Quantitativa localizzazione di una proteina di Golgi da Imaging sua massa centro di fluorescenza

Riepilogo

La precisa localizzazione dei residenti di Golgi è essenziale per la comprensione delle funzioni cellulari di Golgi. Tuttavia, la microscopia ottica convenzionale non riesce a risolvere la struttura sub-Golgi. Qui descriviamo il protocollo per un metodo di Super-risoluzione di microscopia convenzionale basato determinare quantitativamente la localizzazione sub-Golgi di una proteina.

Abstract

Il complesso di Golgi è costituito da cisterne di membrana impilate in serie che possono essere ulteriormente classificate in regioni sub-Golgi, tra cui il cis-Golgi, mediale-Golgi, trans-Golgi e trans-Golgi network. Funzioni cellulari di Golgi sono determinate tramite la distribuzione caratteristica delle sue proteine residenti. La risoluzione spaziale di microscopia chiara convenzionale è troppo bassa per risolvere la struttura sub-Golgi o cisterne. Così, la microscopia elettronica di immuno-oro è un metodo di scelta per la localizzazione di una proteina a livello sub-Golgi. Tuttavia, la tecnica e lo strumento sono oltre la capacità della maggior parte dei laboratori di biologia delle cellule. Descriviamo qui il nostro metodo sviluppato di recente super-risoluzione chiamato la localizzazione della proteina di Golgi da imaging centri di massa (GLIM) sistematicamente e quantitativamente localizzare una proteina di Golgi. GLIM è basato su protocolli d'etichettatura fluorescenza standard e grandangolari convenzionali o microscopi confocali. Coinvolge la calibrazione di aberrazione cromatica-spostamento del sistema al microscopio, l'acquisizione dell'immagine e l'analisi post-acquisizione. La localizzazione sub-Golgi di una proteina di prova è espressa quantitativamente come il quoziente di localizzazione. Ci sono quattro principali vantaggi del GLIM; è rapido, basato su strumenti e metodi convenzionali, il risultato di localizzazione è quantitativo e offre ~ 30 risoluzione pratica nm lungo l'asse di Golgi. Qui descriviamo il protocollo dettagliato di GLIM per localizzare un test della proteina di Golgi.

Introduzione

Il complesso di Golgi gioca ruoli essenziali secretiva/endocitico traffico di proteine e lipidi (d'ora in poi carichi) in cellule di mammifero^1,2,3. Al Golgi, carichi sono non solo ordinati ai vari compartimenti sub-cellulari ma anche modificati da diversi tipi di glicosilazione. Il complesso di Golgi dei mammiferi comprende numerosi lateralmente collegate pile di Golgi, che in genere consiste di 4-11 sacs di membrana strettamente adiacenti e piatto chiamato cisterne. Delle cisterne di Golgi in serie in pila vengono ulteriormente classificate, da un'estremità a altra, come CSI, mediale e trans-cisterne. Presso il trans-lato di uno stack di Golgi, la trans-sac membrana la maggior parte si sviluppa in una rete di membrana tubolare e reticolo chiamata trans-Golgi network (TGN)⁴. Nella via secretiva, carichi derivati dal reticolo endoplasmatico (ER) inserire una pila di Golgi al suo cis-lato e poi in sequenza passano attraverso mediale e trans-cisterne. Carichi alla fine uscire il Golgi presso il trans-Golgi o TGN destinava alla membrana plasmatica, endosomi o granuli secretori.

I meccanismi molecolari e cellulari di come carichi transitano una pila di Golgi e come il Golgi mantiene la sua organizzazione citernale rimangono misteriosi e sono attualmente ancora in un acceso dibattito¹. Una delle difficoltà in questo campo è che cisterne di Golgi possono essere risolto solo sotto la microscopia elettronica (EM) dopo la risoluzione di un microscopio ottico (~ 200 nm) è insufficiente a risolvere singoli cisterne di Golgi (< 100 nm in entrambi citernale spessore e distanza). Pertanto, la localizzazione sub-Golgi proteine residenti e carichi in transito sono convenzionalmente determinato dal EM di immuno-oro. Tuttavia, il EM di immuno-oro è tecnicamente molto impegnativo ed è oltre la capacità della maggior parte dei laboratori di biologia delle cellule. Anche se la risoluzione di EM può essere sub-nanometrica, la risoluzione offerta dal EM di immuno-oro è notevolmente ostacolata dalle dimensioni dell'anticorpo complesso (primaria più l'anticorpo secondario) e la particella d'oro e può essere peggio di 20 nm. Inoltre, immagini di EM sono ottenuti da sottili sezioni 2D anziché una vista 3D globale di Golgi, che può portare a conclusioni errate a seconda della posizione relativa e l'orientamento della sezione 2D⁵. Ad esempio, studiando un singolo-sezione EM è in grado di differenziare in modo affidabile una vescicola dalla visualizzazione ortogonale di un tubulo poiché entrambi in grado di visualizzare profili identici della membrana rotonda. Il recente avvento di tecniche di microscopia di Super-risoluzione, come microscopia di illuminazione strutturato 3D (3D-SIM), stimolato svuotamento dell'emissione (STED), microscopia di fotoattivazione localizzazione (PALM) e stocastico ricostruzione ottica microscopia ( TEMPESTA), permette di risolvere strutture sub-Golgi sotto microscopi ottici⁶. Tuttavia, ci sono almeno quattro inconvenienti che possono limitare significativamente il loro impiego nello studio biologico delle cellule di Golgi. 1) le attuali tecniche di Super-risoluzione richiedono la configurazione di hardware costoso e speciale che è di là maggior parte dei laboratori di biologia delle cellule. 2) protocolli d'etichettatura fluorescenza speciali sono necessari per alcune tecniche di Super-risoluzione. 3) anche se, sotto la condizione migliore, queste tecniche sostengono 20-110 nm in risoluzione spaziale, la risoluzione pratica ottenuta in campioni reali può essere molto peggio. 4) In confronto a microscopia convenzionale, queste tecniche di Super-risoluzione ancora hanno difficoltà nel condurre multicolor, 3D o live cell imaging, singolarmente o in combinazione. Probabilmente la cosa più importante, sia EM immuno-oro e le tecniche di microscopia di Super-risoluzione resa qualitativa anziché dati di localizzazione quantitativa.

Tentando di risolvere parzialmente i problemi di cui sopra, abbiamo recentemente sviluppato un metodo di microscopia chiara convenzionale basato, che è denominato la localizzazione della proteina di Golgi da imaging centri di massa (GLIM), sistematicamente e quantitativamente localizzare un Golgi proteina a una risoluzione equivalente a quella della immuno-oro EM⁷. In questo metodo, il Golgi in cellule di mammiferi coltivate è disperso come mini-stack di Golgi dal trattamento di nocodazole, una droga depolimerizzanti dei microtubuli. Studi approfonditi hanno dimostrato che indotta da nocodazole Golgi mini-stack (in seguito Golgi mini-stack) sono molto simili gli stack in organizzazione e funzioni cellulari^{8,9,10, nativi di Golgi 11}. Il quoziente di localizzazione (LQ) di una proteina di prova possa essere acquistato attraverso GLIM e denota la localizzazione sub-Golgi quantitativa. I valori numerici di LQs può essere confrontati e un database LQ di più di 25 indicatori di Golgi è stato disponibile.

In GLIM, Golgi mini-stack sono triple-etichettati da endogeno o esogenicamente espresso GM130, GalT-mCherry e la proteina di test (x). GM130 e GalT-mCherry, cis- e trans-Golgi marcatori rispettivamente^12,13, fornire punti di riferimento. La fluorescenza Tripla, rossa (R), verde (G) e da' (B), artificialmente vengono visualizzati come rosso, verde e blu, rispettivamente. Centro di massa di fluorescenza (in seguito centro) è adottato per realizzare sub-pixel di risoluzione. L'asse di Golgi è definito come il vettore dal centro di GM130 a quella di GalT-mCherry. Lo mini-stack di Golgi è modellato come una struttura cilindrica con infinito simmetria di rotazione attorno all'asse di Golgi. Di conseguenza, una mini-pila Golgi possa essere ulteriormente modellata come una struttura unidimensionale lungo l'asse di Golgi. Il LQ della proteina della prova x è definito come d_x/d₁, in cui d_x è la distanza dal centro della x a quella di GM130, mentre d₁ è la distanza dal centro di GalT-mCherry a quella di GM130. Se il centro di x è fuori asse, la sua distanza di proiezione assiale è utilizzato per il calcolo. Le variabili, tra cui Golgi asse, angolo assiale, d_x, d₁, angolo α e β angolo, per GLIM sono schematicamente illustrate nella Figura 1. LQ è indipendente dell'angolo assiale Golgi anche se mini-stack di Golgi orientare in modo casuale in una cella.

Golgi mini-stack appaiono disomogeneo nelle immagini. Abbiamo sviluppato tre criteri per selezionare analyzable Golgi mini-stack per GLIM. 1) il criterio del rapporto segnale-rumore, in cui il rapporto tra l'intensità totale di una mini-pila Golgi per la deviazione standard (SD) dello sfondo è ≥ 30 in ciascun canale. Questo criterio è quello di garantire la precisione di posizionamento del centro di massa, che dipende i rapporti segnale-rumore di Golgi mini-stack. 2) il criterio di angolo o la distanza assiale, che richiede d₁≥ 70 nm. d₁ diminuisce all'aumentare dell'angolo assiale Golgi. Quando l'angolo assiale si avvicina a 90° o verticale, mini-stack diventa non-risolvibile come d₁ si avvicina a 0. d₁≥ 70 nm può escludere efficacemente vicino verticale Golgi mini-stack. 3) il criterio della co-linearità, in cui uno | tan α | o | tan β | è ≤ 0,3. Questo criterio assicura che i tre centri di un mini-stack sono sufficientemente co-lineare per il nostro modello unidimensionale della mini-pila Golgi. Tutti i microscopi ottici soffrono di aberrazione cromatica che può distorcere seriamente le posizioni relative dei centri di rosso, verde e da' fluorescenza. Aberrazione cromatica di sistemi di microscopia è calibrato sperimentalmente da imaging 110 perline di nm, che sono triple-etichettati da fluorescenza rosso, verde e da'. Per ogni immagine della perla, il centro di rosso è definito come la vera posizione del tallone e cromatico-turni di verdi e da' centri dispongono di funzioni polinomiali di primo ordine. Centri di Golgi mini-stack sono sottoposti alle funzioni polinomiali per correggere il cromatica-turni nei canali verde e da'.

Attraverso GLIM possiamo ottenere una risoluzione di ~ 30 nm lungo l'asse di Golgi in condizioni standard. Cosa importante, fornisce un metodo sistematico per mappare quantitativamente qualsiasi proteina di Golgi. GLIM può essere eseguita da microscopi convenzionali, quali grandangolari o microscopi confocali, utilizzando comuni protocolli d'etichettatura di fluorescenza. La formazione immagine e elaborazione dati può prendere più breve come un'ora. Attraverso GLIM, abbiamo direttamente dimostrato la progressiva transizione del carico secretiva da cis- Trans-lato del Golgi⁷.

Protocollo

Nota: Di seguito è un protocollo dettagliato di GLIM per determinare la sulfotransferasi etichetta LQ di EGFP tyrosylprotein 1 (TPST1), un enzima residente di Golgi, in cellule HeLa.

1. preparazione di Golgi fluorescenza-etichetta Mini-stack

1. Preparare vetrini coprioggetti
   1. Medium (DMEM aliquotare 0,3 mL sterile Dulbecco per volta dell'Aquila) in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti in una cappa di coltura del tessuto.
   2. Pulire un pezzo di Φ 12mm No.1.5 vetrino coprioggetti utilizzando carta dei tessuti molli tamponata con etanolo al 70% per rimuovere i detriti sulla superficie del vetrino coprioggetti. Utilizzare un paio di pinzette taglienti per brevemente immergere il vetrino coprioggetto in etanolo al 70%, trasferirlo nella piastra 24 pozzetti e affondare fino in fondo il DMEM sterile contenente.
      Nota: Vetrini coprioggetti convenzionalmente sono sterilizzati con fiammeggiante. Tuttavia, le lamelle sotto tale trattamento facilmente crack durante la movimentazione successivamente. 70% etanolo ammollo è efficace in lamelle di vetro di sterilizzazione senza danneggiarli.
   3. Con il coperchio rivestito, lasciare la piastra a 24 pozzetti a 37 ° C CO₂ incubatore fino all'utilizzo.
2. Cellule di seme
   1. Cellule HeLa cultura (d'ora in avanti, le cellule) in una beuta, T-25 in DMEM supplementato con 10% fetale bovino del siero (FBS) (qui di seguito completa medio) in un incubatore a 37 ° C CO₂ fornita con 5% CO₂. Gli antibiotici non sono necessari qui.
   2. Quando le cellule raggiungono ~ 80% confluency, aspirare il terreno di coltura. Aggiungere 1 mL di 0,25% tripsina-EDTA nel pallone e incubare le cellule in un incubatore a 37 ° C CO₂ per 2 min. aggiungere 1 mL di terreno completo nel pallone e lavare delicatamente le cellule dal muro pallone pipettando.
   3. Trasferire cellule indipendente in un tubo sterile centrifugazione e spin a 500 x g per 2 min agglomerare le cellule. Aspirare il supernatante e sospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno completo.
   4. Aspirare il mezzo nel pozzo della piastra a 24 pozzetti contenente il vetrino coprioggetti di vetro sterilizzati e seme ~ 1 x 10⁵ celle nel pozzo. Rabboccare il volume del pozzo con terreno completo a 0,5 mL. Incubare in incubatore a 37 ° C CO₂ fornito con 5% CO₂. Coltura le cellule a ~ confluency di 80%.
3. Transfect cellule
   Nota: Le cellule ben diffuse sono vantaggiose per imaging dispersi Golgi mini-stack.
   1. Transfect ~ 80% cellule confluenti con 80 ng GalT-mCherry⁷ e 320 ng TPST1-EGFP plasmidi di DNA (Vedi Tabella materiali) utilizzando un reagente di transfezione secondo il protocollo fornito dal produttore. Incubare in incubatore a 37 ° C CO₂ . Modificare il mezzo dopo 4-6 h di incubazione. Le cellule sono pronte ~ 12 ore più tardi.
4. Trattamento di nocodazole per generare mini-stack di Golgi
   1. Preparare una soluzione stock di nocodazole (33 mM) sciogliendo 10 mg di polvere nocodazole in dimetilsolfossido di 1 mL. Aliquota della soluzione di riserva e conservare a-20 ° C per la conservazione a lungo termine.
   2. Diluire 1 µ l di soluzione madre nocodazole (33 mM) in 1 mL completa di terreno di 37 ° C (concentrazione finale 33 µM). Centrifugare a massima velocità per rimuovere il particolato.
   3. Aspirare il mezzo nel pozzo e aggiungere 0,5 mL di 33 nocodazole µM contenenti sostanza completa. Incubare le cellule in un incubatore a 37 ° C CO₂ per 3 h. procedere per immunofluorescenza etichettatura (punto 1.5).
5. Etichettatura di immunofluorescenza
   Nota: Mantenere le cellule al buio per evitare photobleaching di GalT-mCherry e TPST1-EGFP.
   1. Preparare i reagenti per l'etichettatura di immunofluorescenza
      1. Per preparare la soluzione di paraformaldeide 4%, sciogliere la polvere di paraformaldeide 4% (p/v) in caldo 1x tamponato fosfato salino (PBS) e filtrare la soluzione attraverso filtro a 0,45 µm. La soluzione può essere conservata a-20 ° C.
         Attenzione: Paraformaldeide è tossico e cancerogeno e può causare irritazione cutanea. Indossare gli appropriati dispositivi di protezione individuale (PPE).
      2. Per preparare il tampone di diluizione di fluorescenza (FDB), mescolare 5% (v/v) FBS e il 2% (p/v) di albumina di siero bovino (BSA) in PBS 1X. Filtrare la soluzione attraverso filtro a 0,45 µm e conservare la soluzione a-20 ° C.
      3. Sciogliere g 5,35 NH₄Cl di polvere in 1 litro d'acqua per preparare 100 mM NH₄Cl e conservare la soluzione a temperatura ambiente.
      4. Sciogliere la polvere di saponina del 10% (p/v) in acqua per preparare 10% saponine, aliquotare e conservare la soluzione a-20 ° C.
   2. Fissazione
      1. Sciacquare una volta ben con 0,5 mL 1 x soluzione PBS e aggiungere 0,5 mL di soluzione di paraformaldeide 4%. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Sciacquare il ben due volte con PBS 1x 0,5 mL e due volte con 0,5 mL 100 mM NH₄cl. Sciacquare bene due volte con PBS 1x 0,5 mL. Le cellule possono essere tenute in 1X PBS a 4 ° C durante la notte nel buio.
   3. Etichettatura di fluorescenza
      1. Diluire 1 µ l del mouse anti-GM130 anticorpo primario in saponina di 500 µ l FDB contenente 0,1%. Invertire il coperchio della piastra 24 pozzetti e applicare 10 µ l anticorpo primario miscela sul coperchio.
      2. Utilizzare un paio di pinzette taglienti per estrarre e trasferire il vetrino coprioggetti sulla goccia di anticorpo miscela garantendo che il lato cella è a contatto della miscela. Incubare le cellule con la miscela di anticorpo primario per 1 h a temperatura ambiente.
         Nota: Il coperchio con il vetrino coprioggetti può essere collocato in un sacchetto di plastica umidificato al buio.
      3. Utilizzare un paio di pinzette taglienti per estrarre e trasferire il coprioggetto al pozzo con il lato di cella fino e sciacquarlo in 0,5 mL di PBS 1X per tre volte in ≥ 30 min agitazione è inutile.
      4. Diluire 1 µ l da' fluoroforo capra coniugato anti-IgG di topo (anticorpo secondario) di saponine di 500 µ l FDB contenente 0,1%.
      5. Lavare e pulire la superficie d'inversa del coperchio della piastra 24 pozzetti. Applicare 10 µ l anticorpo secondario da' miscela sul coperchio. Ripetere i passaggi 1.5.3.2 - 1.5.3.3.
   4. Montaggio
      1. Preparare il mezzo di montaggio con 1 g di glicerolo, 2,2 g poly(vinyl alcohol) (MW ~ Da 31.000), 1,2 mL 1 M Tris (pH 8) e 8,8 mL H₂O. sciogliere il composto a bagnomaria a 60 ° C con occasionalmente nel Vortex. Conservare la soluzione a-20 ° C.
      2. Scongelare il mezzo di montaggio e trasferire 10 µ l su una lastra di vetro. Sovrapporre il coprioggetto (lato della cella verso il basso) sulla goccia di mezzo di montaggio. Incubare il vetrino a 37 ° C per 30 minuti o a temperatura ambiente per 1 h indurire il mezzo di montaggio. Sigillare il coprioggetto con smalto incolore e conservare il vetrino a-20 ° C.

2. preparazione di perline fluorescenti per la correzione cromatica-shift

1. Vetrino coprioggetti pulizia
   1. Posizionare con attenzione un pezzo di 25 mm No.1.5 vetrino coprioggetti su una cremagliera in plastica.
   2. Trasferimento del rack con il vetrino coprioggetti in un becher da 400 mL riempita con 300 mL 1 M NaOH e Sonicare in un sonicatore vasca (35 watt) per 15 min. brevemente risciacquare il rack in un becher da 400 mL riempita con 300 mL di acqua deionizzata. Trasferire il rack in un becher da 400 mL riempito con 300 mL di etanolo al 99% e Sonicare nel sonicatore vasca per 15 min. brevemente risciacquare il rack in un becher da 400 mL riempita con 300 mL di acqua deionizzata.
   3. Ripetere il punto 2.1.2 altre due volte.
   4. Sciacquare il rack con il vetrino coprioggetti in 300 mL di acqua deionizzata in un becher da 400 mL per 10 min. Ripetere il passo due volte. Trasferire il rack a forno a 60 ° C e asciugare il vetrino coprioggetto per 1 h. Store il coprioggetto secco in una capsula Petri privo di polvere.
2. Immobilizzazione di perline fluorescenti su vetrino coprioggetti
   1. Diluire 110 nm multi-colore fluorescente perle 80-fold in 1 x PBS contenente 0,1 µ g/microlitro BSA. Vortice brevemente il tubo per disperdere gli aggregati della perla. Sviluppa 60 perline in µ l diluito sul pulito Φ 25 mm No.1.5 vetrino coprioggetti (Vedi sezione 2.1) utilizzando un puntale. Asciugare il vetrino coprioggetto in un essiccatore collegato ad una pompa di vuoto nel buio e montare il vetrino coprioggetto su una lastra di vetro in mezzo di montaggio 50 µ l (vedere punto 1.5.4.2).

3. acquisizione immagini

Nota: GLIM richiede immagini di alto rapporto segnale-rumore (SNR) per il calcolo del centro di massa di alta precisione. L'immagine può essere acquisita da microscopi convenzionali come il laser scansione confocale, microscopio confocale o grandangolari disco di filatura. Può essere utilizzato un microscopio a largo campo dotato di piano-apocromatico lenti dell'obiettivo e un sensore di immagine di basso rumore, ad esempio un charge coupled device (CCD) e scientifiche complementari metal-oxide semiconductor (sCMOS). Parametri per il sensore di immagine vengono regolati per garantire una bassa lettura-rumore e alta gamma dinamica. Il microscopio deve essere equipaggiato con la configurazione ottimale dei filtri di fluorescenza verde, mCherry e da' fluoroforo, e deve avere fluorescenza trascurabile diafonia. Idealmente, il sistema di imaging raggiunge una frequenza di campionamento di Nyquist in x, asse y e z, che in genere richiede il x, dimensione y e z di un voxel per essere inferiore a 100, 100 e 200 nm, rispettivamente. X e y dimensioni dei voxel sono sempre uguali e sono indicati come pixel_size. Il pixel_size può essere calcolato dividendo la dimensione del sensore della fotocamera per l'ingrandimento del sistema.

1. Perle di multi-colore immagine
   1. Perline di multi-colore immagine in verde, rossi e da' canali all'inizio e alla fine di ogni sessione di imaging.
      Nota: Qui, le immagini sono state acquisite attraverso un microscopio a epifluorescenza grandangolari convenzionali (invertito) equipaggiato con 100 X NA 1.4 obiettivo piano-apocromatico, tavolino motorizzato, sorgente di luce ad alogenuri metallici da 200 Watt e 16-bit sCMOS fotocamera. Le lunghezze d'onda per filtro di eccitazione (passa banda), specchio dicroico (passaggio lungo) e filtro di emissione (passa banda) del cubo filtro canale verde sono 465-495, 505 e 515-555 nm; quelli per il cubo di filtro di canale rosso sono 528-553, 565 e 578-633 nm; e quelli per il cubo di filtro di canale da' sono 590-650, 660 e 663-738 nm. Durante l'acquisizione, la dimensione di un voxel lungo la x, asse y e z è 64, 64 e 200 nm, rispettivamente.
   2. Trovare un campo di vista con densità di cordone di buona.
   3. Acquisire la serie di immagini 3D in verde, rossi e da' canali (canale_G, canale_R, canale_B, rispettivamente). Prendere 3 sezioni sopra e sotto il miglior piano focale (7 sezioni per pila). Salvare le tre pile come tre file TIFF.
      Nota: Il tempo di esposizione per ogni canale è determinato empiricamente per massimizzare la gamma dinamica, evitare saturazione pixel e minimizzare photobleaching. Altri parametri, quali filtri e x, y e z la dimensione del voxel, vengono scelti come discusso in precedenza.
2. Golgi mini-serie di immagini
   1. Uso TPST1-EGFP e GalT-mCherry transfettate e fluorescente etichettati diapositive (punto 1.5) per trovare le celle che express TPST1-EGFP e un livello basso o medio di GalT-mCherry. Acquisire, serie di immagini 3D come descritto al punto 3.1.3.

4. image Analysis

1. Acquisire centri di perline fluorescenti
   1. In ImageJ, aprire un set di immagini della perla che consiste di tre file TIFF (File > immagine > aprire).
   2. Media 3 sezioni consecutive intorno alla sezione meglio focalizzata nel canale_R di immagine > Pile > Z Project. Immettere il numero di sezione di "Fetta di inizio" e "Stop" e tra le opzioni di "tipo di proiezione", selezionare "Media intensità".
   3. Disegnare le aree di interesse (ROI) che non contengono perline nell'immagine utilizzando il "Poligono selezioni". In "Analyze > Set di misurazioni", verifica solo "Valore di grigio medio" e "Deviazione Standard". Quindi eseguire "Analyze > misura" per ottenere la media e la SD del ROI.
   4. Calcolare l'intensità di sfondo come "media + 6 × SD"_. Sottrarre l'immagine con i corrispondenti valori di intensità di sfondo da "processo > Matematica > Subtract", il valore di intensità di sfondo corrisponde a questo canale.
   5. Ripetere i passaggi 4.1.2 per 4.1.4 per canale_G e serie di immagini del canale_B utilizzando l'inizio stesso e interrompere la fetta e lo stesso sfondo ROI. Si noti che il ROI utilizzato nel passaggio 4.1.3 possono essere copiati su canale_G e canale_B immagini_.
   6. Unire le tre immagini di sfondo-sottratto (immagine > colore > Merge canali) selezionando il canale_R come rosso, canale_G come verde e canale_B come blu. Si otterranno una singola immagine composita che consiste di tre canali.
   7. Avviare Gestione ROI (Analyze > Strumenti > ROI Manager). Disegnare un quadrato ROI intorno a singole perle assicurando che ci sia solo una sferetta all'interno di ogni ROI. Aggiungere il ROI ROI manager premendo "t" sulla tastiera. Ripetere questo processo e aggiungere ROIs come molti come possibile.
   8. In "Analyze > Set di misurazioni", verifica solo "centro di massa".
   9. Selezionare il canale_R, ROI gestione, fare clic su "Misura" per ottenere centri; due colonne corrispondenti a x e y coordinate dei centri di ROIs verrà visualizzata nella finestra "Risultato". Copiare e incollare le due colonne in un foglio di calcolo.
   10. Ripetere il passaggio 4.1.9 per canale_G e_B.
   11. Organizzare le coordinate dei centri in un singolo foglio di calcolo nel seguente ordine: x,_R, y,_R, x_G, y_G, x_Be y_B. Salvare il foglio di calcolo in formato "CSV" come "beads.csv". Non lasciare spazio nel nome del file.
2. Selezionare e misurare Golgi mini-stack
   1. Installare due macro (allegate in Materiali supplementari) in ImageJ, "Macro-Golgi ROI ispezione" e "Dati di 3 canali di uscita Macro" dai plugin > installare ". Chiara ROI manager e la finestra dei risultati.
   2. Aprire un set di immagini di mini-stack di Golgi che consiste di tre file TIFF (File > immagine > Open).
   3. Ripetere i passaggi 4.1.2 - 4.1.5 e salvare le immagini di sfondo-sottratto tre per un uso successivo. Record di background SDs per canale_R, canale_G e_B come SD_R, SD_G e SD_B, rispettivamente, per un uso successivo.
   4. Duplicare le immagini di sfondo-sottratto tre generate dal punto 4.2.3 (Ctrl + Maiusc + D).
   5. Nel "processo > immagine calcolatrice", in primo luogo aggiungere sfondo-sottratto canale_G per immagini canale_R . Aggiungere l'immagine risultante per l'immagine di sfondo-sottratto canale_B . L'immagine risultante, in "immagine > regolazione > soglia", selezionare "imposta" per inserire "1" come "Livello minimo di soglia". Dopo aver premuto "Applica", un'immagine binaria bianca e nero è il risultato.
   6. In "Analyze > analizzare particelle", la gamma di dimensioni per ingresso "dimensioni (pixel ^ 2)". Ingresso "50-infinito". Verifica "Esclude sui bordi" e "Aggiungi a Manager". ROIs contenenti mini-stack di Golgi sono ora aggiunti al gestore di ROI.
      Nota: L'intervallo di grandezza deve essere determinata empiricamente per escludere i rumori che sono generalmente di piccole dimensioni.
   7. Unire le tre immagini di sfondo-sottratto (immagine > colore > Merge canali) dal punto 4.2.3 selezionando il canale_R come rosso, canale_G come verde e canale_B come blu. Viene generata una sola immagine composita che consiste di tre canali.
   8. Eseguire la macro "Ispezione di Macro-Golgi ROI" selezionando "plugin > ispezione Macro-Golgi ROI". Nella finestra di dialogo interattiva, ispezionare visivamente ogni ROI per mantenere o rifiutarla. Selezionare ROIs che contengono un singolo oggetto in tutti i tre canali.
      Nota: Dopo aver eseguito questo strumento, ROIs rifiutati vengono eliminati dal manager ROI.
   9. Verifica solo "Area", "Valore di grigio medio" e "Centro di massa" in "Analyze > misure Set". Acquisire dati avviando lo strumento di macro "Dati di 3 canali di uscita Macro" (plugin > Macro-uscita 3 canali dati).
      Nota: Aree, intensità media e centri (x e y) di ROIs nel canale_R, canale_G e_B vengono visualizzati nella finestra "Risultato".
   10. Copia x e y le coordinate dei centri in un foglio di calcolo e disporli nell'ordine seguente: x,_R, y,_R, x_G, y_G, x_Be y_B. Salvare il foglio di calcolo come file ". csv" (ministacks. csv). Non lasciare spazio nel nome del file. Procedere alla correzione cromatica-shift dei centri (vedere paragrafo 4.3) e calcolo LQ (vedere paragrafo 4.4).
3. Correzione cromatica-spostamento dei centri
   1. Installare Matlab Compiler Runtime (MCR).
   2. Installare i seguenti file in una cartella di lavoro dedicato: my_train.exe e my_test.exe. Copia e incolla "beads.csv" e"ministacks. csv" file nella stessa cartella.
   3. Avviare "Command Prompt" di Windows e andare nella cartella di lavoro digitando il seguente comando " cd path_of_working_folder".
   4. Generare un file di calibrazione cromatica-shift utilizzando centri di perline. Digitare il seguente comando "my_train.exe bordaCSV calibrazione. Mat 1". Nella cartella di lavoro viene creato un file denominato"calibrazione. mat". Ignorare altri file generati.
   5. Correggere lo spostamento cromatico dei centri del Golgi mini-stack digitando il seguente comando "my_test.exe ministacksCSV corrected_ministacksCSV calibrazione. Mat 1".
      Nota: Viene creato un file denominato"corrected_ministacks. csv" nella cartella di lavoro. Esso contiene cromatico-shift coordinate corrette dei centri, che sono disposti nell'ordine di x_G, y_G, x y_Be_B . Ignorare altri file che vengono creati. Si tenga presente che il canale rosso è definito come privo di aberrazione cromatica e di conseguenza x_R e y_R sono gli stessi come dati non elaborati.
4. Calcolo di LQs
   1. Lanciare il software di analisi dati e copia e incolla, nel sotto sequenza, significa che i valori di grigio, aree, sfondo SDs ottenuti dal punto 4.2.3 (metterli in corrispondenza della riga 1) e cromatico-shift corretto x e y coordinate di Golgi mini-stack nel canale_R in un foglio di lavoro come colonne da A E. Allo stesso modo, trasferire dati corrispondenti per canale_G e_B a colonne da F a J e K per O, rispettivamente.
   2. Aggiungere otto nuove colonne P a W, denominato "integrato intensità del canale R", "integrato intensità del canale G", "integrato intensità del canale B", d1 e dx, ABS(tan a), ABS (tan b) e LQ.
      1. Parte superiore della rispettiva colonna fare clic destro e selezionare "Impostare i valori di colonna" per calcolare i valori di ogni colonna. Per colonna P, ingresso "Col(A)Col(B)"; per la colonna Q, inserire "Col(F)Col(G)"; per la colonna R, inserire "Col(K)Col(L)"; per colonna S, ingresso "pixel_size*Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))" dove "pixel_size" è la dimensione del pixel in nm; per colonna T, l'input "pixel_size*((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2)/(2Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O)))"; per colonna U, ingresso "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2) / (2 Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) "; per colonna V, ingresso "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2) / (2 Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) "; per colonna W, ingresso "Col (T) / Col (S)".
   3. Filtra gli mini-stack di Golgi per i tre criteri descritti nell' Introduzione.
      1. Nel software di analisi dati, andare al "foglio di lavoro > Query di foglio di lavoro" e selezionare le variabili di colonna per test di "Se". Assegnare i seguenti alias I1, I2, I3, d1, A e B per colonne "integrato intensità del canale R", "integrato intensità del canale G", "integrato intensità del canale B", d1, ABS(tan a) e ABS (tan b), rispettivamente. Nel "Se condizione" casella di input "I1 > =30*cell(1,3) e I2 > =30*cell(1,8) e I3 > =30*cell(1,13) AND d1 > = 70 AND (A < = 0,3 o B < = 0,3)".
      2. Selezionare "Estrarre di nuovo foglio di lavoro", fare clic su "Applica". Colonne A-W di analyzable Golgi mini-stack vengono estratti in un nuovo foglio di lavoro.
   4. Nel nuovo foglio di lavoro, fare clic destro all'inizio della colonna W, selezionare "statistiche sulla colonna > finestra di dialogo aprire". Controllo "N totale", "Media", "SE di media", "Istogrammi". L'analisi statistica di LQs viene quindi visualizzato.

Risultati

Al microscopio ottico del grado ricerca moderna dotato di un obiettivo apocromatico piano, come quello utilizzato nel nostro laboratorio, Mostra minima aberrazione cromatica (Figura 2A). Tuttavia, un esame attento dell'immagine multicolore perlina fluorescente può rivelare lo spostamento di immagini a colori differenti del tallone stesso (Figura 2B). Definiamo che il canale rosso è libero di ab...

Discussione

In precedenza, la localizzazione di una proteina di Golgi sotto microscopia chiara pricipalmente è stata quantificata dal grado di correlazione o la sovrapposizione dell'immagine della proteina con l'immagine di un marcatore di Golgi di localizzazione noto^{15,16, 17}. La correlazione risultante o sovrapposti coefficiente riflette quanto vicino la proteina test è il marker di Golgi spazialmente. Ci sono almeno tre avvertimenti p...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads	Invitrogen	T7279	As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope
Glass coverslip Φ 12 mm (No. 1.5)	Menzel	CB00120RAC
Glass coverslip Φ 25 mm (No. 1.5)	Menzel
DMEM	Capricon	DMEM-HPA-P50
Trypsin-EDTA
FBS	GE Hyclone	SV30160.03
Nocodazole	Merck	487928
transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
transfection medium. Commercial name: OptiMEM	Invitrogen	31985070
TPST1-EGFP	Addgene	66617	A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom)
GalT-mCherry			Made in our lab
paraformaldehyde	Merck	1.04005.1000
saponin	Sigma-Aldrich	47036
poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488	CALBIOCHEM	475904
BSA	Sigma-Aldrich	A9647
Mouse anti-GM130	BD Biosciences	610823	Primary antibody for human GM130
far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG	Invitrogen	A-21235	Far red fluorescence conjugated secondary antibody