Localisation quantitative d’une protéine de Golgi Imaging sa masse Centre de Fluorescence

Résumé

La localisation précise des résidents de l’appareil de Golgi est essentielle pour comprendre les fonctions cellulaires de l’appareil de Golgi. Toutefois, la microscopie optique conventionnelle est incapable de résoudre la structure sub-Golgi. Nous décrivons ici le protocole pour une méthode de Super-résolution microscopie conventionnelle basée déterminer quantitativement la localisation sup-Golgi d’une protéine.

Résumé

L’appareil de Golgi est constitué de saccules membranaires empilées en série qui peuvent être également classés en régions sub-Golgi, y compris le cis-Golgi, medial-Golgi, trans-Golgi et trans-réseau de l’appareil de Golgi. Les fonctions cellulaires de l’appareil de Golgi sont déterminées par la répartition de ses protéines résidentes. La résolution spatiale de microscopie optique conventionnelle est trop faible pour résoudre la structure sub-Golgi ou saccules. Ainsi, la microscopie immuno-or est une méthode de choix pour localiser une protéine au niveau sub-Golgi. Cependant, la technique et l’instrument sont au-delà de la capacité de la plupart des laboratoires de biologie cellulaire. Nous décrivons ici notre méthode développée récemment Super-résolution appelée localisation des protéines Golgi par imagerie centres de masse (GLIM) systématiquement et quantitativement localiser une protéine de Golgi. GLIM est basé sur les protocoles d’étiquetage de fluorescence standard et grand champ conventionnel ou microscopes confocaux. Il s’agit de l’étalonnage de l’aberration chromatique-Maj du système microscopique, l’acquisition de l’image et l’analyse postérieure à l’acquisition. La localisation de sub-Golgi d’une protéine test est exprimée quantitativement comme le quotient de localisation. Il existe quatre principaux avantages de GLIM ; C’est rapide, basé sur les outils et les méthodes conventionnelles, le résultat de la localisation est quantitatif, et qu’elle leur offre ~ résolution pratique de 30 nm suivant l’axe de l’appareil de Golgi. Nous décrivons ici le protocole détaillé de GLIM pour localiser un test de la protéine de l’appareil de Golgi.

Introduction

Le complexe de Golgi joue un rôle essentiel dans sécrétoire/endocytose traite des protéines et des lipides (ci-après les cargaisons) dans les cellules de mammifères,^1,2,3. À l’appareil de Golgi, cargaisons sont non seulement triées dans divers compartiments subcellulaires mais aussi modifiés par divers types de glycosylation. Le complexe de Golgi mammifères se compose de nombreuses cheminées de Golgi latéralement connectées, qui se compose généralement de 4-11 sacs de membrane étroitement adjacentes et plat appelés saccules. Les saccules de Golgi empilées en série sont classés plus loin, d’un bout à l’autre, tout comme médiale, ciset trans-cisternes. À la trans-côté d’une pile de Golgi, le trans-plupart sac de membrane se développe en un réseau de membrane tubulaire et le réticulum, appelé le trans-Golgi network (TGN)⁴. Dans la voie de sécrétion, cargaisons provenant de réticulum endoplasmique (re) entrer dans une cheminée de Golgi à la cis-côté et puis séquentiellement traversent médiale et trans-cisternes. Cargaisons finit par sortir l’appareil de Golgi à la trans-Golgi ou TGN destinant à la membrane plasmique, les endosomes ou les granules de sécrétion.

Les mécanismes moléculaires et cellulaires du comment des cargaisons de transit une pile de l’appareil de Golgi et comment l’appareil de Golgi maintient son organisation saccules restent mystérieux et sont actuellement encore un débat houleux¹. Une des difficultés dans ce domaine est que les saccules de Golgi ne peuvent être résolus en vertu de la microscopie électronique (EM) depuis la résolution du microscope optique (~ 200 nm) est insuffisante pour résoudre différents saccules de Golgi (< 100 nm dans les deux épaisseur de saccules et la distance). Donc, la localisation de sub-Golgi des protéines résidentes et transit des cargaisons sont classiquement déterminés par l’EM immuno-or. Toutefois, l’EM immuno-or est très pointues et il est au-delà des capacités de la plupart des laboratoires de biologie cellulaire. Bien que la résolution de l’EM peut être Sub nanomètre, la résolution offerte par le EM immuno-or est considérablement entravée par la taille de l’anticorps complexe (principales et l’anticorps secondaire) et les particules d’or, et il peut être pire que 20 nm. En outre, des images de EM sont obtenus à partir 2D minces au lieu d’une 3D vision globale de l’appareil de Golgi, ce qui peut aboutir à des conclusions erronées selon la position relative et l’orientation de la section 2D⁵. Par exemple, étudier une EM single-section ne peut pas fiable différencier une vésicule de la vue orthogonale d’un tubule puisque les deux peuvent afficher des profils identiques membrane rond. L’avènement récent des techniques de microscopie de Super-résolution, telles que la microscopie éclairage structuré 3D (3D-SIM), stimulée par épuisement des émissions (STED), microscopie de localisation de photoactivation (PALM) et (microscopie) reconstruction optique stochastique STORM), permet de résoudre les structures sub-Golgi sous lumière microscopes⁶. Cependant, il y a au moins quatre inconvénients qui peuvent considérablement limiter leurs utilisations dans l’étude biologique de la cellule de l’appareil de Golgi. 1) les techniques actuelles de Super-résolution nécessitent une configuration matériel coûteux et spécial qui dépasse la plupart des laboratoires de biologie cellulaire. 2) protocoles d’étiquetage de fluorescence spéciaux sont nécessaires pour certaines techniques de Super-résolution. 3) bien que, dans les meilleures conditions, ces techniques de réclamer 20-110 nm à résolution spatiale, la résolution pratique obtenue dans des échantillons réels peut être bien pire. 4) par rapport à la microscopie conventionnelle, ces techniques de Super-résolution encore ont des difficultés dans la conduite de multicolores, 3D ou vivent d’imagerie cellulaire, seules ou en combinaison. Probablement plus important encore, fois EM immuno-or et les techniques de microscopie de Super-résolution rendement qualitatif plutôt que des données quantitatives de localisation.

Tenter de résoudre partiellement les problèmes mentionnés ci-dessus, nous avons récemment développé une méthode de microscopie conventionnelle basée, qui se nomme la localisation des protéines Golgi Imaging centres de masse (GLIM), systématiquement et quantitativement localiser un appareil de Golgi protéine à une résolution équivalente à celle de l’immuno-or EM⁷. Dans cette méthode, l’appareil de Golgi dans des cellules de mammifères est dispersée comme mini-piles de l’appareil de Golgi par le traitement de la nocodazole, un médicament dépolymérisation des microtubules. Des études approfondies ont démontré qu’induite par la nocodazole Golgi mini-piles (ci-après Golgi mini-cheminées) sont très proches de natives stacks de Golgi dans les organisations et les fonctions cellulaires^{8,9,10, 11}. Le quotient de la localisation (LQ) d’une protéine de test peut être acquises par le biais de GLIM et il dénote la localisation sup-Golgi quantitative. Les valeurs numériques de LQs peuvent être comparés et une base de données LQ de plus de 25 marqueurs de Golgi est disponible.

GLIM, mini-piles de l’appareil de Golgi sont marqués au triple GM130 endogène ou exogène exprimée, GalT-mCherry et la protéine test (x). GM130 et GalT-mCherry, cis- et trans-Golgi marqueurs respectivement^12,13, constituent des points de référence. La fluorescence triple, rouge (R), vert (G) et (B) rouge sombre, artificiellement apparaissent en rouge, vert et bleu, respectivement. Centre de masse de fluorescence (ci-après le centre) est adoptée pour régler les sous-pixels. L’axe de l’appareil de Golgi est défini comme le vecteur de la centre de GM130 à celui de GalT-mCherry. La mini-pile Golgi est modélisée comme une structure cylindrique avec une symétrie rotationnelle infinie autour de l’axe de l’appareil de Golgi. Par conséquent, une mini-pile de Golgi peut être modélisée de davantage comme une structure unidimensionnelle selon l’axe de l’appareil de Golgi. Le LQ de la protéine test d_x/d₁, dans lequel d_x est la distance entre le centre de x à celle de GM130, tandis que d₁ correspond à la distance depuis le centre de GalT-mCherry à celle de GM130 correspond à x. Si le centre de x est hors-axe, sa distance axiale de projection est utilisé pour le calcul. Schématiquement, les variables, y compris de Golgi axe, angle axial, d_x, d₁, angle α et β de l’angle, pour GLIM sont illustrées à la Figure 1. LQ est indépendante de l’angle axial de Golgi mais mini-piles de l’appareil de Golgi orientent aléatoirement dans une cellule.

Mini-piles de l’appareil de Golgi apparaissent non homogènes dans les images. Nous avons développé trois critères pour sélectionner analysables Golgi mini-piles pour GLIM. 1) le critère de rapport signal-sur-bruit, dans lequel le rapport de l’intensité totale d’une pile mini de Golgi à la déviation standard (SD) de l’arrière-plan est ≥ 30 dans chaque canal. Ce critère est d’assurer la précision de positionnement du centre de masse, qui repose sur les rapports signal-bruit de mini-piles de l’appareil de Golgi. 2) le critère angle ou la distance axial, qui exige d₁≥ 70 nm. d₁ diminue avec l’augmentation de l’angle axial de l’appareil de Golgi. Quand l’angle axial est proche de 90° ou verticale, la minipile devient non-être résolu comme d₁ est proche de 0. d₁≥ 70 nm peut effectivement exclure près verticale mini piles d’appareil de Golgi. 3) le critère de colinéarité, dans laquelle soit | tan α | ou | tan β | est ≤ 0,3. Ce critère s’assure que les trois centres d’une mini pile sont suffisamment colinéaire pour notre modèle unidimensionnel de la pile mini de l’appareil de Golgi. Tous les microscopes de lumière souffrent de l’aberration chromatique qui peut gravement altérer la position relative des centres de fluorescence rouge, vert et rouge sombre. L’aberration chromatique de systèmes de microscope est calibrée expérimentalement par imagerie 110 perles nm, qui sont marqués par fluorescence rouge, vert et rouge sombre au triple. Pour chaque image de la perle, le Centre rouge est défini comme la véritable position du talon et chromatique-déplacements des centres de verts et de rouge sombre sont équipés de fonctions polynômes de premier ordre. Centres de Golgi mini-cheminées subissent les fonctions polynomiales pour corriger les décalages-chromatique dans les canaux vert et rouge sombre.

Par le biais de GLIM, nous pouvons atteindre une résolution de ~ 30 nm suivant l’axe de l’appareil de Golgi dans des conditions normales. Ce qui est important, il fournit une méthode systématique pour cartographier quantitativement toute protéine de Golgi. GLIM peut être effectuée par des microscopes classiques, tels que grand champ ou microscopes confocaux, utilisant des protocoles communs étiquetage fluorescence. L’imagerie et traitement des données peuvent prendre aussi courts qu’une heure. Par le biais de GLIM, nous avons démontré directement la transition progressive de la cargaison sécrétrice de la cis- TRANS-latérale de l' appareil de Golgi⁷.

Protocole

Remarque : Voici un protocole étape par étape de GLIM pour déterminer la sulfotransférase LQ de EGFP-le tag tyrosylprotéine 1 (TPST1), une enzyme résidente de Golgi, dans les cellules HeLa.

1. préparation des Mini-piles de Golgi marqués par Fluorescence

1. Préparer des lamelles de verre
   1. Aliquote 0,3 mL stérile Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) à un puits d’une plaque 24 puits dans une hotte de culture de tissus.
   2. Effacer un morceau de Φ 12 mm No.1.5 verre couvre-objet à l’aide de papier de soie doux tamponné avec l’éthanol à 70 % pour enlever les débris à la surface de la lamelle de verre. Utilisez une paire de pinces à épiler pointu pour brièvement tremper le couvre-objet dans l’éthanol à 70 %, transférez-le dans la plaque 24 puits et couler au fond de la DMEM contenant bien stérile.
      NOTE : Lamelles de verre sont classiquement stérilisés par flambage. Cependant, lamelles couvre-objet en vertu de tel traitement fissure facilement au cours de la manipulation par la suite. 70 % éthanol trempage est efficace pour la stérilisation des lamelles de verre sans les abîmer.
   3. Avec le couvercle couvert, laisser la plaque 24 puits dans les 37 ° C CO₂ incubateur jusqu'à utilisation.
2. Cellules de semences
   1. La culture HeLa cellules (ci-après) dans une fiole de T-25 en DMEM supplémenté de 10 % fœtale Bovine sérique (FBS) (milieu ci-après complet) dans un incubateur à 37 ° C CO₂ fourni avec 5 % de CO₂. Les antibiotiques ne sont pas nécessaires ici.
   2. Quand les cellules atteignent ~ 80 % confluence, aspirer le milieu de culture. Ajouter 1 mL de 0,25 % trypsine-EDTA dans le ballon et incuber les cellules dans un incubateur à 37 ° C CO₂ pour 2 min. Ajouter 1 mL de milieu complet dans le ballon et rincer doucement les cellules sur le mur de la fiole de pipetage.
   3. Transfert des cellules individuelles à un tube de centrifugation stérile et un essorage à 500 g pendant 2 min granuler les cellules. Aspirer le surnageant et le culot de suspendre dans 1 mL de milieu complet.
   4. Aspirez le milieu dans le puits de la plaque 24 puits contenant la lamelle de verre stérilisé et semences ~ 1 x 10⁵ cellules dans le puits. Recharger le volume du puits avec un milieu complet de 0,5 mL. Incuber dans une étuve à 37 ° C CO₂ livrée avec 5 % de CO₂. La culture de cellules à ~ 80 % confluence.
3. Transfecter de cellules
   Remarque : Les cellules bien étalées sont avantageux pour imagerie dispersée Golgi mini-piles.
   1. Transfecter ~ confluentes à 80 % avec 80 ng GalT-mCherry⁷ et 320 ng TPST1-EGFP plasmides d’ADN (voir Table des matières) à l’aide d’un réactif de transfection selon le protocole prévu par le fabricant. Incuber dans un incubateur à 37 ° C CO₂ . Changer le support après 4-6 h d’incubation. Les cellules sont prêts ~ 12 h plus tard.
4. Traitement de la nocodazole pour générer des mini-piles de l’appareil de Golgi
   1. Préparer une solution nocodazole (33 mM) en dissolvant la poudre nocodazole 10 mg dans 1 mL le sulfoxyde diméthylique. Partie aliquote de la solution mère et conserver à-20 ° C pour le stockage à long terme.
   2. Diluer 1 µL de solution mère de la nocodazole (33 mM) dans 1 mL de milieu complet de 37 ° C (concentration finale 33 µM). Centrifuger à vitesse de pointe pour enlever les particules fines.
   3. Aspirer le milieu dans le puits et ajouter 0,5 mL de 33 µM nocodazole contenant du milieu complet. Incuber les cellules dans un incubateur à 37 ° C CO₂ pendant 3 h procéder à immunofluorescence labeling (section 1.5).
5. Immunofluorescence labeling
   Remarque : Conservez les cellules dans le noir pour éviter le photoblanchiment de GalT-mCherry et TPST1-EGFP.
   1. Préparer des réactifs pour immunofluorescence labeling
      1. Pour préparer la solution à 4 % paraformaldéhyde, dissoudre la poudre de 4 % (p/v) paraformaldéhyde à chaud 1 X en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et filtrer la solution sur un filtre de 0,45 µm. La solution peut être conservée à-20 ° C.
         ATTENTION : Paraformaldéhyde est toxique et cancérogène et peut causer des irritations de la peau. Porter l’équipement de protection individuelle (EPI) approprié.
      2. Pour préparer le tampon de dilution de fluorescence (FDB), mélanger 5 % (v/v) de SVF et 2 % (p/v) sérum d’albumine bovine (BSA) dans du PBS 1 x. Filtrer la solution sur un filtre de 0,45 µm et conserver la solution à-20 ° C.
      3. Dissoudre 5,35 g NH₄Cl poudre dans 1 L d’eau pour préparer 100 mM NH₄Cl et stocker la solution à température ambiante.
      4. Dissoudre la poudre de saponine de 10 % (p/v) dans l’eau jusqu'à 10 % de saponine, aliquote de préparer et stocker la solution à-20 ° C.
   2. Fixation
      1. Rincer une fois bien avec 0,5 mL 1 x solution de PBS et ajouter 0,5 mL de solution de paraformaldéhyde à 4 %. Incuber pendant 20 min à température ambiante. Rincez le puits deux fois avec du PBS 1 x 0,5 mL et deux fois avec 0,5 mL 100 mM NH₄CL. Rincer le puits deux fois avec du PBS 1 x 0,5 mL. Les cellules peuvent être conservés dans du PBS 1 x à 4 ° C durant la nuit dans l’obscurité.
   3. Marquage par fluorescence
      1. Diluer 1 µL souris anti-GM130 Anticorps primaire en saponine de 500 µL FDB contenant 0,1 %. Inverser le couvercle de la plaque 24 puits et appliquer 10 µL d’anticorps primaire mélange sur le couvercle.
      2. Utiliser une paire de pinces à épiler pointu pour extraire et transférer la lamelle de verre sur la baisse des anticorps mélange assurant que le côté de la cellule est en contact avec le mélange. Incuber les cellules avec le mélange de l’anticorps primaire pendant 1 h à température ambiante.
         Remarque : Le couvercle avec le couvre-objet peut être placé dans un sac plastique humidifié dans l’obscurité.
      3. Utilisez une paire de pinces à épiler pointu pour extraire et transférer la lamelle vers le puits avec le côté de la cellule vers le haut et le rincer dans du PBS 1 x 0,5 mL trois fois par ≥ 30 min. Shaking est inutile.
      4. Diluer 1 µL fluorophore rouge sombre conjugués chèvre anti-souris IgG (anticorps secondaire) en saponine de 500 µL FDB contenant 0,1 %.
      5. Lavez et nettoyez la surface arrière du couvercle de la plaque 24 puits. Appliquer 10 µL anticorps secondaire rouge sombre mélange sur le couvercle. Répétez les étapes 1.5.3.2 - 1.5.3.3.
   4. Montage
      1. Préparer le milieu de montage en mélangeant 1 g de glycérol, 2,2 g poly(vinyl alcohol) (MW ~ 31 000 Da), 1,2 mL 1 M Tris (pH 8) et 8,8 mL H₂O. dissoudre le mélange dans un bain d’eau de 60 ° C avec parfois mélangé au vortex. Conserver la solution à-20 ° C.
      2. Décongeler le milieu de montage et transférer 10 µL sur une lame de verre. Superposition de la lamelle couvre-objet (côté cellule vers le bas) sur la goutte de milieu de montage. Incuber la lame de verre à 37 ° C pendant 30 min ou à température ambiante pendant 1 h durcir le milieu de montage. Sceller la lamelle avec vernis incolore et stocker la lame de verre à-20 ° C.

2. préparation des perles fluorescentes pour la Correction chromatique-Maj

1. Lamelle couvre-objet de nettoyage
   1. Placer soigneusement un morceau de 25 mm No.1.5 lamelle de verre sur un support en plastique.
   2. Transfert le panier avec la lamelle dans un bécher de 400 mL remplie avec 300 mL de 1 NaOH M et soniquer dans un sonicateur de bain (35 Watts) pendant 15 minutes brièvement, rincez le panier dans un bécher de 400 mL rempli de 300 mL d’eau désionisée. Transférer la crémaillère dans un bécher de 400 mL rempli avec 300 mL d’éthanol à 99 % et laisser agir dans le sonicateur bain pendant 15 min. brièvement rincer la crémaillère dans un bécher de 400 mL rempli de 300 mL d’eau désionisée.
   3. Répétez l’étape 2.1.2 deux fois plus.
   4. Rincez le panier avec la lamelle dans 300 mL d’eau désionisée dans un bécher de 400 mL pour 10 min. répéter l’étape deux fois plus. Transférer la grille dans un four à 60 ° C et sécher la lamelle pour 1 h. magasin la lamelle séchée dans une boîte de Pétri et sans poussière.
2. Immobilisation des perles fluorescentes sur la lamelle de verre
   1. Diluer 110 nm multicolore fluorescent perles 80-fold en 1 x PBS contenant 0,1 µg/µL BSA. Brièvement vortex le tube pour disperser les agrégats de la perle. Propagation de 60 perles µL dilué sur la lamelle de verre No.1.5 Φ nettoyé 25 mm (voir la section 2.1) à l’aide d’un embout de la pipette. Sécher la lamelle dans un dessicateur relié à une pompe à vide dans l’obscurité et monter la lamelle sur une lame de verre dans 50 µL de milieu de montage (voir étape 1.5.4.2).

3. image Acquisition

Remarque : GLIM nécessite des images de haut ratio signal-bruit (SNR) pour calcul de centre de masse de haute précision. L’image peut être acquis par des microscopes classiques tels que le laser à balayage confocal, tourne disque confocale ou grand-angulaire de microscope. Un microscope à champ large équipé de lentilles de l’objectif apochromatique-plan et d’un capteur d’image à faible bruit, comme un dispositif à couplage de charge (CCD) et les scientifique complémentaire métal-oxyde-semiconducteur (sCMOS) peut être utilisé. Paramètres pour le capteur d’image sont ajustées afin d’assurer une faible gamme dynamique lire-bruit et haute. Le microscope doit être équipé de la configuration optimale des filtres de fluorescence verte, mCherry et fluorophore rouge sombre, et il doit avoir interférence négligeable de fluorescence. Idéalement, le système d’imagerie permet d’obtenir une fréquence d’échantillonnage de Nyquist dans le x, axe y et z, ce qui nécessite généralement le x, y et z de taille d’un voxel pour être inférieur à 100, 100 et 200 nm, respectivement. X et y taille du voxel sont toujours égal et sont appelés pixel_size. Le pixel_size peut être calculée en divisant la taille du capteur caméra par le grossissement de système.

1. Perles multicolores image
   1. Image multicolores perles dans les canaux rouges, verts et rouge sombre au début et à la fin de chaque séance d’imagerie.
      NOTE : Ici, les images ont été acquises au microscope conventionnel épifluorescente grand-angulaire (inversé) équipé 100 X NA 1.4 objectif plan-apochromatique, platine motorisée, source lumineuse de 200 watts métal halide et caméra 16 bits sCMOS. Les longueurs d’onde pour filtre d’excitation (passe-bande), miroir dichroïque (longue passe) et filtre d’émission (passe-bande) du cube canal vert filtre sont 465-495, 505 et 515-555 nm ; Voilà pour le cube du filtre rouge canal 528-553, 565 et 578-633 nm ; et voilà pour le cube du filtre rouge sombre canal 590-650, 660 et 663-738 nm. Lors de l’acquisition, la taille d’un voxel le long du x, y et z est 64, 64 et 200 nm, respectivement.
   2. Trouver un champ de vision avec une densité de bonne perle.
   3. Acquérir les piles de l’image 3D dans les canaux rouges, verts et rouge sombre (canal_G, canal_R, canal_B, respectivement). Prendre 3 sections au-dessus et en dessous le meilleur plan focal (7 sections par pile). Enregistrez les trois piles sous trois fichiers TIFF.
      NOTE : Le temps d’exposition pour chaque canal est empiriquement déterminé pour maximiser la plage dynamique, d’éviter la saturation des pixels et de minimiser photoblanchiment. Autres paramètres, tels que les filtres et le x, y et z la taille de la voxel, sont choisis comme indiqué plus haut.
2. Image de Golgi mini-piles
   1. Utilisation TPST1-EGFP et GalT-mCherry transfectées et fluorescent étiqueté diapositives (section 1.5) pour rechercher les cellules que TPST1-EGFP express et un niveau faible ou moyen de GalT-mCherry. Acquérir des piles d’image 3D comme indiqué au point 3.1.3.

4. image Analysis

1. Acquérir des centres de perles fluorescentes
   1. Dans ImageJ, ouvrez un jeu d’images de perle consistant en trois fichiers TIFF (fichier > Image > Ouvrir).
   2. Moyenne 3 sections consécutives autour de la section la mieux ciblée en canal_R par Image > cheminées > projet de Z. Entrer le numéro de section de « Tranche de début » et « Arrêt de tranche » et parmi les options de « type de projection », sélectionnez « Moyenne intensité ».
   3. Dessiner des zones d’intérêt (ROIs) qui ne contiennent aucun des perles dans l’image à l’aide de « Sélections polygone ». Dans « Analyze > mesures Set », cochez seulement « Valeur de gris moyen » et « Déviation Standard ». Puis exécutez « Analyze > mesure » pour obtenir la moyenne et l’écart-type de la ROI.
   4. Calculer l’intensité du fond comme « moyenne + 6 × SD »_. Soustraire l’image avec les valeurs d’intensité de fond correspondant de « processus > mathématiques > soustraire », la valeur d’intensité de fond correspondant à ce canal d’entrée.
   5. Répétez les étapes 4.1.2 à 4.1.4 pour canal_G et piles d’image canal_B en utilisant le même début et arrêt de tranche et le fond même ROI. Remarquez que le retour sur investissement dans étape 4.1.3 peut être copiée sur canal_G et les images de canal_{B .}
   6. Fusionner les trois images de fond-soustrait (Image > couleur > fusion canaux) en choisissant canal_R comme rouge, canal_G en vert et canal_B en bleu. Vous obtiendrez une image composite unique composé de trois chaînes.
   7. Lancer le gestionnaire de ROI (Analyze > Outils > Gestionnaire de retour sur investissement). Dessiner un ROI carré autour des perles unique assurant qu’il n’y a qu’une seule perle au sein de chaque ROI. Ajouter le ROI au ROI manager en appuyant sur « t » sur le clavier. Répétez cette procédure et ajouter des ROIs autant que possible.
   8. Dans « Analyze > mesures Set », ne vérifier que « centre de masse ».
   9. Sélectionnez canal_R, dans le gestionnaire de ROI, cliquez sur « Mesure » pour obtenir des centres ; deux colonnes correspondant à x et y les coordonnées des centres des ROIs seront affichera dans la fenêtre de « Résultat ». Copiez et collez les deux colonnes dans une feuille de calcul.
   10. Répétez l’étape 4.1.9 pour canaux_G et_B.
   11. Organiser les coordonnées des centres dans une feuille de calcul simple dans l’ordre suivant : x_R, y,_R, x_G, y,_G, x_Bet y_B. Enregistrez la feuille de calcul au format « .csv » sous «beads.csv». Ne laisser aucun espace dans le nom du fichier.
2. Sélectionnez et mesurer des mini-piles de l’appareil de Golgi
   1. Installer deux macros (joint en Matériaux supplémentaires) dans ImageJ, « inspection Macro-Golgi ROI » et « Données de 3 canaux Macro-sortie » par plug-ins > installer ». Gestionnaire de ROI clair et fenêtre de résultats.
   2. Ouvrir un ensemble d’images de minipile de Golgi consistant en trois fichiers TIFF (fichier > Image > Ouvrir).
   3. Répétez les étapes 4.1.2 - 4.1.5 et enregistrer les images de fond-soustrait trois pour une utilisation ultérieure. Enregistrement le fond SDs pour channel_R, channel_G et canal_{B R}de la SD, SD_G et SD_B, respectivement, pour les utiliser ultérieurement.
   4. Dupliquer les trois images de fond-soustrait générés à l’étape 4.2.3 (Ctrl + Maj + D).
   5. Dans « processus > Calculatrice d’Image », ajoutez d’abord le fond-soustrait canal_G aux images du canal_R . Ajoutez l’image résultante à l’image de fond-soustrait canal_B . À l’image qui en résulte, dans « Image > réglage > seuil », sélectionnez « activé » à l’entrée « 1 » comme « Le plus bas seuil ». Après avoir appuyé sur « Appliquer », une noir et blanche image binaire est entraînée.
   6. Dans « Analyze > analyser les particules », entrée de la gamme de taille pour « taille (pixels ^ 2) ». Entrée « 50-infini ». Cochez « Ne comprend pas sur les bords » et « Ajouter à Manager ». ROIs contenant mini-piles de l’appareil de Golgi sont maintenant ajoutés au gestionnaire de ROI.
      NOTE : Le calibre doit être déterminé empiriquement pour exclure les bruits qui sont généralement de petite taille.
   7. Fusionner les trois images de fond-soustrait (Image > couleur > fusion canaux) de l’étape 4.2.3 en sélectionnant le canal_R comme rouge, canal_G en vert et canal_B en bleu. Une seule image composite composé de trois chaînes est générée.
   8. Exécutez la macro « inspection Macro-Golgi ROI » en sélectionnant « Plugins > inspection Macro-Golgi ROI ». Dans la boîte de dialogue interactif, visuellement chaque ROI afin de conserver ou de le rejeter. Sélectionnez les ROIs qui contiennent un seul objet sur les trois canaux.
      Remarque : Après avoir exécuté cet outil, ROIs rejetés sont éliminés par le gestionnaire du ROI.
   9. Cochez seulement « Espace », « Valeur de gris moyen » et « Centre de masse » « Analyze > mesures Set ». Acquisition de données en lançant l’outil macro « Données de 3 canaux de Macro-sortie » (Plugins > Macro-sortie 3 canaux de données).
      Remarque : Centres (x et y) des ROIs au canal_R, channel_G et canal_B , intensités moyennes et les zones sont affichés dans la fenêtre de « Résultat ».
   10. Copie x et y les coordonnées des centres dans un tableur et classez-les dans l’ordre suivant : x_R, y,_R, x_G, y,_G, x_Bet y_B. Enregistrer la feuille de calcul dans un fichier « .csv » (ministacks.csv). Ne laisser aucun espace dans le nom du fichier. Procéder à la correction chromatique-Maj des centres (article 4.3) et calcul de LQ (section 4.4).
3. Correction chromatique-Maj des centres
   1. Installer le Runtime de compilateur Matlab (MCR).
   2. Installer les fichiers suivants dans un dossier de travail dédié : my_train.exe et my_test.exe. Copier et coller «beads.csv» et «ministacks.csv » fichiers dans le même dossier.
   3. Lancez « Command Prompt » de Windows et allez dans le dossier de travail en tapant la commande suivante " cd path_of_working_folder ».
   4. Générer un fichier de calibrage chromatique-Maj à l’aide de centres de perles. Tapez la commande suivante «my_train.exe perles.csv étalonnage.mat 1». Un fichier nommé «étalonnage.mat » est créé dans le dossier de travail. Ignorer les autres fichiers qui sont générés.
   5. Corriger le décalage chromatique vers des centres de Golgi mini-piles en tapant la commande suivante «my_test.exe ministacks.csv corrected_ministacks.csv étalonnage.mat 1».
      Remarque : Un fichier nommé «corrected_ministacks.csv » est créé dans le dossier de travail. Il contient chromatique-Maj coordonnées corrigées des centres, qui sont disposés dans l’ordre de x_G, y,_G, x_B et y_B. Ignorer les autres fichiers qui sont créés. Prenez note que le canal rouge est défini comme libre de l’aberration chromatique et, par conséquent, x_R et y_R sont les mêmes que les données brutes.
4. Calcul de LQs
   1. Lancer le logiciel d’analyse de données et des copier et les coller, dans le sous séquence, signifie valeurs de gris, les zones, fond SDs obtenu à l’étape 4.2.3 (placez-les à la ligne 1) et corrigé chromatique-shift x et y coordonnées de Golgi mini-cheminées en canal_R dans un feuille de calcul comme colonnes A à E. De même, transférer les données correspondantes pour canaux_G et_B à colonnes F à J et K à O, respectivement.
   2. Ajouter huit nouvelles colonnes P à W, nommé « intensité intégrée du canal R », « l’intensité intégrée de canal G », « intensité intégrée du canal B », d1, dx, ABS(tan a), ABS (tan b) et LQ.
      1. Cliquez avec le bouton droit sur la partie supérieure de la colonne respective et sélectionnez « Définir des valeurs de colonne » pour calculer les valeurs de chaque colonne. Pour la colonne P, l’entrée « Col(A)Col(B) » ; pour la colonne Q, l’entrée « Col(F)Col(G) » ; pour colonne de R, l’entrée « Col(K)Col(L) » ; pour la colonne S, l’entrée « pixel_size*Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O)) » où « pixel_size » est la taille du pixel en nm ; pour les colonnes T, entrée « pixel_size*((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2)/(2Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))) » ; pour la colonne U, entrée "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2) / (2 Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) « ; pour la colonne V, entrée "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2) / (2 Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) « ; pour colonne W, entrée « Col (T) / Col (S) ».
   3. Filtrer les Golgi mini-piles par trois critères décrits dans l' Introduction.
      1. Dans le logiciel d’analyse de données, allez dans « feuille de calcul > requête de feuille de calcul » et sélectionnez les variables de la colonne pour test « If ». Assigner les alias suivants I1, I2, I3, d1, A et B pour les colonnes « intensité intégrée du canal R », « intensité intégrée de canal G », « l’intensité intégrée du canal B », d1, ABS(tan a) et ABS (tan b), respectivement. Dans le « si condition » entrée du décodeur, « I1 > =30*cell(1,3) et I2 > =30*cell(1,8) et I3 > =30*cell(1,13) AND d1 > = 70 et (A < = 0,3 ou B < = 0,3) ».
      2. Sélectionnez « Extraire à nouvelle feuille de calcul », cliquez sur « Appliquer ». Les colonnes A à W de Golgi analysables mini-cheminées sont extraits vers une nouvelle feuille de calcul.
   4. Dans la nouvelle feuille de calcul, cliquez sur le bouton droit du haut de la colonne W, sélectionnez « statistiques sur la colonne > dialogue ouvert ». Cocher « Total N », « Moyenne », « SE de la moyenne », « Histogrammes ». L’analyse statistique des LQs s’affiche ensuite.

Résultats

Microscope photonique grade recherche moderne équipé d’une lentille apochromatique de plan, comme celui utilisé dans notre laboratoire, montre l’aberration chromatique minimale (Figure 2A). Toutefois, un examen attentif de l’image multicolore perle fluorescente peut révéler le déplacement des images de couleur différente du même talon (Figure 2B). Nous définissons que le canal roug...

Discussion

Auparavant, la localisation d’une protéine de Golgi sous le microscope photonique a été principalement quantifiée par le degré de corrélation ou la superposition de l’image de la protéine et l’image d’un marqueur de Golgi de localisation connue^{15,16, 17}. La corrélation obtenue ou coefficient de chevauchement reflète comment fermer la protéine test est le marqueur de Golgi dans l’espace. Il y a au moins trois...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads	Invitrogen	T7279	As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope
Glass coverslip Φ 12 mm (No. 1.5)	Menzel	CB00120RAC
Glass coverslip Φ 25 mm (No. 1.5)	Menzel
DMEM	Capricon	DMEM-HPA-P50
Trypsin-EDTA
FBS	GE Hyclone	SV30160.03
Nocodazole	Merck	487928
transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
transfection medium. Commercial name: OptiMEM	Invitrogen	31985070
TPST1-EGFP	Addgene	66617	A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom)
GalT-mCherry			Made in our lab
paraformaldehyde	Merck	1.04005.1000
saponin	Sigma-Aldrich	47036
poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488	CALBIOCHEM	475904
BSA	Sigma-Aldrich	A9647
Mouse anti-GM130	BD Biosciences	610823	Primary antibody for human GM130
far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG	Invitrogen	A-21235	Far red fluorescence conjugated secondary antibody