이미징 센터의 형광 질량으로 Golgi 단백질의 양적 지역화

요약

골의 정확한 지역화는 Golgi의 세포질 기능을 이해 하기 위한 필수적입니다. 그러나, 기존의 광학 현미경은 하위 골 구조를 해결 하기 위해 수 없습니다. 여기는 양적 단백질의 하위 Golgi 지역화가 결정을 기반으로 하는 기존의 현미경 슈퍼 확인 방법에 대 한 프로토콜에 설명 합니다.

초록

Cis를 포함 하 여 하위 골 지역으로 더 분류 될 수 있다 직렬 스택된 막 cisternae 골 복잡 한 구성-골, 중간-골, 트랜스-골 및 트랜스-Golgi 네트워크. 골 세포 기능 그것의 거주 단백질의 특성 분포에 의해 결정 됩니다. 기존의 가벼운 현미경의 공간 해상도 하위 골 구조 또는 cisternae 해결 하려면 너무 낮습니다. 따라서, 면역-골드 전자 현미경 지역화 하위 골 수준에서 단백질을 선택 하는 방법 이다. 그러나, 기술과 악기는 대부분 세포 생물학 실험실의 기능을 넘어. 여기 이미징 센터의 질량 (GLIM) 체계적이 고 양적 Golgi 단백질을 지역화 하 여 골 단백질 지 방화 라는 우리의 최근에 개발한 슈퍼 해상도 방법을 설명 합니다. GLIM 표준 형광 라벨 프로토콜 및 일반적인 넓은 필드 또는 confocal 현미경을 기반으로 합니다. 그것은 현미경 시스템, 이미지 수집 및 사후 수집 분석의 시프트 반음계 수 차 보정을 포함 한다. 테스트의 하위 Golgi 지역화 지역화 몫으로 양적 표현 된다. GLIM;의 4 개 주요 이점이 있다 그것은 급속 한, 전통적인 방법과 도구에 따라, 지역화 결과 양적, 그리고 요 극 ~ 골 축 30 nm 실용적인 해상도. 여기는 지역화 테스트 Golgi 단백질 GLIM의 상세한 프로토콜에 설명 합니다.

서문

골 복잡 한 포유류 세포^1,2,3분 비/endocytic 단백질과 지질 (이 화물)의 인신 매매에 필수적인 역할을 재생 합니다. 골에서 화물은 다양 한 하위 세포질 구획 정렬 뿐만 아니라 또한 다양 한 유형의 glycosylation 수정. 포유류 골 복잡 한 일반적으로 구성 된 4-11 밀접 하 게 인접 하 고 평평한 막 낭 cisternae 라는 수많은 옆으로 연결 된 골 스택 구성 되어 있습니다. 순차적으로 누적된 골 cisternae 더로 분류 됩니다, 다른 한쪽 끝에서 cis, 중간 및 트랜스-cisternae. 트랜스에서-Golgi 스택, 트랜스의 측면-대부분 막 sac 트랜스라고 하는 관 및 그물 막 네트워크로 개발-Golgi 네트워크 (TGN)⁴. 분 비 통로에서 바인딩과 그물 (응급실)에서 파생 된 화물의 cis에 Golgi 스택에 입력-측면 및 다음 순차적으로 통과 중간 및 트랜스-cisternae. 화물 결국 종료 트랜스에서 골-골 또는 TGN destining 원형질 막, endosomes 또는 분 비과 립.

어떻게 화물 운송 Golgi 스택 및 어떻게는 Golgi의 cisternal 조직 유지의 분자 및 세포 메커니즘 신비로운 남아 있다 고 현재 열띤된 토론¹의 밑에 아직도. 이 분야에 있는 어려움 중 하나는 Golgi cisternae만 확인할 수 전자 현미경 (EM) 아래는 광학 현미경의 해상도 때문입니다 (~ 200 nm) 개별 Golgi cisternae 두 cisternal 두께에서 (< 100 nm를 해결 하기 위해 충분 하지 않습니다 그리고 거리)입니다. 따라서, 거주 단백질과 외계 화물의 하위 Golgi 지역화 통상 면역-골드 EM에 의해 결정 됩니다. 그러나, 면역-골드 그들은 매우 기술적으로 요구 하 고 그것은 대부분의 세포 생물학 실험실의 기능. EM의 해상도 하위 나노미터 수 면역-골드 엠에서 제공 하는 해상도 크게 복잡 한 항 체의 크기 (1 차 및 이차 항 체)와 금 입자에 의해 방해 하 고 20 보다 더 나쁠 수 있다 nm. 또한, EM 이미지 2D 얇은-섹션 대신 상대 위치 및 2D 섹션⁵의 방향에 따라 잘못 된 결론에 발생할 수 있습니다 골의 3 차원 세계 보기에서에서 얻을 수 있습니다. 예를 들어 EM 단일 섹션 공부 아니다 안정적으로 구별할 수 있는 소포는 관의 직교 보기 때문에 둘 다 동일한 라운드 막 프로필을 표시할 수 있습니다. 3 차원 구조화 조명 현미경 (3D-SIM) 같은 슈퍼 해상도 현미경 검사 법 기술의 최근 출현 자극 방출 소모 (호텔 위치), photoactivated 지역화 현미경 (팜)와 추계 광 재건 현미경 ( 폭풍), 가벼운 현미경⁶에서 하위 골 구조를 해결 하기 위해 가능 하 게. 그러나, 적어도 4 개의 단점이 크게는 Golgi의 세포 생물 학적 연구에 그들의 사용을 제한할 수 있습니다. 1) 현재 슈퍼 해상도 기법 대부분 세포 생물학 실험실 넘어는 비싸고 특별 한 하드웨어 구성이 필요 합니다. 2) 특별 한 형광 라벨 프로토콜 슈퍼 해상도 기법 필요 합니다. 최고의 조건 하에서 이러한 기술을 공간 해상도에 20-110 nm 주장, 3) 하지만, 실제 샘플에서 얻은 실용적인 해상도 훨씬 더 수 있습니다. 4) 비교에 전통적인 현미경 검사 법, 이러한 슈퍼 해상도 기법 여전히 어려움에서 다 색, 3D 또는 라이브 셀 이미징, 단독으로 또는 조합에서. 아마 가장 중요 한 것은, 슈퍼 해상도 현미경 검사 법 기술 및 면역-골드 그들 항복 질적 양적 지역화 데이터 대신.

부분적으로 위에서 언급 한 문제를 해결 하려고, 우리는 최근 개발 센터의 질량 (GLIM), 체계적이 고 양적 지역화는 골을 이미징 하 여 골 단백질 지 방화 라는 기반으로 하는 기존의 가벼운 현미경 검사 법 방법 면역-골드 엠⁷의 동일한 해상도에서 단백질. 이 방법에서는, 경작된 한 포유류 세포에서 골은 골 지 미니-스택으로 nocodazole, microtubule depolymerizing 약물의 치료에 의해 분산 됩니다. 광범위 한 학문은 nocodazole 유도 골 미니-스택 (이 골 지 미니-스택)에 유사한 조직에 세포 기능^{8,,910, 기본 골 더미는 설명 했다 11}. 테스트 단백질의 지역화 지 수 (LQ) GLIM 통해 취득 될 수 있다 그리고 그것은 양적 하위-Golgi 지역화를 나타냅니다. LQs의 숫자 값을 비교할 수 있습니다 하 고 25 개 이상의 골 마커의 LQ 데이터베이스 사용할 수 있다.

GLIM, 골 지 미니-스택 트리플 생 또는 것 표현 GM130, 갈 트 mCherry 및 테스트 단백질 (x)에 의해 표시 된 있습니다. GM130와 갈 트-mCherry, cis-및 트랜스-Golgi 마커 각각^12,13, 제공 참조 포인트. 트리플 형광, 빨강 (R), 녹색 (G), 빨강 (B), 인위적으로 각각 빨강, 녹색 및 파랑으로 표시 됩니다. 형광 질량 (이 하 센터)의 센터 하위 픽셀 해상도 달성 하기 위하여 채택 된다. 골 축 GalT mCherry의 GM130의 센터에서 벡터로 정의 됩니다. 골 지 미니 스택 Golgi 축을 무한 회전 대칭 구조를 원통형으로 모델링 됩니다. 따라서, 골 지 미니 스택 골 축 1 차원 구조 더 모델링 될 수 있습니다. LQ 테스트 단백질의 x d_x/d₁, 있는 d_x GM130의 x의 중심 으로부터 거리 d₁ 은 GM130의 갈 트 mCherry의 센터에서 거리로 정의 됩니다. X의 중심 축에서 인 경우에, 그것의 프로젝션 축 거리 계산을 위해 사용 됩니다. 골 축, 축 각도, d_x, d₁, 각도 α와 각도 β를 포함 하 여 GLIM에 대 한 변수는 그림 1에서 개요로 설명 된다. LQ는 Golgi 미니-스택 방향 셀에 무작위로 비록 골 축 각도 무관 합니다.

골 지 미니-스택 휘도가 이미지에 나타납니다. 우리는 GLIM에 대 한 analyzable 골 미니-스택 선택 하 세 기준 개발. 골 지 미니 스택 백그라운드의 표준 편차 (SD)의 총 강도의 비율 ≥ 30 각 채널에는, 1)는 신호 대 잡음 비율 기준. 이 표준은 골 미니-스택의 신호 대 잡음 비율에 달려 있는 질량의 중심의 위치 정확도 지키기 위하여 이다. 2) 축 각도 또는 거리 기준을는 d₁≥ 70 nm. d₁ 골 축 각도의 증가 함께 감소합니다. 때 축 각도 90 °에 도달 또는 수직, 미니 스택 d₁ 으로 확인할 수 없는 0에 접근 하는. d₁≥ 70 nm 세로 골 지 미니-스택 근처 효과적으로 제외할 수 있습니다. 어느 하나에서 3) co 선형성 기준 | α 탄 | 또는 | β 탄 | ≤ 0.3입니다. 이 기준 미니 스택 세 센터는 골 지 미니 스택 1 차원 모델에 대 한 공동 선형 충분히 보장 합니다. 모든 가벼운 현미경 빨강, 녹색 및 빨강 형광 센터의 상대적 위치를 왜곡 심각 하 게 수 있는 색수차에서 고통. 색수차 현미경 시스템의 실험적으로 110 nm 구슬, 트리플-이라고 표시 된 빨간색, 녹색 및 빨강 형광을 이미징 하 여 보정 됩니다. 각 구슬 이미지에 대 한 레드의 중심은 구슬의 진정한 위치도 정의 하며 반음계 녹색과 빨강 센터의 교대 있습니다 1 차 다항식 함수. 골 지 미니-스택 센터 녹색 및 빨강 채널의 색채 변화를 해결 하기 위해 다항식 함수를 받게 됩니다.

GLIM 통해 우리의 해상도 얻을 수 있습니다 ~ 30 nm 표준 조건 하에서 골 축. 중요 한 것은, 양적 어떤 골 단백질 지도 하는 체계적인 방법을 제공 합니다. GLIM는 넓은 필드와 같은 기존의 현미경 또는 confocal 현미경, 일반적인 형광 라벨 프로토콜을 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 이미징 및 데이터 처리는 짧은 한 시간 걸릴 수 있습니다. GLIM를 통해 우리는 직접 증명 분 비 화물의 진보적인 전환에서 cis- 트랜스-⁷골 측면.

프로토콜

참고: 아래 EGFP LQ 태그 tyrosylprotein sulfotransferase 1 (TPST1), HeLa 세포에서 골 주민 효소를 결정 하기 위한 GLIM의 단계별 프로토콜이입니다.

1. 형광 표시 된 골 지 미니-스택의 준비

1. 유리 coverslips 준비
   1. Aliquot 0.3 mL의 멸 균 Dulbecco 수정이 글의 중간 (DMEM) 조직 문화 후드에 24-잘 접시의 우물에.
   2. 한 조각의 Φ 12 m m No.1.5 유리 coverslip 유리 coverslip의 표면에 이물질 제거를 70% 에탄올과 발 부드러운 휴지를 사용 하 여 닦으십시오. 날카로운 핀셋의 쌍을 사용 하 여 간단히 70% 에탄올에는 coverslip 담가, 24-잘 접시에 전송 하 고, 잘 포함 살 균 DMEM의 바닥에 싱크.
      참고: 유리 coverslips 전통적으로 불타는 의해 살 균. 그러나, 이러한 치료에서 coverslips는 연속적으로 처리 하는 동안 쉽게 균열. 70% 에탄올 몸으로 그들을 손상 하지 않고 유리 coverslips 살 균에 효과적입니다.
   3. 커버 뚜껑 떠날 공동 37 ℃에서 24-잘 접시₂ 인큐베이터 사용까지.
2. 씨 셀
   1. DMEM 10% 보충에 T-25 플라스 크에 문화 HeLa 세포 (이 셀) 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) (여기서 부터는 완전 한 매체) 37 ° C CO₂ 배양 기에서 5% CO₂와 함께 제공. 항생제는 여기 필요 하지 않습니다.
   2. 세포에 도달 하면 ~ 80 %confluency, 문화 매체를 발음. 추가 0.25%의 1 mL 플라스 크에 트립 신-EDTA와 플라스 크에 2 분 추가 1 mL 완전 한 매체에 대 한 37 ° C CO₂ 배양 기에서 세포를 품 어 부드럽게 pipetting으로 플라스 크 벽에서 세포를 플러시.
   3. 멸 균 원심 분리 관, 스핀 500 x g 2 분 작은 세포에서 분리 된 세포를 전송 합니다. 발음은 상쾌한 고 1 mL 전체 매체에 셀 펠 릿을 일시 중단.
   4. 잘 소독된 유리 coverslip 및 씨를 포함 하는 24-잘 접시의 중간 발음 ~ 1 x 10⁵ 셀에 잘. 0.5 mL를 완전 한 매체와 우물의 볼륨을 최고. 5% CO₂와 함께 제공 된 37 ° C 공동₂ 인큐베이터에서 품 어. 하 셀 문화 ~ 80 %confluency.
3. Transfect 세포
   참고: 잘 확산된 세포는 분산 된 골 지 미니-스택 이미징에 대 한 유리한 있습니다.
   1. Transfect ~ 80 ng GalT mCherry⁷ 80 %confluent 셀과 320 ng TPST1 EGFP (참조 테이블의 재료) DNA 플라스 미드는 제조업체에서 제공 하는 프로토콜에 따라 transfection 시 약을 사용 하 여. 37 ° C CO₂ 배양 기에서 품 어. 4-6 h 부 화 후 매체를 변경 합니다. 셀이 준비 ~ 나중에 12 h.
4. Nocodazole 골 지 미니-스택 생성 치료
   1. 1 mL 디 메 틸 sulfoxide에 10 mg nocodazole 분말을 용 해 하 여 nocodazole 재고 솔루션 (33 m m)를 준비 합니다. 약 수 재고 솔루션 그리고 장기 저장을 위한-20 ° C에서 저장.
   2. 1 mL 37 ° C 완전 한 매체 (최종 농도 33 µ M)에서 nocodazole 재고 솔루션 (33 m m)의 1 µ L를 희석. 미 립 자 물질을 제거 하는 최고 속도로 원심.
   3. 우물에서 매체를 발음 하 고 완벽 한 매체를 포함 하는 33 µ M nocodazole의 0.5 mL를 추가 합니다. 셀 3 h. 진행 면역 형광 라벨 (섹션 1.5)에 대 한 37 ° C CO₂ 배양 기에 품 어.
5. 면역 형광 라벨
   참고: 갈 트-mCherry 및 TPST1 EGFP photobleaching을 피하기 위해 어둠 속에서 셀을 계속.
   1. 면역 형광 라벨에 대 한 시 약을 준비
      1. 4 %paraformaldehyde 솔루션을 준비 하려면 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) X 뜨거운 1에서 4% (w/v) paraformaldehyde 분말을 녹이 고 솔루션 0.45 μ m 필터를 통해 필터링. 솔루션-20 ° c.에 저장 될 수 있다
         주의: Paraformaldehyde 독성과 발암 성 이며 피부 자극을 일으킬 수 있습니다. 적절 한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용 하십시오.
      2. 형광 희석 버퍼 (FDB) 준비, 5% (v/v) FBS, 그리고 2% (w/v) 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 1 x PBS에 혼합 한다. 0.45 μ m 필터를 통해 솔루션을 필터링 하 고-20 ° c.에 솔루션 저장
      3. 5.35 g NH₄Cl 분말 100 m m NH₄Cl을 준비 하 여 실 온에서 솔루션을 저장할 1l 물에 용 해.
      4. 10% (w/v) 사포닌 분말 10% 사포닌, aliquot를 준비 하 고-20 ° c.에서 솔루션을 저장 하는 물에 분해
   2. 고정
      1. 0.5 mL PBS 솔루션 x 1으로 잘 한 번 헹 구 고 0.5 mL 4 %paraformaldehyde 해결책을 추가 하십시오. 실 온에서 20 분 동안 품 어. 0.5 mL 100 mM NH₄cl. 린스는 잘 두 번 0.5 mL 1 x PBS와 두 번 잘 씻어 0.5 mL 1 x PBS로 두 번. 셀 어둠 속에서 하룻밤 4 ° C에서 1 x PBS에 보관 될 수 있습니다.
   3. 형광 라벨
      1. 1 µ L 마우스 안티-GM130 1 차 항 체에 500 µ L FDB 포함 0.1% 사포닌을 희석. 24-잘 접시의 뚜껑을 반전 하 고 뚜껑에 10 µ L 1 차적인 항 체 혼합물을 적용 합니다.
      2. 날카로운 핀셋 한 켤레를 사용 하 여 추출 하 고 셀 사이드 혼합물에 접촉 하는 항 체 혼합물의 드롭에 유리 coverslip 전송. 실 온에서 1 h에 대 한 1 차적인 항 체 혼합물으로 세포를 품 어.
         참고:는 coverslip로 뚜껑 어둠의 습도 비닐 봉투에 배치할 수 있습니다.
      3. 날카로운 핀셋의 쌍을 사용 하 여 추출 및 전송 하는 coverslip 셀 쪽으로 잘까지 고 ≥ 3 번 린스 0.5 mL 1 x PBS에 동요 30 분은 필요 하지 않습니다.
      4. 1 µ L 빨강 fluorophore 활용된 염소 반대로 마우스 IgG (이차 항 체) 500 µ L FDB 포함 0.1% 사포닌에 희석.
      5. 세척 하 고 24-잘 접시의 뚜껑의 반대 표면 청소. 뚜껑에 10 µ L 빨강 이차 항 체 혼합물을 적용 합니다. 1.5.3.3 1.5.3.2-단계를 반복 합니다.
   4. 장착
      1. 1 g 글리세롤, 2.2 g poly(vinyl alcohol)를 혼합 하 여 장착 매체를 준비 (MW ~ 31000 다), 1.2 mL 1 M Tris (pH 8) 8.8 mL H₂o. 디졸브 가끔 vortexing와 60 ° C 물 욕조에 섞어. -20 ° c.에 솔루션 저장
      2. 설치 매체를 해 동 하 고 유리 슬라이드에 10 µ L를 전송. 설치 매체의 드롭에 coverslip (아래 셀 쪽)를 오버레이 합니다. 30 분 동안 37 ° C 또는 1 h 장착 매체 강화를 위한 실내 온도에 유리 슬라이드를 품 어. 무색 매니큐어와 coverslip 밀봉 하 고-20 ° c.에 유리 슬라이드 저장

2. 색채 변화 보정을 위한 형광 구슬의 준비

1. 청소 하는 Coverslip
   1. 조심 스럽게 플라스틱 걸 25 m m No.1.5 유리 coverslip의 조각 장소.
   2. 400ml 비 커에는 coverslip로 랙 전송 300 mL 1 M NaOH 가득 하 고 15 분 짧게 린스 400ml 비 커에 랙 300 mL 이온된 물으로 채워진에 대 한 목욕 sonicator (35 와트)에서 sonicate. 300 mL 99% 에탄올으로 가득 400ml 비 커에 선반을 전송 하 고 15 분 짧게 린스 400ml 비 커에 랙 300 mL 이온된 물으로 채워진에 대 한 목욕 sonicator sonicate.
   3. 2.1.2 단계를 두 번 더 반복 합니다.
   4. 린스와 300 mL 이온된 물에 coverslip 랙 10 분 반복에 대 한 400ml 비 커에 단계는 두 번 더. 60 ° C 오븐에는 선반을 전송 하 고 1 헤 게 먼지 무료 페 트리 접시에 말린된 coverslip에 coverslip 건조.
2. 유리 coverslip에 형광 구슬의 동원 정지
   1. 110 nm 다 색 형광 구슬 80-fold에 1 PBS 함유 0.1 µ g / µ L BSA x 희석. 짧게 소용돌이 비드 집계 분산 튜브입니다. 확산 청소 Φ 25 m m No.1.5 유리 coverslip (참조 섹션 2.1)에 60 µ L 희석 구슬 피 펫 팁을 사용 하 여. 어둠 속에서 진공 펌프에 연결 된 desiccator에 coverslip 건조 하 고 50 µ L 설치 매체에는 유리 슬라이드에 coverslip 탑재 (단계 1.5.4.2 참조).

3. 이미지 수집

참고: GLIM는 고정밀 질량 중심의 계산에 대 한 높은 신호 대 잡음 비율 (SNR)의 이미지를 필요합니다. 이미지 회전 디스크 confocal 또는 넓은 필드 현미경 confocal, 스캐닝 레이저 등 기존의 현미경에 의해 인수 될 수 있습니다. 계획 apochromatic 렌즈와 전 하 결합 소자 (CCD) 등 과학 상보성 금속 산화물 반도체 (sCMOS) 저 잡음 이미지 센서는 넓은 필드 현미경을 사용할 수 있습니다. 이미지 센서에 대 한 매개 변수는 낮은 읽기 소음과 높은 동적 범위를 위해 조정 됩니다. 현미경은 녹색, mCherry 및 빨강 fluorophore, 형광 필터의 최적의 구성을 갖추고 있어야 합니다 그리고 그것은 무시할 수 형광 크로스 토크를가지고 있어야 합니다. 이미징 시스템 x, 나이 키스 트 샘플링 속도 달성 하는 이상적으로, 일반적으로 x, y 및 z 크기 미만 100 복의 필요, y 및 z 축 100와 200 nm, 각각. X 및 y는 복의 크기는 항상과 pixel_size 라고 합니다. pixel_size 시스템 확대로 카메라 센서 크기를 나누어 계산할 수 있습니다.

1. 이미지 다 색 구슬
   1. 처음에 그리고 모든 이미징 세션의 끝에 녹색, 빨간색, 빨강 채널에서 이미지 다 색 구슬.
      참고: 여기, 이미지 100 X 나 1.4 계획 apochromatic 목표, 자동화 한 무대, 200 와트 금속 할로겐 광원 및 16-비트 sCMOS 카메라는 기존의 넓은 필드 피-형광 현미경 (거꾸로)를 통해 인수 했다. 여기 필터 (밴드 패스), dichroic 거울 (긴 패스)와 녹색 채널 필터 큐브의 방출 필터 (밴드 패스)에 대 한 파장은 465-495, 505 및 515-555 nm; 빨강 채널 필터 큐브에 대 한 이들은 528-553, 565 및 578-633 nm; 그리고 빨강 채널 필터 큐브에 대 한 590-650, 660 및 663-738 nm. X, 따라 복의 크기 중, y 및 z 축 각각 64, 64와 200 nm 이다.
   2. 좋은 구슬 밀도와 보기의 필드를 찾을.
   3. 녹색, 빨간색, 빨강 채널 (채널_G채널_R, 채널_B, 각각)에 3D 이미지 스택을 취득. 3 섹션 최고의 초점 비행기 (7 섹션 스택 당) 위아래를 가져가 라. 3 스택 3 TIFF 파일로 저장 합니다.
      참고: 각 채널에 대 한 노출 시간을 동적 범위를 극대화, 피하고 픽셀 채도 photobleaching 최소화 경험적으로 결정 됩니다. 위에서 설명한 대로 다른 매개 변수를 필터와 x, y 및 z는 복 셀의 크기를 선택 합니다.
2. 골 지 미니-스택 이미지
   1. 사용 TPST1-EGFP와 갈 트 mCherry 페 놓여있는지를 찾을 셀 그 표현 TPST1 EGFP GalT mCherry의 낮은 또는 중간 수준 (섹션 1.5) 슬라이드를 표시 합니다. 단계 3.1.3에서에서 설명한 3D 이미지 스택을 취득.

4. 이미지 분석

1. 형광 구슬의 센터를 취득
   1. ImageJ, 구슬 이미지 3 TIFF 파일의 구성 된 집합을 엽니다 (파일 > 이미지 > 오픈).
   2. 평균 채널_R 이미지에 가장 초점 맞춘된 섹션 주위에 3 연속 섹션 > 스택 > Z 프로젝트. "시작" 조각과 "Stop 슬라이스"의 섹션 번호를 입력 하 고 "투영 유형"의 옵션 중에서 "평균 강도"를 선택 합니다.
   3. 없는 구슬 "다각형 선택"를 사용 하 여 이미지에 포함 하는 관심사 (ROIs)의 영역을 그립니다. "분석 > 설정된 측정", "평균 회색 값"와 "표준 편차"를 확인 하십시오. 다음 실행 "분석 > 측정" 의미 및 투자 수익의 SD를 구하십시오.
   4. _. "의미 + 6 × SD"로 배경 강도 계산 해당 배경 강도 값에 의해 이미지를 빼기 "과정 > 수학 > 빼기",이 채널에 해당 하는 배경 강도 값을 입력.
   5. 같은 시작을 사용 하 여_G 채널과_B 채널 이미지 스택을 위한 4.1.2 4.1.4 단계를 반복 하 고 조각과 같은 배경 ROI 중지. 투자 수익 4.1.3 단계에서 사용 되는_G 채널과_B 채널 이미지_. 에 복사 될 수 있습니다.
   6. 3 배경 빼고 이미지를 병합 (이미지 > 색상 > 병합 채널) 빨간색으로 채널_R 를 선택 하 여 녹색으로_G 채널 및 채널_B 블루로. 3 채널의 구성 된 단일 복합 이미지를 가져옵니다.
   7. 투자 수익 관리자 (분석 > 도구 > ROI 관리자). 각 투자 수익 내 하나의 구슬 보장 단일 구슬 주위 평방 ROI를 그립니다. 키보드에 "t"를 눌러 투자 수익 ROI 관리자에 추가 합니다. 이 과정을 반복 하 고 가능한 많은 ROIs를 추가 합니다.
   8. "분석 > 설정된 측정", 단지 "질량의 중심"을 체크.
   9. 선택 채널_R, ROI 관리자에서 클릭 "측정"를 중심에 둔다; 해당 하는 두 개의 열 x 및 y 좌표 ROIs의 센터의 "결과" 창에 표시 됩니다. 복사 하 고 두 개의 열을 스프레드시트에 붙여.
   10. _G 채널 및 채널_B4.1.9 단계를 반복 합니다.
   11. 다음 순서에 따라 단일 스프레드시트에 센터의 좌표 배열:_R,_Gx_R, y, y_G,_B, x 및 y_Bx. "Beads.csv"으로 ".csv" 형식으로 스프레드시트를 저장 합니다. 파일 이름에 공간이 남겨 주세요.
2. 선택 및 측정 골 미니-스택
   1. ( 보충 자료에 연결 된) 두 매크로 ImageJ, "매크로 Golgi ROI 검사" 및 "매크로 출력 3 채널 데이터" 플러그인 설치 > 설치 ". 명확한 ROI 관리자 및 결과 창입니다.
   2. 골 지 미니 스택 이미지 3 TIFF 파일의 구성 된 집합을 열고 (파일 > 이미지 > 오픈).
   3. 4.1.5 4.1.2-단계를 반복 하 고 나중에 사용에 대 한 세 가지 배경 빼고 이미지를 저장. 기록 채널_R채널_G , SD_R,_G SD SD_B,_B 채널에 대 한 배경 SDs 각각, 나중에 사용 합니다.
   4. 4.2.3 (Ctrl + Shift + D) 단계에서 생성 된 3 배경 빼고 이미지를 복제.
   5. "프로세스 > 이미지 계산기", 먼저_{G R} 이미지를 채널 배경 빼고 추가. 배경 빼기 채널_B 이미지에 이미지를 추가 합니다. 결과 이미지에 "이미지 > 조정 > 임계값", "낮은 임계값 수준"으로 "1" 입력 "설정"을 선택 합니다. "적용"을 누르면, 흑백 바이너리 이미지 결과입니다.
   6. "분석 > 입자 분석", 대 한 크기 범위를 입력 "크기 (픽셀 ^2)". "50-무한대"를 입력 합니다. "가장자리에 제외"를 체크 하 고 "관리자 추가". 포함 하 골 미니-스택 ROIs 이제 ROI 관리자에 추가 됩니다.
      참고: 크기 범위 결정 되어야 합니다 경험적으로 일반적으로 작은 소리를 제외 하.
   7. 3 배경 빼고 이미지를 병합 (이미지 > 색상 > 병합 채널) 단계 4.2.3 빨간색으로 채널_R 을 선택 하 여,에서 녹색으로_G 채널 및 채널_B 파랑으로. 3 채널의 구성 된 단일 복합 이미지 생성 됩니다.
   8. "매크로-Golgi ROI 검사"를 선택 하 여 매크로 실행 "플러그인 > 매크로 Golgi ROI 검사". 대화형 대화 상자에서 시각적으로 각 ROI 유지 하거나 거부를 검사 합니다. 모든 3 개의 채널에서 단일 개체를 포함 하는 ROIs를 선택 합니다.
      참고:이 도구를 실행 한 후 거부 ROIs ROI 관리자에서 제거 됩니다.
   9. "지역", "평균 회색 값" 및 "질량의 중심" 체크 "분석 > 설정된 측정". 매크로 도구 "매크로 출력 3 채널 데이터"를 실행 하 여 데이터를 획득 (플러그인 > 매크로 출력 3 채널 데이터).
      참고: 영역, 평균 농도, 및 센터 (x 및 y) ROIs의_R채널,_G 채널 및 채널_B 에서 "결과" 창에 표시 됩니다.
   10. 복사 x 및 y 좌표는 스프레드시트에 센터와 다음 순서로 정렬:_R,_Gx_R, y, y_G,_B, x 및 y_Bx. (Ministacks.csv) ".csv" 파일로 스프레드시트를 저장 합니다. 파일 이름에 공간이 남겨 주세요. 센터 (단원 4.3)의 색채 변화 보정 및 LQ 계산 (섹션 4.4)를 진행 합니다.
3. 센터의 색채 변화 수정
   1. Matlab 컴파일러 런타임 (MCR)를 설치 합니다.
   2. 전용된 작업 폴더에 다음 파일을 설치: my_train.exe 및 my_test.exe. 복사 및 붙여넣기 "beads.csv"와 같은 폴더에"ministacks.csv" 파일.
   3. 윈도우의 "명령 프롬프트"를 시작 하 고 다음 명령을 입력 하 여 작업 폴더로 이동 " cd path_of_working_folder".
   4. 구슬의 센터를 사용 하 여 색채 변화 보정 파일을 생성 합니다. 다음 명령은 "my_train.exe 구슬.csv 교정.mat 1"을 입력 합니다. "교정.mat" 라는 파일이 작업 폴더에 만들어집니다. 생성 되는 다른 파일을 무시 합니다.
   5. 골 지 미니-스택의 센터의 반음계 시프트 "my_test.exe ministacks.csv corrected_ministacks.csv 교정.mat 1" 다음 명령을 입력 하 여 수정 합니다.
      참고:"corrected_ministacks.csv" 라는 파일이 작업 폴더에 만들어집니다. _G,_G, x와 y_BB y x의 순서로 배열 되어 센터의 색채 변화 수정된 좌표를 포함 합니다. 생성 되는 다른 파일을 무시 합니다. 빨강 채널 이란 주의 색수차 및 따라서 x_R 와 y_R 는 원시 데이터와 동일.
4. LQs의 계산
   1. 데이터 분석 소프트웨어 및 복사 및 붙여넣기, 시작는 시퀀스, 아래 회색 값, 지역 SDs 4.2.3 단계에서 얻은 배경 의미 (행 1에서 그들을 장소)와 반음계 시프트 수정 x 및 y 골 미니-스택에_R 채널에서의 좌표는 e 열 A로 워크시트 마찬가지로, 해당 데이터 전송 채널_G 채널_B 에 대 한 J o, K를 F 열을 각각.
   2. W, "채널 R의 통합 된 강도", "채널 G의 통합 된 강도", "채널 B의 통합 된 강도", d1, dx, ABS(tan a), ABS (황갈색 b) 및 LQ 라는 P 8 새 열을 추가 합니다.
      1. 각 열의 상단을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭 하 고 각 열의 값을 계산 하기 위해 "열 값 설정"을 선택 합니다. 열에 대 한 P, 입력 "Col(A)Col(B)"; 열에 대 한 질문, 입력 "Col(F)Col(G)"; 열에 대 한 R, 입력 "Col(K)Col(L)"; S 열, 입력 "pixel_size*Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))" "pixel_size"은 뉴 멕시코; 픽셀의 크기 T 열, 입력 "pixel_size*((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2)/(2Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O)))"; 유 열, 입력 "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2) / (2 Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))Distance(Col(D) Col(E), Col(N), Col(O))) "; V 열, 입력 "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2) / (2 Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))Distance(Col(D) Col(E), Col(N), Col(O))) "; 승 열, 입력 "열 (T) / 열 (S)".
   3. 골 지 미니-스택 소개에 설명 된 세 가지 조건 필터링 합니다.
      1. 데이터 분석 소프트웨어에서 "워크시트 > 워크시트 쿼리" 열 "경우" 테스트에 대 한 변수를 선택 하 고. 할당 다음 별칭은 I1, I2, I3, d1, A와 B 열 "채널 R의 통합 된 강도", "채널 G의 통합 된 강도", "채널 B의 통합 된 강도", d1, ABS(tan a) 및 ABS (황갈색 b), 각각. 에 "경우 조건" 입력 상자 "I1 > =30*cell(1,3)과 i 2 > =30*cell(1,8) 및 I3 > =30*cell(1,13)와 d1 > = 70과 (A < = 0.3 또는 B < = 0.3)".
      2. "새 워크시트를 추출"을 선택, "적용"을 클릭 합니다. 새 워크시트에 열 A-W analyzable 골 미니-스택 추출 됩니다.
   4. 새 워크시트에서 열의 W, 선택 상단 클릭 "열에는 통계 > 열기 대화". 체크 "N 총", "의미", "의미의 SE", "히스토그램". LQs의 통계 분석은 다음 표시 됩니다.

결과

우리 실험실에서 사용 하는 것과 같은 계획 apochromatic 렌즈를 갖춘 현대 연구 급료 가벼운 현미경 최소한의 색수차 (그림 2A)를 보여줍니다. 그러나, 다 색 형광 구슬 이미지의 주의 깊은 검사는 같은 구슬 (그림 2B)의 다른 컬러 이미지의 변화를 알아낼 수 있습니다. 빨강 채널 색수차의 무료 이며 따라서 ...

토론

이전, 가벼운 현미경 검사 법에서 골 지 단백질의 지 방화는 주로 상관 관계 또는 알려진된 지역화^{15,16, Golgi 마커 이미지와 단백질의 이미지의 중첩의 정도 의해 계량 17}. 결과 상관 관계 또는 겹치는 계수 얼마나 가까운 테스트 단백질이 골 마커를 공간적으로 반영 합니다. 이 접근에 대 한 적어도 3 개의 경고가 있다. 첫째, 상?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads	Invitrogen	T7279	As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope.
Glass coverslip Φ 12 mm (No. 1.5)	Menzel	CB00120RAC
Glass coverslip Φ 25 mm (No. 1.5)	Menzel
DMEM	Capricon	DMEM-HPA-P50
Trypsin-EDTA
FBS	GE Hyclone	SV30160.03
Nocodazole	Merck	487928
transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
transfection medium. Commercial name: OptiMEM	Invitrogen	31985070
TPST1-EGFP	Addgene	66617	A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom)
GalT-mCherry			Made in our lab.
paraformaldehyde	Merck	1.04005.1000
saponin	Sigma-Aldrich	47036
poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488	CALBIOCHEM	475904
BSA	Sigma-Aldrich	A9647
Mouse anti-GM130	BD Biosciences	610823	Primary antibody for human GM130
far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG	Invitrogen	A-21235	Far red fluorescence conjugated secondary antibody