانومتر. د₁ يتناقص مع زيادة الزاوية المحورية غولجي. عند الزاوية المحورية تقترب من 90° أو عمودي، يصبح كومة صغيرة غير الحل ك د₁ يقترب من 0. د₁≥ 70 نانومتر يمكن استبعاد فعالية قرب العمودي غولجي ميني-مداخن. 3) معيار co-الخطي، التي أما | تان α | أو | تان بيتا | هو ≤ 0.3. ويكفل هذا المعيار بما فيه الكفاية co الخطية لنموذجنا أحادي الأبعاد المكدس المصغر غولجي المراكز الثلاثة من كومة صغيرة. جميع المجاهر الخفيفة يعانون من زيغ التي يمكن أن تشوه خطير المواضع النسبية لمراكز ومضان أحمر وأخضر واستعملنا. زيغ نظم مجهر تجريبيا معايرة بالتصوير 110 نانومتر الخرز، والمسماة ثلاثية بالأسفار الحمراء والخضراء واستعملنا. لكل صورة حبة، وسط الأحمر يعرف الموقف الحقيقي من حبة ولوني تحولات من الأخضر واستعملنا مراكز مزودة بوظائف متعدد الحدود من الدرجة الأولى. مراكز غولجي ميني-مكدسات يتعرضون لوظائف متعدد الحدود لتصحيح اللوني التحولات في قنوات الأخضر واستعملنا.

من خلال جليم علينا التوصل إلى حل ل ~ 30 نانومتر على طول محور غولجي تحت الظروف القياسية. الأهم من ذلك، فإنه يوفر أسلوب المنهجي لتعيين أي البروتين غولجي كمياً. يمكن أن يؤديها جليم المجاهر التقليدية، مثل واسع المجال أو مجاهر [كنفوكل]، استخدام بروتوكولات وضع العلامات الفلورية شيوعاً. يمكن أن تأخذ بتصوير وتجهيز البيانات قصيرة قدر ساعة. جليم, أننا قد أظهر من خلال مباشرة الانتقال التدريجي من الشحنة الافرازية من رابطة الدول المستقلة-إلى ترانس-الجانب غولجي⁷.

Protocol

ملاحظة: فيما يلي بروتوكول خطوة بخطوة من جليم لتحديد المعلمة LQ اجفب تيروسيلبروتين سولفوترانسفيراسي 1 (TPST1)، مقيمين غولجي، إنزيم في خلايا هيلا.

1-إعداد غولجي المسمى Fluorescence ميني-مكدسات

1. إعداد كوفيرسليبس الزجاج
   1. المتوسطة (دميم الكوة 0.3 مل العقيمة دولبيكو تعديل النسر) إلى بئر صفيحة 24-جيدا في غطاء زراعة الأنسجة.
   2. مسح قطعة من Φ 12 مم No.1.5 ساترة الزجاج باستخدام ورقة الأنسجة اللينة مست مع الإيثانول 70% لإزالة الحطام على سطح ساترة زجاجية. استخدام زوج من ملاقط حادة بإيجاز نقع في ساترة في الإيثانول 70% وتحويلها إلى لوحة 24-جيدا وبالوعة إلى الجزء السفلي من دميم العقيمة التي تتضمن أيضا.
      ملاحظة: يجري تعقيم الزجاج كوفيرسليبس تقليديا المشتعلة. ومع ذلك، كوفيرسليبس تحت هذا العلاج الكراك بسهولة أثناء وبعد ذلك التعامل. مغطس الإيثانول 70% غير فعالة في تعقيم الزجاج كوفيرسليبس دون الأضرار بها.
   3. مع غطاء يغطي، اترك لوحة 24-جيدا في 37 درجة مئوية CO حاضنة₂ حتى الاستخدام.
2. خلايا البذور
   1. الثقافة هيلا الخلايا (يشار إليها فيما بعد الخلايا) في قارورة T-25 في دميم وتستكمل مع 10% الجنيني البقري المصل (FBS) (يشار إليها فيما بعد إكمال المتوسطة) في حاضنة₂ 37 درجة مئوية أول أكسيد الكربون تزويد 5% CO₂. المضادات الحيوية ليست ضرورية هنا.
   2. عندما تصل إلى الخلايا ~ كونفلوينسي 80%، نضح المتوسطة الثقافة. أضف 1 مل من 0.25% يدتا التربسين في قارورة واحتضان خلايا 37 درجة مئوية CO₂ حاضنة للحد الأدنى 2 أضف 1 مل المتوسطة كاملة في قارورة ومسح الخلايا خارج الجدار قارورة بلطف من بيبيتينج.
   3. نقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب الطرد المركزي العقيمة وتدور في ز 500 x لمدة 2 دقيقة بيليه الخلايا. نضح المادة طافية وتعليق بيليه خلية في المتوسط 1 مل كاملة.
   4. نضح المتوسطة في بئر جيدا 24 لوحة تتضمن ساترة زجاجية معقمة والبذور ~ 1 × 10⁵ خلايا في البئر. أعلى حجم البئر مع المتوسطة كاملة إلى 0.5 مل. احتضان في حاضنة₂ CO 37 درجة مئوية تزويد شركة 5%₂. الثقافة الخلايا إلى ~ كونفلوينسي 80%.
3. ترانسفيكت الخلايا
   ملاحظة: الخلايا انتشارا جيدا مفيدة يتم التصوير مشتتة غولجي ميني-مداخن.
   1. ترانسفيكت ~ 80% خلايا المتلاقية مع 80 نانوغرام مشري جالت⁷ و 320 نغ اجفب TPST1 والبلازميدات الحمض النووي (انظر الجدول للمواد) باستخدام كاشف تعداء وفقا للبروتوكول توفرها الشركة المصنعة. احتضان في حاضنة₂ 37 درجة مئوية أول أكسيد الكربون. تغيير المتوسطة بعد 4-6 ح الحاضنات. الخلايا على استعداد ~ 12 ح في وقت لاحق.
4. العلاج نوكودازولي لتوليد غولجي ميني-مكدسات
   1. تحضير حلاً أسهم نوكودازولي (33 ملم) بتذويب 10 مغ نوكودازولي مسحوق في 1 مل ثنائي ميثيل سلفوكسيد. قاسمة الحل الأسهم ومخزن في-20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
   2. تمييع 1 ميليلتر لحل نوكودازولي الأسهم (33 ملم) في 1 مل 37 درجة مئوية كاملة المتوسطة (تركيز نهائي 33 ميكرومتر). الطرد المركزي في سرعة قصوى لإزالة الجسيمات.
   3. نضح المتوسطة في البئر وإضافة 0.5 مل من 33 ميكرون نوكودازولي التي تحتوي على المتوسط كاملة. احتضان خلايا 37 درجة مئوية CO₂ حاضنة حاء 3 المضي قدما إلى الفلورة وسم (القسم 1.5).
5. وسم الفلورة
   ملاحظة: الاحتفاظ الخلايا في الظلام لتجنب فوتوبليتشينج جالت مشري و TPST1-اجفب.
   1. إعداد الكواشف لوسم الفلورة
      1. لإعداد 4% بارافورمالدهيد الحل، حل مسحوق بارافورمالدهيد 4% (w/v) في حارة 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وتصفية الحل عن طريق 0.45 ميكرومتر التصفية. ويمكن تخزين الحل عند-20 درجة مئوية.
         تنبيه: بارافورمالدهيد السامة والمسببة للسرطان، ويمكن أن يسبب تهيج الجلد. ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (معدات الوقاية الشخصية).
      2. لإعداد المخزن المؤقت لتمييع الفلورية (FDB)، مزيج 5% (v/v) FBS، و 2% (w/v) البقري ألبومين المصل (BSA) في برنامج تلفزيوني 1 x. تصفية الحل عن طريق 0.45 ميكرومتر التصفية وتخزين الحل عند-20 درجة مئوية.
      3. حل ز 5.35 NH₄مسحوق الكلور في الماء 1 لتر لإعداد 100 ملم NH₄Cl وتخزين الحل في درجة حرارة الغرفة.
      4. حل مسحوق صابونين 10% (w/v) في المياه إعداد 10% صابونين، الكوة، وتخزين الحل عند-20 درجة مئوية.
   2. التثبيت
      1. أشطف جيدا مرة واحدة مع 0.5 مل 1 × الحل برنامج تلفزيوني وإضافة 0.5 مل 4% بارافورمالدهيد الحل. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أشطف جيدا مرتين مع 0.5 مل س 1 برنامج تلفزيوني ومرتين مع 0.5 مل 100 ملم NH₄ألغ شطف جيدا مرتين مع 0.5 مل س 1 برنامج تلفزيوني. يمكن الاحتفاظ بالخلايا في برنامج تلفزيوني 1 x في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها في الظلام.
   3. وصف الأسفار
      1. تمييع 1 ميليلتر الماوس المضادة GM130 جسم الأولية في fdb بقدرة تبلغ 500 ميليلتر يحتوي على 0.1% صابونين. عكس غطاء لوحة 24-جيدا وتطبيق 10 ميليلتر جسم الابتدائي المخلوط على الغطاء.
      2. استخدام زوج من ملاقط حادة لاستخراج ونقل ساترة الزجاج على قطره من ضمان مزيج الأجسام المضادة التي إلى جانب الخلية على اتصال مع الخليط. احتضان الخلايا مع خليط جسم الأولية ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
         ملاحظة: يمكن وضع الغطاء مع ساترة في كيس من بلاستيك هوميديفيد في الظلام.
      3. استخدام زوج من ملاقط حادة لاستخراج ونقل ساترة إلى البئر بجانب الخلية أعلى وشطف في برنامج تلفزيوني 1 x 0.5 مل ثلاث مرات في ≥ 30 دقيقة هزت لا لزوم لها.
      4. تمييع 1 ميليلتر fluorophore استعملنا الماعز مترافق المضادة الماوس مفتش (جسم الثانوي) في 500 ميليلتر FDB تحتوي على صابونين 0.1%.
      5. غسل وتنظيف سطح عكسي لغطاء لوحة 24-جيدا. تطبيق 10 ميليلتر جسم ثانوي استعملنا المخلوط على الغطاء. كرر الخطوات 1.5.3.2-1.5.3.3.
   4. تصاعد
      1. إعداد متوسطة المتصاعدة بخلط الجلسرين ز 1، ز 2.2 poly(vinyl alcohol) (MW ~ دا 31,000)، 1.2 مل م 1 تريس (pH 8) و 8.8 مل ح₂O. حل الخليط في حمام مائي 60 درجة مئوية مع فورتيكسينج أحياناً. مخزن الحل عند-20 درجة مئوية.
      2. ذوبان الجليد المتوسطة المتصاعدة ونقل 10 ميليلتر إلى شريحة زجاج. تراكب ساترة (خلية الجانب الأسفل) إلى انخفاض المتوسط المتصاعدة. احتضان الشريحة الزجاجية في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أو درجة حرارة الغرفة ح 1 تتصلب المتوسطة المتصاعدة. ختم ساترة مع طلاء الأظافر عديم اللون وتخزين الشرائح الزجاجية في-20 درجة مئوية.

2-إعداد حبات الفلورسنت لتصحيح لوني التحول

1. تنظيف ساترة
   1. ضع بعناية قطعة من 25 مم No.1.5 الزجاج ساترة على رفوف بلاستيكية.
   2. نقل الرف ساترة لكوب 400 مل مليئة 300 مل 1 م هيدروكسيد الصوديوم و sonicate في سونيكاتور حمام (35 واط) لإيجاز 15 دقيقة شطف الرف في كوب 400 مل مليئة منزوع 300 مل من الماء. نقل الحامل إلى 400 مل كوب مليئة مل 300 99 ٪ الإيثانول و sonicate في سونيكاتور الحمام عن 15 دقيقة بإيجاز شطف الرف في كوب 400 مل مليئة منزوع 300 مل من الماء.
   3. كرر الخطوة 2.1.2 مرتين أخريين.
   4. شطف الرف مع ساترة في منزوع 300 مل من الماء في كوب 400 مل لأدنى 10 تكرار الخطوة مرتين أخريين. نقل الحامل إلى فرن 60 درجة مئوية والجاف ساترة حاء 1 مخزن ساترة المجففة في صحن بتري خالية من الغبار.
2. التثبيت حبات الفلورسنت على ساترة زجاجية
   1. شمال البحر الأبيض المتوسط 110 تمييع متعدد الألوان الفلورية الخرز 1 في 80-fold x برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1 ميكروغرام/ميليلتر جيش صرب البوسنة. باختصار دوامة أنبوب لتفريق المجاميع حبة. نشر 60 ميليلتر المخفف الخرز إلى Φ تنظيفها 25 مم No.1.5 الزجاج ساترة (انظر الفرع 2-1) استخدام تلميح ماصة. جاف ساترة في مجفف متصلاً بمضخة فراغ في الظلام وجبل ساترة إلى شريحة زجاج في 50 ميليلتر تصاعد المتوسطة (راجع الخطوة 1.5.4.2).

3. الحصول على الصور

ملاحظة: يتطلب جليم الصور من ارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء (دائرة الاستخبارات الوطنية) لحساب مركز الكتلة عالية الدقة. يمكن الحصول على الصورة بالمجاهر التقليدية مثل ليزر المسح [كنفوكل]، الغزل القرص [كنفوكل] أو واسع المجال المجهر. ويمكن استخدام مجهر واسع المجال مزودة بخطة اللازيغيه الهدف العدسات وجهاز استشعار صورة منخفضة ضوضاء، مثل جهاز اقتران (CCD) والعلمية التكميلية من أشباه الموصلات أكسيد المعدن (سكموس). يتم ضبط معلمات لاستشعار الصورة لضمان مجموعة ديناميكية القراءة-الضوضاء وارتفاع منخفض. يجب أن تكون مجهزة المجهر مع التكوين الأمثل لمرشحات الفلورية الخضراء ومشري واستعملنا فلوروفوري، وأنه يجب أن يكون لديك لا تذكر الأسفار عبر الحديث. ومن الناحية المثالية، يحقق نظام التصوير بمعدل أخذ عينات نايكست في x، محور y و z، التي تتطلب عادة x, y و z حجم فوكسل أن تكون أقل من 100، 100 و 200 نانومتر، على التوالي. X و y حجم فوكسل دائماً متساوون، ويشار إلى pixel_size. يمكن حساب pixel_size واسطة قسمة حجم جهاز استشعار الكاميرا التكبير النظام.

1. صورة الخرز متعدد الألوان
   1. صورة الخرز متعدد الألوان في قنوات الأخضر والأحمر واستعملنا في البداية ونهاية كل دورة التصوير.
      ملاحظة: هنا، الصور تم الحصول عليها من خلال مجهر التقليدي واسع المجال برنامج التحصين الموسع-الأسفار (مقلوب) مجهزة 100 1.4 X نا خطة اللازيغيه الهدف والمرحلة يجهز، 200 وات هاليد معدني مصدر الضوء وكاميرا سكموس 16-بت. الأطوال الموجية لتصفية الإثارة (شريط التمرير)، مرآة مزدوج اللون (تمرير طويل) وتصفية الانبعاثات (شريط التمرير) المكعب تصفية قناة الأخضر هي 465-495، 505 و 515-555 نانومتر؛ وهذه للمكعب تصفية القناة الحمراء 528-553، 565 و 578-633 شمال البحر الأبيض المتوسط؛ وهم للمكعب تصفية قناة استعملنا 590-650، 660، وشمال البحر الأبيض المتوسط 663-738. خلال اقتناء، حجم فوكسل على طول x، محور y و z 64 و 64 و 200 نانومتر، على التوالي.
   2. البحث عن مجال رؤية مع كثافة حبة جيدة.
   3. اكتساب رصات الصور ثلاثية الأبعاد في قنوات الأخضر والأحمر واستعملنا (قناة_ز، القناة_R، القناة_ب، على التوالي). يأخذ الأجزاء 3 أعلاه وأدناه أفضل المستوى البؤري (7 أقسام كل مكدس الذاكرة المؤقتة). حفظ كدسات ثلاثة كثلاثة ملفات TIFF.
      ملاحظة: يتحدد وقت التعرض لكل قناة تجريبية زيادة النطاق الديناميكي، وتجنب التشبع بكسل والتقليل من فوتوبليتشينج. ويتم اختيار المعلمات الأخرى، مثل المرشحات و x، y و z حجم فوكسل، كما نوقش أعلاه.
2. غولجي ميني-رصات الصور
   1. استخدام TPST1-اجفب وجالت مشري transfected والمسمى فلوريسسينتلي الشرائح (القسم 1.5) للبحث عن الخلايا أن التعبير عن TPST1-اجفب، ومستوى مشري جالت منخفضة أو متوسطة. اكتساب رصات الصور ثلاثية الأبعاد كما هو موضح في الخطوة 3.1.3.

4. تحليل الصورة

1. الحصول على مراكز حبات نيون
   1. في إيماجيج، قم بفتح مجموعة من الصور حبة تتكون من ثلاثة ملفات TIFF (ملف > صورة > فتح).
   2. متوسط 3 أقسام متتالية حول المقطع تركيزاً أفضل في قناة_آر بالصورة > رصات > المشروع Z. إدخال رقم القسم من "شريحة بدء" و "إيقاف شريحة"، ومن بين الخيارات "نوع العرض"، حدد "متوسط كثافة".
   3. رسم المناطق ذات الاهتمام (رويس) التي تحتوي على لا الخرز في الصورة باستخدام "التحديدات المضلع". في "تحليل > تعيين قياسات"، تحقق من فقط "يعني قيمة الرمادي" و "الانحراف المعياري". ثم تنفيذ "تحليل > التدبير" للحصول على متوسط والتنمية المستدامة من العائد على الاستثمار.
   4. حساب كثافة الخلفية ك "يعني + 6 × SD"_. طرح الصورة مع القيم المناظرة في كثافة الخلفية من "عملية > الرياضيات > طرح"، إدخال قيمة كثافة الخلفية المقابلة لهذه القناة.
   5. كرر الخطوات من 4.1.2 إلى 4.1.4 للقناة_ز والقناة_ب رصات الصور باستخدام نفس بدء وإيقاف الشريحة والخلفية نفس العائد على الاستثمار. علما بأن عائد الاستثمار المستخدمة في الخطوة 4.1.3 يمكن نسخها إلى قناة_ز والصور قناة_{ب .}
   6. دمج ثلاث صور طرح الخلفية (الصورة > لون > دمج القنوات) عن طريق تحديد قناة_آر كالأحمر، القناة_ز كالأخضر والقناة_ب اللون الأزرق. وسيتم الحصول على صورة مركبة واحدة تتكون من ثلاث قنوات.
   7. تشغيل إدارة العائد على الاستثمار (تحليل > أدوات > إدارة العائد على الاستثمار). رسم عائد مربعا حول الخرز واحد ضمان وجود حبة واحدة فقط ضمن كل عائد الاستثمار. إضافة العائد على الاستثمار لإدارة العائد على الاستثمار عن طريق الضغط على "t" في لوحة المفاتيح. كرر هذه العملية وإضافة رويس أكبر عدد ممكن.
   8. في "تحليل > تعيين قياسات"، تحقق من فقط "مركز الكتلة".
   9. حدد القناة_R، في إدارة العائد على الاستثمار، وانقر فوق "قياس" للحصول على المراكز؛ عمودان المقابلة إلى x و y سيتم عرض تنسيق مراكز رويس في نافذة "النتيجة". نسخ ولصق العمودين في جدول بيانات.
   10. كرر الخطوة 4.1.9 للقناة_ز والقناة_ب.
   11. ترتيب إحداثيات مراكز في جدول واحد بالترتيب التالي: x_R، ص_ص، س_ز، ص_ز، س_ب، وص_ب. حفظ جدول البيانات في تنسيق "csv." ك "beads.csv". ترك أي مساحة في اسم الملف.
2. تحديد وقياس غولجي ميني-مكدسات
   1. تثبيت وحدات الماكرو اثنين (مرفق في المواد التكميلية) في إيماجيج، "عائد الاستثمار الكلي-غولجي التفتيش" و "الماكرو الناتج 3 قنوات بيانات بالإضافات > تثبيت". واضح دوروا مدير وإطار النتائج.
   2. فتح مجموعة من الصور المصغرة مكدس الذاكرة المؤقتة غولجي تتألف من ثلاثة ملفات TIFF (ملف > صورة > مفتوحة).
   3. كرر الخطوات 4.1.2-4.1.5 وحفظ الصور خصم معلومات أساسية ثلاثة لاستخدامها في وقت لاحق. سجل خلفية الحزب الديمقراطي الصربي لقناة_آروالقناة_ز والقناة_ب SD_R، SD_ز و_بمن التنمية المستدامة، على التوالي، لاستخدامها لاحقاً.
   4. مكرر ثلاث صور خلفية طرح المتولدة من الخطوة 4.2.3 (Ctrl + Shift + D).
   5. في "عملية > صورة الإله الحاسبة"، قم أولاً بإضافة خلفية طرح القناة_ز للصور قناة_آر . إضافة الصورة الناتجة إلى صورة خلفية طرح القناة_ب . أن الصورة الناتجة، في "الصورة > ضبط > العتبة"، حدد "تعيين" لإدخال "1" كما "أدنى مستوى العتبة". بعد الضغط على "تطبيق"، هو أدى إلى صورة ثنائية أبيض وأسود.
   6. في "تحليل > تحليل الجزيئات"، إدخال نطاق حجم "حجم (بكسل ^ 2)". إدخال "50-اللانهاية". تحقق من "استثناء على حواف" و "إضافة إلى إدارة". رويس التي تتضمن غولجي ميني-مداخن الآن تضاف إلى إدارة العائد على الاستثمار.
      ملاحظة: حجم مجموعة يجب تجريبيا تحديد لاستبعاد أصوات وعموما صغيرة.
   7. دمج ثلاث صور طرح الخلفية (الصورة > لون > دمج القنوات) من الخطوة 4.2.3 بتحديد قناة_آر كالأحمر، القناة_ز كالأخضر والقناة_ب اللون الأزرق. يتم إنشاء صورة مركبة واحدة تتكون من ثلاث قنوات.
   8. تشغيل الماكرو "عائد الاستثمار الكلي-غولجي التفتيش" عن طريق تحديد "الإضافات > التفتيش دوروا غولجي الماكرو". في مربع الحوار التفاعلي، افحص بصريا كل عائد الاستثمار الحفاظ أو رفضها. حدد رويس التي تحتوي على كائن واحد في جميع القنوات الثلاث.
      ملاحظة: بعد تشغيل هذه الأداة، يتم حلها رويس المرفوضة من إدارة العائد على الاستثمار.
   9. تحقق من فقط "المنطقة"، "متوسط قيمة الرمادي" و "مركز الكتلة" "تحليل > القياسات المحددة". الحصول على البيانات من خلال إطلاق أداة ماكرو "الماكرو الناتج 3 قنوات البيانات" (الإضافات > القنوات 3 الماكرو-إخراج البيانات).
      ملاحظة: يتم عرض المناطق وكثافة يعني مراكز رويس (س وص) في قناة_آروالقناة_ز والقناة_ب في إطار "النتائج".
   10. نسخ x و y إحداثيات مراكز في جدول بيانات وترتيبها حسب الترتيب التالي: x_R، ص_ص، س_ز، ص_ز، س_ب، وص_ب. حفظ جدول البيانات كملف "csv."مينيستاكس(csv.). ترك أي مساحة في اسم الملف. الشروع في تصحيح لوني التحول من المراكز (الفرع 4-3) وحساب LQ (الفرع 4-4).
3. تصحيح لوني-التحول من مراكز
   1. تثبيت Matlab برنامج التحويل البرمجي وقت التشغيل (MCR).
   2. تثبيت الملفات التالية في مجلد عمل مخصصة: my_train.exe و my_test.exe. نسخ ولصق "beads.csv" و "مينيستاكس.csv" الملفات في نفس المجلد.
   3. بدء تشغيل "موجه الأوامر" من Windows وتذهب إلى مجلد العمل عن طريق كتابة الأمر التالي " مؤتمر نزع السلاح path_of_working_folder".
   4. إنشاء ملف معايرة التحول اللوني باستخدام مراكز خرز. اكتب الأمر التالي "my_train.exe الخرز.csv المعايرة.mat 1". يتم إنشاء ملف يسمى ".matالمعايرة" في مجلد العمل. تجاهل الملفات الأخرى التي يتم إنشاؤها.
   5. تصحيح اللوني-التحول في مراكز غولجي ميني-مكدسات بكتابة الأمر التالي "my_test.exe مينيستاكس.csv corrected_ministacks.csv المعايرة.mat 1".
      ملاحظة: يتم إنشاء ملف باسم "corrected_ministacks.csv" في مجلد العمل. أنه يحتوي على إحداثيات مراكز، والتي هي مرتبة في الترتيب س_زص_ز، س_ب وص_بتصحيح لوني التحول. تجاهل الملفات الأخرى التي يتم إنشاؤها. الإحاطة علما بأن يعرف قناة الأحمر خالية من زيغ ومن ثم س_ص وص_آر هي نفس البيانات الخام.
4. حساب LQs
   1. إطلاق برامج تحليل البيانات ونسخ ولصق، في أدناه تسلسل، يعني قيم رمادية، المناطق الخلفية مخزونات النشر الاستراتيجي التي تم الحصول عليها من الخطوة 4.2.3 (مكان لهم في الصف 1) وتصحيح تحول لوني x و y إحداثيات غولجي ميني-مكدسات في قناة_آر في ورقة عمل كأعمدة ألف إلى هاء وبالمثل، نقل البيانات المقابلة للقناة_ز والقناة_ب للأعمدة من F إلى ي وك أن س، على التوالي.
   2. إضافة أعمدة جديدة ثمانية ف أن ث، يدعى "كثافة المتكاملة لقناة آر"، "كثافة المتكاملة للقناة ز"، "كثافة المتكاملة للقناة ب"، d1، dx، ABS(tan a)، وتقاسم المنافع (ب تان) و LQ.
      1. الحق انقر فوق رأس العمود الخاصة بكل منها وحدد "تعيين قيم العمود" لحساب القيم في كل عمود. لعمود ف، إدخال "Col(A)Col(B)"؛ لعمود الإدخال فاء، "Col(F)Col(G)"؛ لعمود البحث، إدخال "Col(K)Col(L)"؛ للعمود S، الإدخال "pixel_size*Distance(Col(D)، Col(E)، Col(N)، Col(O))" حيث "pixel_size" هو حجم بكسل في شمال البحر الأبيض المتوسط؛ لعمود T، الإدخال "pixel_size*((Distance(Col(I)، Col(J)، Col(N)، Col(O))^2+Distance(Col(D)، Col(E)، Col(N)، Col(O))^2-Distance(Col(D)، Col(E)، Col(I)، Col(J))^2)/(2Distance(Col(D)، Col(E)، Col(N)، Col(O)))"؛ لعمود يو، الإدخال "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(I)، Col(J)، Col(N)، Col(O))^2+Distance(Col(D)، Col(E)، Col(N)، Col(O))^2-Distance(Col(D)، Col(E)، Col(I)، Col(J))^2)/(2 Distance(Col(I)، Col(J)، Col(N)، Col(O))Distance(Col(D) ، Col(E)، Col(N)، Col(O))) "؛ للعمود الخامس، الإدخال "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(D)، Col(E)، Col(I)، Col(J))^2+Distance(Col(D)، Col(E)، Col(N)، Col(O))^2-Distance(Col(I)، Col(J)، Col(N)، Col(O))^2)/(2 Distance(Col(D)، Col(E)، Col(I)، Col(J))Distance(Col(D) ، Col(E)، Col(N)، Col(O))) "؛ لعمود ث، إدخال "العقيد (T)/Col (S)".
   3. تصفية غولجي ميني-رزمة من المعايير الثلاثة المبينة في مقدمة.
      1. في برنامج تحليل البيانات، انتقل إلى "ورقة العمل > ورقة عمل الاستعلام" وحدد العمود المتغيرات لاختبار "إذا". تعيين الأسماء المستعارة التالية I1, I2, I3، d1، A و B للأعمدة "كثافة المتكاملة لقناة آر"، "كثافة المتكاملة للقناة ز"، "كثافة المتكاملة للقناة ب"، d1، ABS(tan a)، وتقاسم المنافع (تان ب)، على التوالي. في "إذا كان الشرط" مربع الإدخال "I1 > =30*cell(1,3) و I2 > =30*cell(1,8) و I3 > =30*cell(1,13) d1 > = 70 (A < = 0.3 أو ب < = 0.3)".
      2. حدد "استخراج إلى ورقة عمل جديدة"، انقر فوق "تطبيق". يتم استخراج الأعمدة A-W أناليزابل غولجي ميني-مكدسات إلى ورقة عمل جديدة.
   4. في ورقة عمل جديدة، انقر الحق أعلى العمود ث، حدد "الإحصاءات على عمود > الحوار مفتوحة". الاختيار "المجموع ن"، و "تعني"، "سراج الدين يعني"، "الرسوم البيانية". ثم يتم عرض التحليل الإحصائي ل LQs.

النتائج

مجهر الضوء الصف البحوث الحديثة مزودة بعدسة اللازيغيه خطة، مثل تلك المستخدمة في المختبر لدينا، يظهر أدنى انحراف لوني (الشكل 2أ). ومع ذلك، يمكن أن تكشف عن دراسة متأنية للصورة متعدد الألوان الفلورية حبة تحول الصور لون مختلف لنفس حبة (الشك...

Discussion

سابقا، كانت أساسا كمياً التعريب بروتين غولجي تحت المجهر الخفيفة بدرجة الترابط أو التداخل في صورة البروتين بصورة علامة غولجي التعريب المعروفة^{15،16، 17}. العلاقة الناتجة أو معامل تداخل يعكس مدى قرب اختبار البروتين علامة غولجي مكانياً. وهناك ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads	Invitrogen	T7279	As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope.
Glass coverslip Φ 12 mm (No. 1.5)	Menzel	CB00120RAC
Glass coverslip Φ 25 mm (No. 1.5)	Menzel
DMEM	Capricon	DMEM-HPA-P50
Trypsin-EDTA
FBS	GE Hyclone	SV30160.03
Nocodazole	Merck	487928
transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
transfection medium. Commercial name: OptiMEM	Invitrogen	31985070
TPST1-EGFP	Addgene	66617	A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom)
GalT-mCherry			Made in our lab.
paraformaldehyde	Merck	1.04005.1000
saponin	Sigma-Aldrich	47036
poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488	CALBIOCHEM	475904
BSA	Sigma-Aldrich	A9647
Mouse anti-GM130	BD Biosciences	610823	Primary antibody for human GM130
far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG	Invitrogen	A-21235	Far red fluorescence conjugated secondary antibody