Floresans Merkezi kütlesi Imaging tarafından Golgi protein nicel yerelleştirme

Özet

Golgi sakinlerinin kesin yerelleştirme Golgi hücresel işlevlerini anlamak için önemlidir. Ancak, geleneksel optik mikroskobu alt-Golgi yapısı dönüştürememiş demektir. Burada iletişim kuralı için kantitatif bir protein alt-Golgi yerelleştirme belirlemek geleneksel mikroskobu dayalı süper çözümleme yöntemi açıklanmaktadır.

Özet

CISdahil olmak üzere alt-Golgi bölgelere daha fazla sınıflandırılabilir seri olarak yığılmış membran cisternae Golgi kompleksi oluşur-Golgi, medial-Golgi, trans-Golgi ve trans-Golgi ağ. Golgi hücresel işlevlerini kendi ikamet proteinler karakteristik dağıtım tarafından belirlenir. Konvansiyonel ışık mikroskobu Uzaysal çözünürlük alt-Golgi yapısı veya cisternae gidermek için çok düşüktür. Böylece, IMMUNO-altın elektron mikroskopi sub-Golgi düzeyinde bir protein yerelleştirmek için seçim yöntemidir. Ancak, teknik ve araç çoğu hücre biyolojisi laboratuvarları yeteneği vardır. Biz burada Golgi protein yerelleştirme merkezleri kütlenin (ışık) sistematik ve kantitatif Golgi protein yerelleştirmek için Imaging tarafından denilen bizim son zamanlarda geliştirilen süper çözümleme yöntemi açıklanmaktadır. IŞIK standart floresan etiketleme iletişim kuralları ve geleneksel geniş-alan veya confocal mikroskoplar üzerinde temel alır. Shift renk sapmaları mikroskobik sistem, resim alma ve sonrası edinme analiz kalibrasyonu içerir. Bir test protein alt-Golgi lokalizasyonu kantitatif yerelleştirme bölüm ifade edilir. IŞIK dört ana avantajı vardır; hızlı, geleneksel yöntemler ve araçlar dayalı, yerelleştirme sonucudur nicel ve bu tanıyor ~ 30 nm pratik çözünürlük Golgi eksen boyunca. Burada bir test Golgi protein yerelleştirmek için ışık detaylı Protokolü açıklar.

Giriş

Golgi kompleksi memeli hücreleri^1,2,3' te proteinler ve yağlar (bundan sonra yükler) salgı/endositik kaçakçılığı önemli rol oynar. Golgi yükler sadece için çeşitli alt hücresel kompartmanlarda sıralanmış ama aynı zamanda glikozilasyon çeşitli türlerine göre değişiklik. Memeli Golgi kompleksi çok sayıda yanal bağlı Golgi yığınlar, ki genellikle 4-11 sıkı bitişik ve düz zar kesesi cisternae denilen oluşur oluşur. Seri olarak yığılmış Golgi cisternae daha fazla, diğer bir ucundan CIS, medial ve transkategorize edilir-cisternae. Trans-yan Golgi yığın, trans- transolarak adlandırılan borulu ve retikulum membran ağın çoğu membran sac geliştirir-Golgi ağ (TGN)⁴. Salgı yol endoplazmik retikulum (ER) türetilmiş yükler, CIS, Golgi yığın girin-yan ve daha sonra sırayla medial ve transyoluyla geçmek-cisternae. Gönderileri sonunda Golgi trans, çıkmak-Golgi veya TGN plazma zarı, endosomes veya salgı granül destining.

Nasıl yükler Golgi yığın transit ve Golgi cisternal kuruluşu nasıl saklandığına ilişkin moleküler ve hücresel mekanizmaları gizemli kalır ve hala bir hararetli tartışmalara¹altında şu anda. Bu alandaki zorluklardan biri Golgi cisternae bir optik mikroskobu çözünürlük beri sadece elektron mikroskobu (EM) altında çözülebilir (~ 200 nm) bireysel Golgi cisternae (< 100 nm her iki cisternal kalınlıkta gidermek için yeterli değil ve mesafe) Bu nedenle, alt-Golgi yerelleştirme ikamet proteinlerin ve transit gönderileri geleneksel belirlenir tarafından IMMUNO-altın EM. Ancak, IMMUNO-altın EM çok teknik olarak talep ediyor ve çoğu hücre biyolojisi laboratuvarları yeteneği. EM çözünürlük-ebilmek var olmak alt nanometre, IMMUNO-altın EM tarafından tanınan çözünürlüğü büyük ölçüde karmaşık antikor (birincil ve ikincil antikor) boyutunu ve altın parçacık tarafından engel oluyor ve 20 kötü olabilir rağmen nm. Ayrıca, EM görüntüleri 2D ince-bölümler yerine bağlı olarak göreceli konumunu ve yönünü 2D bölüm⁵hatalı sonuçlara yol açabilir Golgi 3D bir genel görünümünü elde edilir. Örneğin, bir EM tek bölüm okuyan ondan beri her ikisi de aynı yuvarlak membran profiller görüntüleyebilirsiniz güvenilir bir tübül ortogonal görünümünden bir vezikül ayırt değiştiremiyor. Emisyon tükenmesi (STED), photoactivated yerelleştirme mikroskobu (PALM) ve Stokastik optik imar mikroskobu (3D yapılı aydınlatma mikroskobu (3D-SIM), gibi süper çözümleme mikroskobu teknikleri son gelişiyle uyarılmış Fırtına), alt-Golgi yapıları ışık mikroskoplar⁶altında çözmek sağlar. Ancak, önemli ölçüde kullanımları hücre biyolojik çalışmada, Golgi sınırlayabilirsiniz en az dört dezavantajları vardır. 1) geçerli süper çözümleme teknikleri çoğu hücre biyolojisi laboratuvarları olan pahalı ve özel donanım yapılandırması gerektirir. 2) bazı süper çözümleme teknikleri için özel Floresans etiketleme iletişim kurallarına gerek. 3) rağmen en iyi koşul altında bu tekniklerin 20-110 nm mekansal çözünürlükte iddia, gerçek örneklerinde elde pratik çözünürlük çok daha kötü olabilir. 4) içinde karşılaştırma için geleneksel mikroskobu, bu süper çözümleme teknikleri hala yürütülmesi konusunda zorluklar çok renkli, 3D veya hücre Imaging, tek başına veya birlikte yaşamak. Muhtemelen en önemlisi IMMUNO-altın EM ve süper çözümleme mikroskobu teknikleri nitel nicel yerelleştirme veri yerine verim.

Kısmen yukarıda belirtilen sorunları çözmek çalışırken, biz son zamanlarda Golgi protein yerelleştirme merkezleri kütlenin (ışık), sistematik ve kantitatif bir Golgi yerelleştirmek için Imaging tarafından adlı bir konvansiyonel ışık mikroskobu dayalı yöntem geliştirdik IMMUNO-altın EM⁷eşdeğer bir çözünürlükte protein. Bu yöntemde, kültürlü memeli hücrelerinde Golgi Golgi mini-yığınlar nocodazole, bir Mikrotubul depolymerizing ilaç tedavisi tarafından dağınık olduğunu. Nocodazole kaynaklı Golgi mini yığınlarının (bundan sonra Golgi mini-yığınlar) yakından organizasyon ve hücresel işlevler^{8,9,10yerli Golgi yığınlarda benzer kapsamlı çalışmalar göstermiştir, 11}. Bir test protein yerelleştirme sayının (LQ) ışık elde edilebilir ve nicel alt-Golgi yerelleştirme gösterir. LQs sayısal değerler karşılaştırılabilir ve 25'ten fazla Golgi işaretlerinin LQ veritabanı mevcut olmuştur.

IŞIK içinde endojen veya exogenously ifade GM130, GalT-mCherry ve test protein (x) tarafından üç kez etiketli Golgi mini-yığınlar. GM130 ve GalT-mCherry, CIS- ve trans-Golgi işaretleri sırasıyla^12,13, referans noktaları sağlamak. Üçlü Floresan, kırmızı (R), yeşil (G) ve far-red (B), yapay olarak kırmızı, yeşil ve mavi sırasıyla görüntülenir. Merkezi Floresans kitle (bundan sonra Merkezi) alt piksel çözünürlük elde etmek için kabul edilir. Golgi eksen GalT-mCherry olan için GM130 merkezi üzerinden vektör olarak tanımlanır. Golgi Mini yığın Golgi ekseni etrafında sonsuz dönme simetri ile silindirik yapısı olarak modellenmiştir. Bu nedenle, Golgi Mini yığını daha fazla Golgi eksen boyunca tek boyutlu bir yapı olarak modellenebilir. LQ testi protein x d_x/d₁d_x olduğu x merkezine uzaklik bu GM130, d₁ GM130 olan için merkezi GalT-mCherry dan mesafe olsa, olarak tanımlanır. X Merkezi Eksen dışı projeksiyon Aksiyel uzaklığı hesaplama için kullanılır. Golgi eksen, Aksiyel açı, d_x, d₁, açı α ve β açısı, ışık için de dahil olmak üzere değişkenler, şematik Resim 1' de gösterilmiştir. LQ Golgi Aksiyel açısı bağımsız olsa da Golgi mini-yığınlar rastgele bir hücreye yönlendirmek.

Golgi mini-yığınlar Albümdeki inhomogeneous görünür. Analyzable Golgi mini-yığınlar ışık için seçmek için üç ölçüt geliştirdik. 1) sinyal-gürültü oranı kriteri, hangi ≥ 30 her kanaldaki arka plan standart sapma (SD) Golgi Mini yığıta toplam yoğunluğunu oranıdır. Bu ölçüt Merkezi kütlenin, Golgi mini-yığınlar sinyal noise oranları üzerinde bağlıdır konumlandırma doğruluğunu sağlamaktır. 2) d₁≥ 70 gerektirir Aksiyel açı ya da mesafe kriteri, nm. d₁ Golgi Aksiyel açısı artış ile azalır. Ne zaman Aksiyel açı 90 ° yaklaşıyor ya da dikey, Mini yığını d₁ sigara çözülebilir olur 0 yaklaşıyor. d₁≥ 70 nm etkili bir şekilde dikey Golgi mini-yığınlar hariç. 3) co-doğrusallık ölçütü, hangi da | tan α | veya | tan β | ≤ 0,3 olduğunu. Bu ölçüt mini bir yığın üç Merkezi yeterince co-doğrusal Golgi Mini yığını için bizim tek boyutlu model olmasını sağlar. Tüm ışık mikroskoplar renk sapması olan kırmızı, yeşil ve far-red floresan merkezleri göreli konumları ciddi deforme edebilirsiniz acı. Renk sapmaları mikroskop sistemlerinin deneysel olarak kırmızı, yeşil ve far-red floresan tarafından üç kez etiketli 110 nm boncuk Imaging tarafından kalibre edilmiş. Her boncuk görüntüsünün kırmızı merkezi boncuk gerçek konumunu tanımlanır ve Kromatik vardiya-yeşil ve far-red merkezleri tarafından birinci dereceden polinom fonksiyonların donatılmıştır. Golgi mini-yığınlar merkezlerinden Kromatik yeşil ve far-red Kanallar olarak kaydırır düzeltmek için polinom fonksiyonların tabi.

IŞIK ile a kararlılık-in elde edebilirsiniz ~ 30 nm standart koşullar altında Golgi eksen boyunca. Önemlisi, kantitatif Golgi protein var eşlemek için uyguladıkları bir yöntem sağlar. IŞIK geleneksel mikroskoplar, geniş alanlı gibi veya confocal mikroskoplar, ortak Floresans etiketleme iletişim kuralları kullanılarak gerçekleştirilebilir. Görüntüleme ve veri işleme gibi bir saat gibi kısa sürebilir. IŞIK, biz doğrudan salgı kargo aşamalı geçiş CIS- transiçin göstermiştir-Golgi⁷yan.

Protokol

Not: Işık adım adım bir protokol tyrosylprotein EGFP LQ öğesini sulfotransferazlar 1 (TPST1), bir Golgi ikamet enzimi, HeLa hücreleri belirlemek için aşağıdadır.

1. Golgi Floresans etiketli Mini-yığınlar hazırlanması

1. Cam coverslips hazırlamak
   1. Aliquot 0.3 mL steril Dulbecco modifiye kartal'ın orta (DMEM) 24-şey plaka bir doku kültürü başlıklı bir kuyu için.
   2. Bir parça Φ 12 mm No.1.5 cam coverslip cam coverslip yüzeyinde enkaz kaldırmak için % 70 etanol ile sildi yumuşak kağıt mendil kullanarak silin. Kısaca, coverslip % 70 etanol emmek 24-şey plaka transfer ve de içeren steril DMEM altına lavabo bir çift keskin cımbız kullanın.
      Not: Cam coverslips geleneksel yanan tarafından sterilize. Ancak, bu tedavi altında coverslips kolayca daha sonra işleme sırasında çatlamak. % 70 etanol iliklerine kadar onlara zarar vermeden cam coverslips sterilize etkili olur.
   3. Kapak ile örtülü 24-şey plaka 37 ° C'de CO₂ kuluçka makinesi kadar kullanmak bırakın.
2. Tohum hücreleri
   1. Kültür HeLa hücreleri (bundan sonra hücreleri) DMEM % 10 ile desteklenmiş bir T-25 şişesi Fetal sığır Serum (FBS) (bundan sonra tam orta) 37 ° C CO₂ kuluçka %5 CO₂ile birlikte. Antibiyotik burada gerekli değildir.
   2. Hücreleri ulaştığınız zaman ~ %80 confluency, kültür orta Aspire edin. 1 mL % 0.25 ekleyin tripsin-EDTA balonun içine ve 37 ° C CO₂ kuluçka 2 dk. eklemek 1 mL tam orta için hücre şişeye kuluçkaya ve yavaşça pipetting tarafından hücreleri şişesi duvarından floş.
   3. Müstakil hücreleri bir steril Santrifüjü tüp ve 500 x g hücreleri cips 2 min için spin aktarın. Süpernatant Aspire edin ve hücre Pelet 1 mL tam ortamda askıya alma.
   4. Steril cam coverslip ve tohum içeren 24-şey plaka kuyusu ortamda Aspire edin ~ 1 x 10⁵ hücreleri iyi. Sesi iyi 0.5 ml tam orta ile top. %5 CO₂ile sağlanan bir 37 ° C CO₂ kuluçka kuluçkaya. Hücrelere kültür ~ %80 confluency.
3. Hücre transfect
   Not: İyi yaymak dağınık Golgi mini-yığınlar görüntüleme için avantajlı hücrelerdir.
   1. Transfect ~ %80 80 ng GalT-mCherry⁷ Konfluent hücrelerle ve 320 ng TPST1-EGFP (bakınız Tablo reçetesi) DNA plazmid üreticisi tarafından sağlanan protokolüne göre transfection reaktif kullanarak. 37 ° C CO₂ kuluçka makinesine kuluçkaya. Orta sonra 4-6 h kuluçka değiştirin. Hücreleri hazırız ~ 12 h daha sonra.
4. Golgi mini-yığınları oluşturmak için Nocodazole tedavi
   1. Nocodazole hisse senedi çözüm (33 mM) 10 mg nocodazole tozu 1 mL Dimetil sülfoksit çözülerek hazırlayın. Aliquot hisse senedi çözüm ve mağaza-20 ° c uzun süreli depolama için.
   2. Nocodazole hisse senedi çözüm (33 mM) 1 µL 1 mL 37 ° C tam orta (son konsantrasyonu 33 µM) oranında seyreltin. En yüksek hızda partikül madde kaldırmak için santrifüj kapasitesi.
   3. İyi orta Aspire edin ve tam orta içeren 33 µM nocodazole 0.5 mL ekleyin. Hücreleri bir 37 ° C CO₂ kuluçka (Bölüm 1.5) etiketleme ayirt için 3 h. devam et için kuluçkaya.
5. Ayirt etiketleme
   Not: hücreleri GalT-mCherry ve TPST1-EGFP photobleaching önlemek için karanlıkta bırakın.
   1. Reaktifler ayirt etiketleme için hazırlamak
      1. %4 paraformaldehyde çözeltisi hazırlamak için sıcak 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) X % 4 (w/v) paraformaldehyde toz geçiyoruz ve çözüm 0,45 µm filtreden filtre. Belgili tanımlık eriyik-ebilmek var olmak stok-20 ° C'de
         Uyarı: Toksik ve kanserojen Paraformaldehyde ve cilt tahrişine neden olabilir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) giymek.
      2. Floresans seyreltme arabellek (FDB) hazırlamak için %5 (v/v) FBS ve %2 (w/v) sığır serum albumin (BSA) 1 x PBS içinde karıştırın. Çözüm 0,45 µm ile filtre ve çözüm-20 ° C'de depolayın
      3. 5.35 g NH₄Cl tozu 100 mM NH₄Cl hazırlamak ve çözüm oda sıcaklığında saklamak için 1 L suda çözülür.
      4. Su % 10 saponin, aliquot hazırlamak ve çözüm-20 ° C'de depolamak için % 10 (w/v) saponin toz geçiyoruz
   2. Fiksasyon
      1. İyi bir kez PBS çözüm x 0.5 mL 1 ile durulayın ve 0.5 mL % 4 paraformaldehyde çözüm ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dk için kuluçkaya. Yani 0.5 mL 1 x PBS ile iki kez ve iki kez ile 0.5 mL 100 mM NH₄CL durulama iyi durulama 0.5 mL 1 x PBS ile iki kez. Hücreler karanlıkta gecede 4 ° C'de 1 x PBS içinde tutulabilir.
   3. Floresans etiketleme
      1. 1 µL fare anti-GM130 birincil antikor 500 µL FDB kapsayan %0,1 saponin içinde sulandırmak. 24-şey plaka kapak ters ve 10 µL birincil antikor karışımı kapağı üzerine uygulayın.
      2. Bir çift keskin cımbız ayıklamak ve cam coverslip karışımı ile temas ve hücre takımıdır antikor karışımı sağlanması damla üzerine aktarmak için kullanın. Birincil antikor karışımı oda sıcaklığında 1 h için hücrelerle kuluçkaya.
         Not: Kapak coverslip ile oksijen bir plastik torba içinde belgili tanımlık karanlık yerleştirilebilir.
      3. Ayıklamak ve üç kez ≥ 0.5 mL 1 x PBS durulayın ve yukarı coverslip hücre tarafı iyi transfer için bir çift keskin cımbız kullanın 30 dk. Çalkalamalı gereksiz.
      4. 1 µL far-red fluorophore konjuge keçi Anti-IgG (ikincil antikor) içinde fare 500 µL FDB kapsayan %0,1 saponin sulandırmak.
      5. 24-şey plaka kapağını geriye doğru yüzeyi temizleyin ve yıkayın. Kapağı 10 µL far-red ikincil antikor karışımı uygulamak. Adımları yineleyin 1.5.3.2 - 1.5.3.3.
   4. Montaj
      1. 1 g gliserol, 2,2 g poly(vinyl alcohol) karıştırılarak montaj orta hazırlamak (MW ~ 31.000 Da), 1.2 mL 1 M Tris (pH 8) ve 8,8 mL H₂O. erime 60 ° C su banyosu ile zaman zaman vortexing karışımı. Çözüm-20 ° C'de depolayın
      2. Montaj orta çözülme ve 10 µL bir cam slayt üzerine aktarın. Coverslip (hücre tarafı aşağı) Montaj orta damla yerleşimi. Cam kaymak için 30 dk 37 ° C veya oda sıcaklığında montaj orta sertleşmesine 1 h için kuluçkaya. Renksiz oje ile coverslip mühür ve cam slayt-20 ° C'de depolayın

2. renk-shift düzeltme floresan boncuk hazırlanması

1. Temizlik Coverslip
   1. Dikkatle 25 mm No.1.5 cam coverslip plastik bir raf üzerine bir parça yerleştirin.
   2. Transfer coverslip ile raf bir 400 mL kabı için 1 M NaOH ile 300 mL dolu ve banyo sonicator (35 Watt) 300 mL deiyonize su ile durulama 400 mL kabı rafa dolu 15 dk. kısa bir süre için solüsyon içeren temizleyicide. 15 dk. kısaca durulama 400 mL kabı rafa 300 mL deiyonize su banyosu sonicator solüsyon içeren temizleyicide ve raf 300 mL % 99 etanol ile dolu bir 400 mL kabı transfer.
   3. 2.1.2 iki kez daha tekrarlayın.
   4. Coverslip 300 mL deiyonize su ile raf bir 400 mL ölçek 10 dk. tekrarlamak için iki kez daha adım durulayın. 60 ° C fırın raf aktarmak ve coverslip 1 h. mağaza tozsuz Petri kabına kurutulmuş coverslip için kuru.
2. İmmobilizasyon floresan boncuk cam coverslip üzerinde
   1. 110 nm çok renkli floresan boncuk 80-fold içinde 1 PBS kapsayan 0,1 µg/µL BSA x oranında seyreltin. Kısaca girdap tüp boncuk toplamları dağıtmak için. 60 seyreltilmiş µL boncuk temizlenmiş Φ 25 mm No.1.5 cam coverslip (bakınız Bölüm 2.1) üzerine yayılmış bir pipet ucu kullanarak. Karanlıkta bir vakum pompası bağlı bir desiccator coverslip kuru ve coverslip 50 µL montaj orta bir cam slayt üzerine monte (bkz. Adım 1.5.4.2).

3. resim alma

Not: Yüksek hassasiyetli Merkezi kütlenin hesaplama için yüksek sinyal gürültü oranı (SNR) görüntülerini ışık gerektirir. Görüntü confocal, tarama dönen disk confocal veya geniş alanlı mikroskop lazer gibi geleneksel mikroskoplar tarafından elde edilebilir. Planı apochromatic objektif lens ve bir şarj kuplajlı cihaz (CCD) ve bilimsel tamamlayıcı metal oksit yarı iletken (sCMOS) gibi düşük gürültü görüntü sensörü ile donatılmış geniş alanlı mikroskop-ebilmek var olmak kullanılmış. Görüntü sensörü için parametreleri düşük bir okuma gürültü ve yüksek dinamik aralığı sağlamak için ayarlanır. Mikroskop floresan filtre yeşil, mCherry ve far-red fluorophore için en uygun yapılandırma ile donatılmış olması gerekir ve ihmal edilebilir Floresans çapraz-hadis olması gerekir. İdeal olarak, görüntüleme sistemi x, Nyquist örnekleme hızı elde genellikle x, y ve z boyutu 100'den küçük olmak bir Voksel gerektirir, y ve z ekseni, 100 ve 200 nm, anılan sıraya göre. X ve y Voksel boyutunu her zaman eşit ve pixel_size adlandırılır. Pixel_size kamera sensör boyutu sistem büyütme tarafından bölünmesi ile hesaplanır.

1. Görüntü çok renkli boncuklar
   1. Yeşil, kırmızı ve far-red kanal başında ve görüntüleme her oturumun sonunda görüntü çok renkli boncuklar.
      Not: Burada, 100 X NA 1.4 planı apochromatic amaç, motorlu sahne, 200 Watt metal halide ışık kaynağı ve 16-bit sCMOS kamera ile donatılmış (ters) geleneksel geniş alanlı epi-floresan mikroskop aracılığıyla görüntüleri elde. 465-495, 505 ve 515-555 nm dalga boyu uyarma filtre (bant geçiren), dikroik ayna (uzun pası) ve emisyon filtre (bant geçiren) yeşil kanal filtre küp için vardır; 528-553, 565 ve 578-633 nm Bunlar kırmızı kanalı filtre küp için; ve 590-650, 660 ve 663-738 nm bunlar far-red kanal filtre küp için. Satın alma, bir Voksel x boyunca boyutunu y ve z ekseni 64, 64 ve 200 nm, sırasıyla bulunuyor.
   2. Görüş alanı iyi boncuk yoğunluğu ile bulmak.
   3. 3D görüntü yığınları yeşil, kırmızı ve far-red kanalları (_G, kanal_R, kanal_B, sırasıyla kanal) edinin. 3 bölümden üstündeki ve altındaki en iyi odak düzlemi (yığın başına 7 bölümler) alın. Üç yığınları üç TIFF dosyaları olarak kaydedin.
      Not: Her kanal için çekim hızı kameranın dinamik alanı en üst düzeye çıkarmak, piksel doygunluk kaçınmak ve photobleaching en aza indirmek için ampirik olarak belirlenir. Diğer parametreleri, filtreler ve x, y ve z Voksel boyutunu gibi yukarıda da açıklandığı gibi seçilir.
2. Görüntü Golgi mini-yığınları
   1. Kullanım TPST1-EGFP ve GalT-mCherry transfected ve o hızlı TPST1 EGFP ve GalT-mCherry düşük veya orta düzeyde hücreleri bulmak için (Bölüm 1.5) slaytlar fluorescently etiketli. 3D görüntü yığınları 3.1.3 adımda anlatıldığı gibi elde.

4. görüntü analizi

1. Floresan boncuk merkezlerinden elde
   1. ImageJ içinde üç TIFF dosyaları oluşan boncuk fotoğraf bir dizi açın (Dosya > Görüntü > açın).
   2. 3 ardışık bölümleri kanal_R görüntü tarafından en iyi odaklı bölümünde çevresinde ortalama > Yığınlar > Z proje. "Başlangıç dilim" ve "Stop dilim" istediğiniz bölüm numarasını girin ve "projeksiyon tip" Seçenekler arasında "Ortalama yoğunluğu" seçin.
   3. Hiçbir boncuk "Çokgen seçimleri" kullanarak görüntü içeren bölgeleri (ROIs) ilgi çekmek. İçinde "Analyze > Set ölçümleri", sadece "Ortalama gri değeri" ve "Standart sapma" kontrol edin. O zaman idam etmek "Analyze > ölçü" ortalama ve SD yatırım Getirisi elde etmek için.
   4. Arka plan yoğunluk_. "ortalama + 6 × SD" olarak hesaplamak Görüntü ile ilgili arka plan yoğunluk değerleri tarafından çıkarma "işlem > Matematik > çıkarma", bu kanala karşılık gelen arka plan yoğunluk değeri girin.
   5. Aynı başlangıç kullanarak 4.1.2-4.1.4 kanal_G ve kanal_B görüntü yığınları için adımları yineleyin ve dilim ve aynı arka plan yatırım Getirisi durdurmak. Kanal_G kanal_B görüntüleri_. için yatırım Getirisi 4.1.3 adımda kullanılan Not kopyalanabilir
   6. Üç arka plan düşülen görüntüleri birleştirme (Görüntü > renk > kanalları Birleştir) kanal_R kırmızı seçerek,_G yeşil olarak kanal ve kanal_B mavi olarak. Üç kanal oluşan tek bir bileşik görüntü elde edilir.
   7. ROI Yöneticisi'ni başlatma (Analyze > Araçlar > ROI Yöneticisi). Her yatırım Getirisi içinde tek bir boncuk olduğunu kontrol ettikten tek boncuk etrafında kare bir yatırım Getirisi çizin. Yatırım Getirisi "t" üstünde belgili tanımlık klavye tuşlarına basarak ROI Yöneticisi için ekleyin. Bu adımları tekrarlayın ve mümkün olduğunca çok sayıda ROIs ekleyin.
   8. İçinde "Analyze > Set ölçümleri", sadece "Merkezi kütlenin" kontrol edin.
   9. Kanal_R, ROI Yöneticisi'nde seçin, "merkezleri; elde etmek için ölçüsü" iki sütun karşılık gelen x ve y koordinat ROIs sayılı "Sonuç" penceresinde görüntülenir. Kopyalayın ve iki sütun bir elektronik tabloya yapıştırabilirsiniz.
   10. 4.1.9 kanal_G ve kanal_Biçin adımları yineleyin.
   11. Tek bir tablo aşağıdaki sırada merkezlerinde koordinatlarını düzenlemek: x_R, y_R,_Gx, y_G,_B, x ve y_B. Elektronik tablo "beads.csv" ".csv" biçiminde kaydedin. Dosya adında boşluk bırakın.
2. Seçin ve Golgi mini-yığınlar ölçmek
   1. İki makro ( Ek malzemeleriçinde ekli) ImageJ, "Makro-Golgi ROI muayene" ve "Makro-çıkış 3 kanal veri" eklentileri yüklemek > yüklemek ". Açık ROI Yöneticisi ve sonuç penceresi.
   2. Golgi Mini yığın fotoğraf üç TIFF dosyaları oluşan bir dizi açın (Dosya > Görüntü > açık).
   3. Adımları 4.1.2 - 4.1.5 yineleyin ve üç arka plan düşülen görüntüleri daha sonra kullanmak için kaydedebilirsiniz. Kayıt arka plan SDs kanal_R, kanal_G ve kanal_B SD_R, SD_G ve SD_B, sırasıyla, daha sonra kullanın.
   4. 4.2.3 (Ctrl + SHIFT + D) adımından oluşturulan üç arka plan düşülen görüntüleri yinelenen.
   5. İçinde "işlem > görüntü hesap makinesi", ilk olarak kanal_R resimlere kanal_G arka plan düşülen ekleyin. Sonuçta elde edilen görüntüyü arka plan düşülen kanal_B görüntüsüne ekleyebilirsiniz. Elde edilen görüntüye içinde "görüntü > ayar > eşik", "" 1"olarak"Düşük eşik düzeyi"giriş için Kur" seçeneğini. "Uygula" tuşuna bastıktan sonra siyah beyaz bir ikili görüntü sonuçlandı.
   6. İçinde "Analyze > parçacıklar analiz", giriş için boyut aralığının "boyutu (piksel ^ 2)". "50-sonsuz" girdi. "Kenarlarda dışla" adlı ve "Yöneticisi Ekle". Golgi mini-yığınlar içeren ROIs şimdi ROI Yöneticisi için eklenir.
      Not: Boyut aralığı ampirik olarak genellikle küçük sesler dışlamak için belirlenmelidir.
   7. Üç arka plan düşülen görüntüleri birleştirme (Görüntü > renk > kanalları Birleştir) adım 4.2.3 kanal_R kırmızı seçerek,_G yeşil olarak kanal ve kanal_B mavi olarak. Üç kanal oluşan tek bir bileşik görüntü oluşturulur.
   8. Makroyu çalıştırabilirsiniz "Makro-Golgi ROI muayene" seçerek "Eklentiler > makro-Golgi ROI muayene". Etkileşimli iletişim kutusunda, almak veya reddetmek için her yatırım Getirisi kontrol edin. Tüm üç kanal tek bir nesnede içeren ROIs seçin.
      Not: Bu aracı çalıştırdıktan sonra ROI Yöneticisi'nden reddedilen ROIs ortadan kalkar.
   9. Sadece "Alan", "Ortalama gri değeri" ve "Merkezi kütlenin" iade "Analyze > Set ölçümleri". Makro alet "Makro-çıkış 3 kanal veri" başlatarak verisini almak (Eklentiler > makro-çıkış 3 kanalları veri).
      Not: Alanları, ortalama yoğunluklarda ve merkezlerinin (x ve y) ROIs kanal_R, kanal_G ve kanal_B "Sonuç" penceresinde görüntülenir.
   10. Kopya x ve y koordinatlarını merkezleri bir elektronik tabloya ve onları aşağıdaki sıraya göre düzenleyebilirsiniz: x_R, y_R,_Gx, y_G,_B, x ve y_B. Elektronik bir ".csv" (ministacks.csv) dosyası olarak kaydedin. Dosya adında boşluk bırakın. Kromatik kaymalı düzeltme (Bölüm 4.3) merkezlerinin ve LQ hesaplama (Bölüm 4.4) için devam edin.
3. Renk-shift düzeltme merkezleri
   1. MATLAB derleyici çalışma zamanı (MCR) yükleyin.
   2. Aşağıdaki dosyalar özel bir çalışma klasöre yükleyin: my_train.exe ve my_test.exe. Kopyala Yapıştır "beads.csv" ve"ministacks.csv" dosyaları aynı klasörde.
   3. "Komut istemi" Windows başlatın ve aşağıdaki komutu yazarak çalışma klasörüne gidin " cd path_of_working_folder".
   4. Merkezleri boncuk kullanarak bir renk kayması kalibrasyon dosyası oluşturma. Aşağıdaki komut "my_train.exe boncuk.csv kalibrasyon.mat 1" yazın. "Kalibrasyon.mat" adlı bir dosya içinde çalışma klasörü oluşturulur. Oluşturulan diğer dosyaları yoksayar.
   5. Kromatik shift-Golgi mini-yığınlar sayılı "my_test.exe ministacks.csv corrected_ministacks.csv kalibrasyon.mat 1" aşağıdaki komutu yazarak düzeltin.
      Not:"corrected_ministacks.csv" adlı bir dosya içinde çalışma klasörü oluşturulur. Kromatik kaymalı sırasına göre_G,_G,_B ve y_Bx y x düzenlenmiş olan merkezleri, düzeltilmiş koordinatlarını içerir. Oluşturulan diğer dosyaları yoksayar. Kırmızı kanalı olarak tanımlanır not alın ücretsiz renk sapmaları ve bu nedenle x_R ve y_R ham veri olarak aynıdır.
4. LQs hesaplanması
   1. Veri analiz yazılımı ve Kopyala ve Yapıştır, başlatmak gri değerler, alanlar, arka plan SDs 4.2.3 adımından elde edilen sıra demek (satır 1 yer onları) ve Kromatik-shift düzeltilmiş x ve y Golgi mini-kanal_R yığınlarda koordinatlarını bir çalışma sayfası E. için A sütunları olarak Benzer şekilde, kanal_G ve kanal_B için karşılık gelen veri sütunları F J ve K o, sırasıyla aktarın.
   2. Sekiz yeni sütunlar P adında "entegre yoğunluğunu kanal R", "Kanal G entegre yoğunluğu", "entegre yoğunluğunu kanal B", d1, dx, ABS(tan a), ABS (tan b) ve LQ W için ekleyin.
      1. İlgili sütunun üst sağ tıklayın ve "Sütun değerleri her sütunun değerleri hesaplamak için ayarla" seçin. Sütun için P, giriş "Col(A)Col(B)"; sütun için Q, giriş "Col(F)Col(G)"; sütun için R, giriş "Col(K)Col(L)"; S sütun için giriş "pixel_size*Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))" "pixel_size" NM; piksel boyutunu olduğu yerde T sütun için giriş "pixel_size*((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2)/(2Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O)))"; U sütun için giriş "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2) / (2 Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) "; V sütun için giriş "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2) / (2 Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) "; W sütun için giriş "Col (T) / Col (S)".
   3. Golgi mini yığınlarının girişbölümünde açıklanan üç ölçütlere göre filtre uygulayın.
      1. Veri analiz yazılımı gidin "çalışma sayfası > çalışma sorgu" ve "Eğer" test için sütun değişkenleri seçin. Aşağıdaki diğer adlar I1, I2, I3, atama d1, A ve B için sütunları "entegre yoğunluğunu kanal R", "Kanal G entegre yoğunluğu", "Kanal B entegre yoğunluğu", d1, ABS(tan a) ve ABS (tan b), anılan sıraya göre. İçinde "Eğer koşul" giriş kutusu, "I1 > =30*cell(1,3) ve I2 > =30*cell(1,8) ve I3 > =30*cell(1,13) ve d1 > = 70 ve (A < = 0,3 veya B < 0,3 =)".
      2. "Ayıklamak için yeni çalışma" seçin, "Uygula"'yı tıklatın. Sütun A-W analyzable Golgi mini-yığınlar, yeni bir çalışma sayfasına ayıklanır.
   4. Yeni çalışma sayfasında sağ sütunun W, select üst tıklayın "sütun istatistikleri > Aç iletişim". Onay "N toplam", "Yani", "Demek SE", "Çubuk". LQs istatistiksel analizi sonra görüntülenir.

Sonuçlar

Bizim laboratuarda kullanılan gibi bir planı apochromatic objektifle donatılmış modern araştırma sınıf ışık mikroskobu çok az renk sapmaları (Şekil 2A) gösterir. Ancak, dikkatli bir muayene çok renkli floresan boncuk görüntünün üst karakter aynı boncuk (Şekil 2B) farklı renk görüntülerin ortaya çıkarabilir. Biz kırmızı kanalı renk sapmaları özgür ve bu nedenle...

Tartışmalar

Daha önce yerelleştirme ışık mikroskobu altında Golgi protein ağırlıklı olarak korelasyon veya protein görüntünün Golgi işaret bilinen Yerelleştirme^{15,16resimle örtüşen tarafından sayılabilir, 17}. Elde edilen korelasyon veya örtüşen katsayısı ne kadar yakın test Golgi işaretçisi için dağınık şekilde proteindir yansıtır. Bu yaklaşım için en az üç uyarılar vardır. İlk olarak, korelasyon...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads	Invitrogen	T7279	As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope.
Glass coverslip Φ 12 mm (No. 1.5)	Menzel	CB00120RAC
Glass coverslip Φ 25 mm (No. 1.5)	Menzel
DMEM	Capricon	DMEM-HPA-P50
Trypsin-EDTA
FBS	GE Hyclone	SV30160.03
Nocodazole	Merck	487928
transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
transfection medium. Commercial name: OptiMEM	Invitrogen	31985070
TPST1-EGFP	Addgene	66617	A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom)
GalT-mCherry			Made in our lab.
paraformaldehyde	Merck	1.04005.1000
saponin	Sigma-Aldrich	47036
poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488	CALBIOCHEM	475904
BSA	Sigma-Aldrich	A9647
Mouse anti-GM130	BD Biosciences	610823	Primary antibody for human GM130
far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG	Invitrogen	A-21235	Far red fluorescence conjugated secondary antibody