Quantitative Lokalisierung eines Golgi-Proteins von Imaging Center der Fluoreszenz Masse

Zusammenfassung

Die präzise Lokalisierung der Golgi-Bewohner ist wesentlich für das Verständnis der zellulären Funktionen der Golgi. Konventionelle Lichtmikroskopie ist jedoch nicht in der Lage, die Sub-Golgi-Struktur zu lösen. Hier beschreiben wir das Protokoll für eine konventionellen Mikroskopie basierte Höchstauflösung Methode, um die Sub-Golgi Lokalisation eines Proteins quantitativ zu bestimmen.

Zusammenfassung

Der Golgi-Komplex besteht aus seriell gestapelten Membran Cisternen, die in Sub-Golgi Regionen, einschließlich der GUS-Staatenweiter kategorisiert werden können-Golgi, Medial-Golgi, Trans-Golgi und Trans-Golgi-Netzwerk. Zellfunktionen der Golgi werden durch die charakteristische Verteilung der ansässigen Proteine bestimmt. Die räumliche Auflösung der konventionellen Lichtmikroskopie ist zu niedrig um Sub-Golgi Struktur oder Cisternen zu lösen. So ist Immuno-Gold-Elektronen-Mikroskopie eine Methode der Wahl, ein Protein auf der Sub-Golgi-Ebene zu lokalisieren. Das Instrument und Technik sind jedoch darüber hinaus die Möglichkeit, die meisten Zelle Biologie Labors. Hier beschreiben wir unsere neu entwickelte Höchstauflösung Methode namens Golgi Protein Lokalisierung von imaging Center der Masse (GLIM), systematisch und quantitativ ein Golgi-Protein zu lokalisieren. GLIM basiert auf standard Fluoreszenz Kennzeichnung Protokolle und konventionellen Weitfeld- oder konfokale Mikroskope. Es geht um die Kalibrierung der chromatischen Verschiebung Aberration des mikroskopischen Systems, die Bildaufnahme und die Analyse nach der Übernahme. Die Sub-Golgi Lokalisierung eines Test-Proteins wird quantitativ die Lokalisierung Quotienten ausgedrückt. Es gibt vier Hauptvorteile von GLIM; Es ist schnell, bezogen auf konventionelle Methoden und Werkzeuge, das Ergebnis der Lokalisierung ist quantitativ und es bietet ~ 30 nm praktische Auflösung entlang der Golgi-Achse. Hier beschreiben wir das ausführliche Protokoll der GLIM einenTest Golgi Protein zu lokalisieren.

Einleitung

Der Golgi-Komplex spielt entscheidende Rolle sekretorischen/endocytic Handel von Proteinen und Lipiden (im folgenden Ladungen) in Säugerzellen^1,2,3. Bei der Golgi sind Ladungen nicht nur auf verschiedenen subzellulären Fächer sortiert sondern auch durch verschiedene Arten der Glykosylierung modifiziert. Der Säugetier-Golgi-Komplex umfasst zahlreiche seitlich angeschlossene Golgi-Stapel, die besteht in der Regel von 4-11 eng benachbarte und flache Membran Säcken genannt Cisternen. Seriell gestapelten Golgi-Cisternen werden weiter kategorisiert, von einem Ende zum anderen, als GUS, Medial und Trans-Cisternen. Auf der Trans-Seite aus einem Golgi-Stapel, der Trans-die meisten Membran Sac entwickelt sich zu einem röhrenförmigen und Retikulum Membran-Netzwerk namens Trans-Golgi-Netzwerk (TGN)⁴. In der sekretorischen Weg Ladungen abgeleitet aus dem endoplasmatischen Retikulum (ER) geben Sie einen Golgi-Stapel in die GUS-Seite und dann nacheinander durchlaufen die Medial und Trans-Cisternen. Ladungen beenden schließlich die Golgi auf dem Trans-Golgi oder TGN destining der Plasmamembran, Endosomen oder sekretorischen Granulat.

Die molekularen und zellulären Mechanismen der wie Ladungen einen Golgi-Stapel transit und wie die Golgi seine cisternal Organisation unterhält bleibt mysteriös und werden derzeit noch eine hitzige Debatte¹. Schwierigkeiten in diesem Bereich gehört, dass Golgi-Cisternen nur unter der Elektronenmikroskopie (EM) seit dem Beschluss von einem optischen Mikroskop gelöst werden können (~ 200 nm) nicht ausreicht, einzelne Golgi-Cisternen (< 100 nm in beiden cisternal Dicke zu lösen (und Entfernung). Daher werden die Sub-Golgi Lokalisierung von ansässigen Proteine und Transit Ladungen konventionell von Immuno-Gold EM bestimmt. Jedoch die Immuno-Gold-EM ist technisch sehr anspruchsvoll und es ist darüber hinaus die Möglichkeit, die meisten Zelle Biologie Labors. Obwohl die Auflösung der EM kann Sub-Nanometer, die Auflösung durch die Immuno-Gold EM gewährte wird stark von der Größe des Antikörpers Komplex (PV plus der Sekundärantikörper) und das gold Partikel behindert, und es schlimmer, als 20 sein kann nm. Darüber hinaus stammen EM Bilder von dünn-2D-Schnitte statt eine globale 3D-Ansicht des Golgi, die abhängig von der relativen Position und Ausrichtung der 2D-Schnitt⁵falschen Schlüssen führen kann. Beispielsweise kann ein EM einteiligen Studium ein Vesikels zuverlässig aus der orthogonalen Ansicht von einem Röhrchen zu unterscheiden, da beide identische Runde Membran Profile angezeigt werden können. Die letzten Advent Höchstauflösung Mikroskopie-Techniken, wie 3D-strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (3D-SIM), stimulierte Emission Depletion (STED), photoaktiviert-Lokalisierung-Mikroskopie (PALM) und stochastische optische Rekonstruktion Mikroskopie ( (Sturm), ermöglicht es, Sub-Golgi Strukturen im Rahmen von Lichtmikroskopen⁶zu beheben. Allerdings gibt es mindestens vier Nachteile, die ihre Verwendung in der Zelle biologische Studie von der Golgi erheblich einschränken können. (1) aktuelle Höchstauflösung Techniken erfordern teure und spezielle Hardwarekonfiguration ist darüber hinaus die meisten Zelle Biologie Labors. (2) spezielle Fluoreszenz Kennzeichnung Protokolle sind für einige super-Resolution-Techniken erforderlich. (3) Obwohl diese Techniken unter dem besten Zustand, 20-110 nm in räumlicher Auflösung beanspruchen, kann die praktische Auflösung in realen Proben erhalten viel schlimmer sein. (4) im Vergleich zu konventionellen Mikroskopie diese super-Resolution-Techniken noch haben Schwierigkeiten bei der Durchführung von mehrfarbigen, 3D oder live Cell imaging, entweder einzeln oder in Kombination. Wahrscheinlich führen vor allem Immuno-Gold-EM und die Höchstauflösung Mikroskopiertechniken qualitative statt quantitative Lokalisierungsdaten.

Versuch, teilweise oben genannten Probleme zu lösen, haben wir vor kurzem eine konventionelle Lichtmikroskopie basierte Methode entwickelt benannt Golgi Protein Lokalisierung von imaging Center der Masse (GLIM), systematisch und quantitativ ein Golgi lokalisieren Protein mit einer Auflösung entspricht dem von der Immuno-Gold EM-⁷. Bei dieser Methode ist die Golgi in kultivierten Säugerzellen als Golgi Mini-Stapel durch die Behandlung von Nocodazole, ein depolymerizing Medikament Mikrotubuli verstreut. Umfangreiche Studien haben gezeigt, dass Nocodazole-induzierten Golgi Mini-Stacks (im folgenden Golgi Mini-Stacks) native Golgi-Stapel in Organisation und Zellfunktionen^{8,9,10ähneln, 11}. Die Lokalisierung Quotient (LQ) eines Test-Proteins durch GLIM erworben werden kann und es bezeichnet die quantitative Sub-Golgi-Lokalisierung. Die Zahlenwerte der LQs verglichen werden können und eine LQ-Datenbank mit mehr als 25 Golgi Marker zur Verfügung gestanden hat.

Golgi Mini-Stacks sind in GLIM dreifach-Label von endogen oder exogen ausgedrückt GM130, GalT mCherry und Test-Protein (X). GM130 und GalT-mCherry, Cis- und Trans-Golgi-Marker bzw.^12,13, bieten Bezugspunkte. Die dreifache Fluoreszenz, rot (R), grün (G) und dunkelrote (B), künstlich als rot, grün und blau, beziehungsweise angezeigt. Zentrum der Fluoreszenz Masse (im folgenden Mitte) wird angenommen, um Sub-Pixel-Auflösung zu erreichen. Die Golgi-Achse ist definiert als der Vektor aus der Mitte des GM130 mit der GalT-mCherry. Die Golgi-Mini-Stack wird als eine zylindrische Struktur mit unendlichen Rotationssymmetrie um die Golgi-Achse modelliert. Daher kann ein Mini-Golgi-Stapel weiter als eine eindimensionale Struktur entlang der Golgi-Achse modelliert werden. Die LQ Test Protein X ist definiert als dX/d₁, in denen d_X der Abstand von der Mitte von x mit der GM130, ist während d₁ die Entfernung vom Zentrum GalT-mCherry mit der GM130 ist. Wenn x einfallenden liegt, wird seine Projektion axialen Abstand für die Berechnung verwendet. Die Variablen, einschließlich Golgi Achse, axiale Winkel, d_X, d₁, Winkel α und Winkel β für GLIM sind schematisch in Abbildung 1dargestellt. LQ ist unabhängig vom axialen Golgi Golgi Mini-Stacks nach dem Zufallsprinzip in eine Zelle zu orientieren.

Golgi Mini-Stacks erscheinen inhomogen in Bildern. Wir entwickelten drei Kriterien um analysierbar Golgi Mini-Stacks für GLIM auszuwählen. (1) das Signal-Rausch-Verhältnis-Kriterium, in dem das Verhältnis von die Gesamtintensität eines Golgi Mini-Stack auf die Standardabweichung (SD) des Hintergrundes ≥ 30 in jedem Kanal ist. Dieses Kriterium ist die Positioniergenauigkeit von der Mitte der Masse, die abhängig von der Signal-Rausch-Verhältnis von Golgi-Mini-Stacks. (2) die axiale Winkel oder Abstand Kriterium, wonach d₁≥ 70 nm. d₁ nimmt mit der Erhöhung des Golgi axiale Winkels. Wenn die axiale Winkel nähert sich 90° oder senkrecht, die Mini-Stack wird als d₁ nicht auflösbar nähert sich 0. d₁≥ 70 nm kann wirksam ausschließen, in der Nähe von vertikalen Golgi Mini-Stacks. (3) die co-Linearität Kriterium, in dem entweder | tan α | oder | tan β | ≤ 0,3 ist. Dieses Kriterium wird sichergestellt, dass die drei Zentren eines Mini-Stack ausreichend für unser eindimensionales Modell des Golgi Mini-Stack linear sind. Alle Lichtmikroskopen leiden chromatische Aberration, die ernsthaft die relativen Positionen der rot-, grün- und dunkelrote Fluoreszenz Zentren verzerren können. Chromatische Aberration von Mikroskopsystemen wird experimentell durch bildgebende 110 nm-Perlen, die Dreifach-gekennzeichnet durch rote, grüne und dunkelrote Fluoreszenz sind kalibriert. Für jedes Bild Perle die Mitte des roten ist definiert als die tatsächliche Position des Wulstes und chromatische Veränderungen der grünen und dunkelrote Zentren sind von erster Ordnung Polynomfunktionen ausgestattet. Zentren der Golgi Mini-Stacks unterliegen der Polynomfunktionen, die chromatische Veränderungen in grün und dunkelrote Kanäle zu korrigieren.

Durch GLIM erreichen wir eine Auflösung von ~ 30 nm entlang der Golgi-Achse unter Standardbedingungen. Wichtiger ist, bietet es eine systematische Methode um alle Golgi-Protein quantitativ abzubilden. GLIM kann durch konventionelle Mikroskope, wie z. B. Weitfeld- oder konfokale Mikroskope mit gemeinsamen Fluoreszenz Kennzeichnung Protokollen durchgeführt werden. Die Bildgebung und Datenverarbeitung können so kurz wie eine Stunde dauern. Durch GLIM, haben wir direkt bewiesen die progressiven Übergang der sekretorischen Ladung aus der Cis- Trans-Seite des Golgi-⁷.

Protokoll

Hinweis: Im folgenden ist ein Schritt für Schritt Protokoll von GLIM zur Bestimmung der LQ EGFP-Tags Tyrosylprotein Sulfotransferase 1 (TPST1), ein Golgi-resident-Enzym in HeLa-Zellen.

1. Vorbereitung der Fluoreszenz-markierten Golgi Mini-stacks

1. Glasdeckgläser vorbereiten
   1. Aliquoten 0,3 mL sterile Dulbecco geändert Adlers Medium (DMEM) zu einem Brunnen von einer 24-Well-Platte in einer Gewebekultur-Haube.
   2. Wischen Sie ein Stück Φ 12 mm No.1.5 Glas Deckglas mit weichem Tissue-Papier getupft mit 70 % Ethanol, um Ablagerungen auf der Oberfläche von Glas-Deckglas zu entfernen. Verwenden Sie ein paar scharfe Pinzette, um kurz das Deckglas in 70 % igem Ethanol einweichen, in der 24-Well-Platte übertragen und es auf den Boden gut mit sterilen DMEM sinken.
      Hinweis: Glasdeckgläser sind konventionell durch Abflammen sterilisiert. Jedoch riss Deckgläsern unter einer solchen Behandlung leicht beim anschließend handling. 70 % Ethanol Einweichen ist wirksam bei der Sterilisierung von Glasdeckgläser ohne sie zu beschädigen.
   3. Verlassen Sie mit dem Deckel abgedeckt die 24-Well-Platte in das 37 ° C CO₂ Inkubator bis zur Verwendung.
2. Samenzellen
   1. Kultur-HeLa-Zellen (im folgenden Zellen) in einem t-25 Kolben in DMEM mit 10 % ergänzt fetalen Bovine Serum (FBS) (im folgenden kompletten Medium) in einem 37 ° C CO₂ Inkubator mit 5 % CO₂geliefert. Antibiotika sind nicht notwendig.
   2. Wenn Zellen erreichen ~ 80 % Konfluenz Aspirieren das Kulturmedium. Hinzufügen von 0,25 % 1 mL Trypsin-EDTA in den Kolben und inkubieren Sie die Zellen in einem 37 ° C CO₂ Inkubator für komplette mittlere und 2 min. Add 1 mL in die Flasche und sanft spülen die Zellen von der Küvette Wand durch pipettieren.
   3. Übertragen Sie freistehende Zellen auf eine sterile Zentrifugation Rohr und Spin bei 500 X g für 2 min, pellet-Zellen. Aspirieren des Überstands und hängen Sie die Zelle Pellet in 1 mL komplette Medium.
   4. Aspirieren Sie das Medium in den Brunnen des 24-Well-Platte mit den sterilisierten Glas Deckglas und Samen ~ 1 x 10-⁵ -Zellen in den Brunnen. Das Volumen des Brunnens mit kompletten Medium bis 0,5 mL auffüllen. Brüten Sie in einem 37 ° C CO₂ Inkubator mit 5 % CO₂geliefert. Kulturzellen, ~ 80 % Konfluenz.
3. Zellen zu transfizieren
   Hinweis: Gespreitete Zellen sind vorteilhaft für imaging verteilten Golgi Mini-Stacks.
   1. Transfizieren ~ 80 % konfluierende Zellen mit 80 ng GalT-mCherry-⁷ und 320 ng TPST1-EGFP (siehe Tabelle der Materialien) DNA Plasmide mit einem Transfection Reagens gemäß dem Protokoll des Herstellers. In einem 37 ° C CO₂ Inkubator inkubieren. Verändern Sie das Medium nach 4-6 h Inkubation. Die Zellen sind bereit ~ 12 h später.
4. Nocodazole Behandlung, Golgi Mini-Stacks zu generieren
   1. Bereiten Sie eine Nocodazole-Stammlösung (33 mM) durch Auflösen von 10 mg Nocodazole Pulver in 1 mL Dimethyl Sulfoxid. Aliquoten Vorratslösung und Store bei-20 ° C für langfristige Lagerung.
   2. Verdünnen Sie 1 µL Nocodazole-Stammlösung (33 mM) in 1 mL 37 ° C komplette Medium (Endkonzentration 33 µM). Zentrifugieren Sie bei Höchstgeschwindigkeit um Partikel zu entfernen.
   3. Aspirieren Sie das Medium in den Brunnen und 0,5 mL 33 µM Nocodazole mit kompletten Medium. Inkubieren Sie die Zellen in einem 37 ° C CO₂ Inkubator für 3 h fortfahren, Immunfluoreszenz Kennzeichnung (Abschnitt 1.5).
5. Immunfluoreszenz Kennzeichnung
   Hinweis: Bewahren Sie Zellen im Dunkeln Immunofluoreszenz GalT-mCherry und TPST1-EGFP zu vermeiden.
   1. Reagenzien für die Immunfluoreszenz Kennzeichnung vorbereiten
      1. Um 4 % Paraformaldehyd Lösung vorzubereiten, 4 % (w/V) Paraformaldehyd Pulver in heißem 1 X Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) auflösen und die Lösung durch 0,45 µm-Filter filtern. Die Lösung kann bei-20 ° c aufbewahrt werden
         Vorsicht: Paraformaldehyd ist giftig und karzinogen und es kann Hautreizungen verursachen. Tragen Sie geeigneten persönlichen Schutzausrüstung (PSA).
      2. Um Fluoreszenz Verdünnungspuffer (FDB) vorzubereiten, mischen Sie 5 % (V/V) FBS und 2 % (w/V) Rinderserumalbumin (BSA) in 1 X PBS. Filtern Sie die Lösung durch 0,45 µm-Filter und speichern Sie die Lösung bei-20 ° C.
      3. Auflösen von 5,35 g NH₄Cl Pulver in 1 L Wasser um 100 mM NH₄Cl vorzubereiten und die Lösung bei Raumtemperatur lagern.
      4. Auflösen von 10 % (w/V) Saponin Pulver in Wasser 10 % Saponin, aliquoten vorbereiten und speichern die Lösung bei-20 ° C.
   2. Fixierung
      1. Spülen Sie gut einmal mit 0,5 mL 1 x PBS-Lösung und fügen Sie 0,5 mL 4 % Paraformaldehyd Lösung hinzu. 20 min bei Raumtemperatur inkubieren. Spülen Sie nun zweimal mit 0,5 mL 1 X PBS und zweimal mit 0,5 mL 100 mM NH₄Kl. Spülen den Brunnen zweimal mit 0,5 mL 1 X PBS. Zellen können mit 1 X PBS-Puffer bei 4 ° C über Nacht im Dunkeln gehalten werden.
   3. Kennzeichnung der Fluoreszenz
      1. Verdünnen Sie 1 µL Maus Anti-GM130 Primärantikörper in 500 µL FDB mit 0,1 % Saponin. Kehren Sie den Deckel des 24-Well-Platte und 10 µL Primärantikörper Mischung auf den Deckel.
      2. Verwenden Sie scharfe Pinzette zum Extrahieren und übertragen der Glas-Deckglas auf der Tropfen Antikörper Mischung zu gewährleisten, den die Zelle Seite in Kontakt mit der Mischung ist. Inkubieren Sie die Zellen mit der primären Antikörper-Mischung für 1 h bei Raumtemperatur.
         Hinweis: Der Deckel mit dem Deckglas kann in einer befeuchteten Plastiktüte im Dunkeln platziert werden.
      3. Verwenden Sie ein paar scharfe Pinzette zu extrahieren und übertragen das Deckglas auf den Brunnen mit der Zelle-Seite auf und spülen ihn mit 0,5 mL 1 X PBS-Puffer für dreimal in ≥ 30 min. Schütteln ist nicht notwendig.
      4. Verdünnen Sie 1 µL dunkelrote Fluorophor konjugierten Ziege Anti-Maus IgG (Sekundärantikörper) in 500 µL FDB mit 0,1 % Saponin.
      5. Waschen Sie und reinigen Sie die umgekehrte Oberfläche des Deckels von der 24-Well-Platte. Wenden Sie 10 µL dunkelrote Sekundärantikörper Mischung auf den Deckel. Wiederholen Sie die Schritte 1.5.3.2 - 1.5.3.3.
   4. Montage
      1. Bereiten Sie das Eindeckmittel durch Mischen von 1 g Glycerin, 2,2 g Poly(vinyl alcohol) (MW ~ 31.000 Da), 1,2 mL 1 M Tris (pH 8) und 8,8 mL H₂O. lösen sich die Mischung in einem 60 ° C-Wasserbad mit gelegentlich aufschütteln. Speichern Sie die Lösung bei-20 ° C.
      2. Tauen Sie das Eindeckmittel und übertragen Sie 10 µL auf einen Objektträger. Überlagern Sie das Deckglas (Zelle Seite nach unten) auf den Tropfen Eindeckmittel. Inkubieren Sie die Objektträger bei 37 ° C für 30 Minuten oder 1 h das Eindeckmittel Härten bei Raumtemperatur. Versiegeln Sie das Deckglas mit farblosen Nagellack und speichern Sie die Objektträger bei-20 ° C.

2. Vorbereitung des fluoreszierenden Perlen für chromatische Schaltkorrektur

1. Deckglas Reinigung
   1. Legen Sie vorsichtig ein Stück 25 mm No.1.5 Glas Deckglas auf einem Kunststoff-Rack.
   2. Übertragung der Rack mit dem Deckglas auf eine 400 mL-Becherglas gefüllt mit 300 mL 1 M NaOH und beschallen in einem Bad Sonikator (35 Watt) für 15 min. kurz spülen das Rack in eine 400 mL-Becherglas mit 300 mL entionisiertem Wasser gefüllt. Übertragen Sie das Rack auf eine 400 mL-Becherglas gefüllt mit 300 mL 99 % Ethanol und beschallen in Bad Sonikator für 15 min. kurz spülen das Rack in eine 400 mL-Becherglas mit 300 mL entionisiertem Wasser gefüllt.
   3. Wiederholen Sie Schritt 2.1.2 zwei weitere Male.
   4. Spülen Sie dem Gestell mit dem Deckglas in 300 mL entionisiertem Wasser in eine 400 mL-Becherglas für 10 min. wiederholen den Schritt zwei weitere Male. Übertragen Sie das Rack auf einem 60 ° C Ofen und trocknen Sie das Deckglas für 1 h Laden der getrockneten Deckglas in einer Petrischale staubfrei.
2. Immobilisierung von fluoreszierenden Perlen auf der Glas-Deckglas
   1. 110 nm Multi-Color fluoreszierenden Perlen 80-fold-in-1 x PBS mit 0,1 µg/µL BSA zu verdünnen. Kurz Wirbel das Rohr Wulst Aggregate zu zerstreuen. Verbreiten von 60 µL verdünnt Perlen auf den gereinigten Φ 25 mm No.1.5 Glas Deckglas (siehe Abschnitt 2.1) mit einer Pipettenspitze. Trocknen Sie das Deckglas in den Exsikkator gestellt, verbunden mit einer Vakuumpumpe im Dunkeln und montieren das Deckglas auf einem Objektträger in 50 µL Eindeckmedium (siehe Schritt 1.5.4.2).

3. die Bildaufnahme

Hinweis: GLIM erfordert Bilder von hohen Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) für hohe Präzision der Massenmittelpunkt Berechnung. Das Bild kann vom konventionellen Mikroskopen wie die Laser-scanning-konfokale, Spinning Disk konfokale oder Weitfeld-Mikroskop aufgenommen. Weitfeld-Mikroskop mit Plan-apochromatische Objektive und ein geringes Rauschen-Bildsensor ausgestattet, wie z. B. ein Charge - Coupled Device (CCD) und wissenschaftliche ergänzende Metall-Oxid-Halbleiter (sCMOS) verwendet werden können. Parameter für den Bildsensor werden angepasst, um einen niedrigen lesen-Lärm und hohen Dynamikumfang sorgen. Das Mikroskop mit der optimalen Konfiguration der Fluoreszenz-Filter für Grün, mCherry und dunkelrote Fluorophor ausgestattet werden muss, und es müssen vernachlässigbar Fluoreszenz Übersprechen. Im Idealfall die imaging-System erreicht eine Nyquist Sampling-Rate in der x-, y- und Z-Achse, die in der Regel erfordert die X, y und Z Größe ein Voxel zu weniger als 100, 100 und 200 nm, beziehungsweise. Die x- und y Größe der Voxel sind immer gleich und werden als Pixel_size bezeichnet. Die Pixel_size kann berechnet werden, indem man die Sensorgröße der Kamera durch die System-Vergrößerung.

1. Bild mehrfarbige Perlen
   1. Bild mehrfarbige Perlen in grün, rot und dunkelrote Kanäle zu Beginn und am Ende jeder bildgebenden Sitzung.
      Hinweis: Hier wurden Bilder mit einem konventionellen Weitfeld-Epi-Fluoreszenz-Mikroskop (invertiert) 100 X NA 1.4 Plan-apochromatische Objektive, motorisierte Bühne, 200 Watt Metall-Halogenid-Lichtquelle und 16-Bit sCMOS Kamera ausgestattet erworben. Die Wellenlängen für Erregung (Bandpass), dichroitische Spiegel (langen Pass) und Emission Filter (Bandpass) des grünen Kanals Filter Cubes sind 465-495, 505 und 515-555 nm; für den Rot-Kanal Filter Cube sind 528-553, 565 und 578-633 nm; und das für die dunkelrote Kanal Filter Cube sind 590-650, 660 und 663-738 nm. Während der Akquisition, die Größe des ein Voxel entlang der x-, ist y- und Z-Achse 64, 64 und 200 nm, bzw..
   2. Finden Sie eine Sichtfeld mit gute Perle Dichte.
   3. 3D Bild-Stacks in grün, rot und dunkelrote Kanäle (Kanal_G, Kanal_R, Kanal_B, beziehungsweise) zu erwerben. Nehmen Sie 3 Abschnitte oberhalb und unterhalb der besten Brennebene (7 Abschnitte pro Stapel). Speichern Sie die drei Stacks als drei TIFF-Dateien.
      Hinweis: Die Belichtungszeit für jeden Kanal wird empirisch bestimmt den Dynamikbereich, Pixel-Sättigung zu vermeiden und möglichst gering Immunofluoreszenz. Andere Parameter wie Filter und die X, y und Z Größe der Voxel werden ausgewählt, wie oben beschrieben.
2. Bild Golgi Mini-stacks
   1. Einsatz TPST1-EGFP und GalT-mCherry transfiziert und Gewebekulturen beschriftet (Abschnitt 1.5) Folien, Zellen, dass ausdrückliche TPST1-EGFP und einer niedrigen oder mittleren Ebene GalT-mCherry zu finden. 3D-Bild Stapel zu erwerben, wie in Schritt 3.1.3 beschrieben.

(4) Bildanalyse

1. Zentren der fluoreszierenden Perlen zu erwerben
   1. In ImageJ, eine Reihe von Perle Bilder bestehend aus drei TIFF-Dateien zu öffnen (Datei > Bild > öffnen).
   2. Durchschnittlich 3 aufeinanderfolgende Abschnitte um den besten fokussierte Abschnitt im Kanal_R Bild > Stacks > Z Projekt. Geben Sie die Abschnittsnummer des "Start-Scheibe" und "Stop-Scheibe", und wählen Sie unter Optionen "Projektion Typ", "Mittlerer Intensität".
   3. Zeichnen Sie Regionen von Interesse (ROIs), die keine Perlen im Bild mit "Polygon-Selektionen" enthalten. In "Analyze > Set Messungen", nur "Graue Mittelwert" und "Standardabweichung" zu überprüfen. Führen Sie dann "Analyze > Messen" bedeuten und SD des ROI zu erhalten.
   4. Berechnen Sie die Hintergrundintensität als "mittlere + 6 × SD"_. Ziehen Sie das Bild mit den entsprechenden Hintergrund Intensitätswerte durch "Prozess > Mathematik > subtrahieren", geben Sie den Hintergrund Intensitätswert entspricht diesen Kanal.
   5. Wiederholen Sie die Schritte 4.1.2, 4.1.4 für Kanal_G und Kanal_B Bild Stacks mithilfe des gleichen Start und stop Scheibe und den gleichen Hintergrund ROI. Notiz, die der ROI im Schritt 4.1.3 verwendet kann auf Kanal_G und Kanal_B Bilder_. kopiert werden
   6. Verschmelzen die drei Bilder Hintergrund subtrahiert (Bild > Farbe > Kanäle zusammenfügen) wählen Sie Channel_R rot, Kanal_G grün und Kanal_B blau. Ein einzelnes zusammengesetztes Bild bestehend aus drei Kanäle erhalten.
   7. Starten Sie den ROI-Manager (Analyze > Tools > ROI-Manager). Zeichnen Sie einen Quadrat ROI um einzelne Perlen, die sicherstellen, dass es nur eine Perle innerhalb jedes ROI. Fügen Sie den ROI ROI-Manager durch Drücken der Taste "t" auf der Tastatur. Wiederholen Sie diesen Vorgang, und fügen Sie so viele ROIs wie möglich.
   8. In "Analyze > Set Messungen", nur "Mitte der Masse" zu überprüfen.
   9. Wählen Sie Kanal_R, im ROI-Manager, klicken Sie auf "Messen" zu Zentren; zwei Spalten für x und y Koordinate der Zentren des ROIs im Fenster "Ergebnis" angezeigt. Kopieren Sie und fügen Sie die beiden Spalten in einer Tabelle.
   10. Wiederholen Sie Schritt 4.1.9 für_G und Kanal_B.
   11. Koordinaten der Zentren in einer einzigen Tabelle in der folgenden Reihenfolge ordnen: x_R,_R, y x_G, y_G, x_B, und y_B. Speichern Sie die Tabelle im Format "CSV" als "beads.csv". Leerzeichen Sie keine im Dateinamen.
2. Wählen Sie und Messen Sie Golgi Mini-stacks
   1. Installieren Sie zwei Makros (im Anhang in Zusatzmaterialien) in ImageJ, "Makro-Golgi ROI Inspektion" und "Makro-3 Kanäle Ausgangsdaten" durch Plugins > installieren ". Klar ROI-Manager und Fenster "Ergebnis".
   2. Eine Reihe von Golgi Mini-Stapel Bilder, bestehend aus drei TIFF-Dateien zu öffnen (Datei > Bild > Open).
   3. Wiederholen Sie die Schritte 4.1.2 - 4.1.5 und speichern Sie drei Hintergrund subtrahiert Bilder für die spätere Verwendung. Datensatz Hintergrund SDs für Kanal_R,_G und_B Kanal als SD_R, SD_G und SD_B, bzw. später für verwenden.
   4. Duplizieren Sie die drei Hintergrund subtrahiert Bilder generiert aus Schritt 4.2.3 (Strg + Shift + D).
   5. Im "Prozess > Bildrechner", zuerst hinzufügen den Hintergrund subtrahiert Kanal_G Kanal_R Bilder. Dem Hintergrund subtrahiert Kanal_B Bild das resultierende Bild hinzufügen. Das resultierende Bild in "Bild > anpassen > Schwelle", wählen Sie "set", "1" als "Niedrigste Schwellenwert" einzugeben. Nach dem Drücken von "Übernehmen", ist ein schwarz / weißes binäres Bild gebracht.
   6. In "Analyze > Partikel zu analysieren", geben Sie den Größenbereich für "Größe (Pixel ^ 2)". Geben Sie "50-Unendlichkeit". Überprüfen Sie "Ausgenommen an Kanten" und "Hinzufügen zum Manager". ROIs mit Golgi Mini-Stacks werden nun die ROI-Manager hinzugefügt.
      Hinweis: Der Größenbereich muss empirisch ermittelt werden, Geräusche auszuschließen, die in der Regel klein sind.
   7. Verschmelzen die drei Bilder Hintergrund subtrahiert (Bild > Farbe > Kanäle zusammenfügen) aus 4.2.3 Schritt wählen Sie Channel_R rot, Kanal_G grün und Kanal_B blau. Ein einzelnes zusammengesetztes Bild bestehend aus drei Kanälen wird generiert.
   8. Führen Sie das Makro "Makro-Golgi ROI Prüfung" durch die Auswahl "Plugins > Makro-Golgi ROI Inspektion". Überprüfen Sie im interaktiven Dialogfeld jedes ROI zu halten oder ihn ablehnen. Wählen Sie ROIs, die ein einzelnes Objekt in allen drei Kanälen enthalten.
      Hinweis: Nachdem Sie dieses Tool ausführen, werden abgelehnte ROIs aus dem ROI-Manager eliminiert.
   9. Nur "Area", "Mittlere Grauwert" und "Massenmittelpunkt" Einchecken "Analyze > Set Messungen". Daten durch die Einführung der Makro-Tool "Makro-Ausgabedaten 3 Kanäle" zu erwerben (Plugins > Makro-Ausgang 3 Kanäle Daten).
      Hinweis: Bereiche, mittlere Intensitäten und Zentren (X und y) des ROIs in Kanal_R,_G -Kanal und Kanal_B werden im Fenster "Ergebnis" angezeigt.
   10. Kopie x und y Koordinaten zentriert in einer Tabelle und ordnen sie in der folgenden Reihenfolge: x_R,_R, y x_G, y_G, x_B, und y_B. Speichern Sie die Kalkulationstabelle als ".csv" Datei (MinistacksCSV). Leerzeichen Sie keine im Dateinamen. Fahren Sie mit chromatischen Schaltkorrektur der Zentren (Abschnitt 4.3) und LQ-Berechnung (Abschnitt 4.4).
3. Chromatische Schaltkorrektur der Zentren
   1. Matlab Compiler Laufzeit (MCR) zu installieren.
   2. Installieren Sie die folgenden Dateien in einem speziellen Arbeitsordner: my_train.exe und my_test.exe. Kopieren und Einfügen von "beads.csv" und"Ministacks.csv" Dateien im selben Ordner.
   3. Starten Sie "Eingabeaufforderung" von Windows und gehen in den Arbeitsordner durch Eingabe des folgenden Befehls " cd Path_of_working_folder".
   4. Generieren Sie eine chromatische Verschiebung Kalibrierdatei mithilfe von Zentren der Perlen. Geben Sie den folgenden Befehl "my_train.exe Perlen.csv Kalibrierung.mat 1". Eine Datei namens"Kalibrierung.mat" wird in den Arbeitsordner erstellt. Ignorieren Sie andere Dateien, die generiert werden.
   5. Die chromatische Verschiebung der Zentren der Golgi Mini-Stacks zu korrigieren, indem Sie den folgenden Befehl ein "my_test.exe MinistacksCSV Corrected_ministacksCSV Kalibrierung.mat 1" eingeben.
      Hinweis: Eine Datei namens"Corrected_ministacks.csv" wird in den Arbeitsordner erstellt. Es enthält chromatische-Shift korrigierte Koordinaten der Zentren, die in der Reihenfolge von x_G,_G, y x_B und y_Bangeordnet sind. Ignorieren Sie andere Dateien, die erstellt werden. Nehmen Sie zur Kenntnis, die der rote-Kanal als definiert ist frei von chromatische Aberration und daher X_F und y_R sind identisch mit raw-Daten.
4. Berechnung der LQs
   1. Starten Sie die Software zur Datenanalyse und kopieren und einfügen, in der unter Sequenz, meine Grauwerte, Bereichen, Hintergrund SDs Schritt 4.2.3 entnommen (legen Sie sie in Zeile 1) und chromatische Verschiebung korrigiert x und y Koordinaten der Golgi-Mini-Stacks in Kanal_R in eine Arbeitsblatt als Spalten A bis E. In ähnlicher Weise Datenübertragung entsprechende für_G und Kanal_B Spalten F bis J und K, O, beziehungsweise.
   2. Fügen Sie acht neue Spalten P hinzu, W, benannt "integrierte Intensität der Kanal R", "integrierte Intensität der Kanal G", "integrierte Intensität von Kanal B", d1, Dx, ABS(tan a), ABS (Tan b) und LQ.
      1. Die oben in der jeweiligen Spalte einen Rechtsklick und wählen Sie "Set Spaltenwerten" zur Berechnung der Werte der einzelnen Spalten. Geben Sie für Spalte P "Col(A)Col(B)"; Geben Sie für Spalte Q "Col(F)Col(G)"; Geben Sie für Spalte R "Col(K)Col(L)"; Eingang für Spalte S, "pixel_size*Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))" wo "Pixel_size" die Größe der Pixel in nm ist; Eingang für Spalte T, "pixel_size*((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2)/(2Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O)))"; Eingang für Spalte U, "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2) / (2 Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) ";" Eingang für Spalte V, "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2) / (2 Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) ";" für Spalte W, Eingang "Col (T) / Col (S)".
   3. Filtern Sie die Golgi-Mini-Stacks durch die drei Kriterien, die in der Einführungbeschrieben.
      1. In der Datenanalyse-Software, gehen Sie zu "Arbeitsblatt > Arbeitsblatt Abfrage" und wählen Sie Spalte Variablen für "If"-Test. Ordnen Sie die folgenden Aliase I1, I2, I3, d1, A und B für die Spalten "integrierte Intensität der Kanal R", "integrierte Intensität der Kanal G", "integrierte Intensität von Kanal B", d1, ABS(tan a) und ABS (Tan b), beziehungsweise. In der "Wenn Bedingung" Feld, geben Sie "I1 > =30*cell(1,3) und I2 > =30*cell(1,8) und I3 > =30*cell(1,13) und d1 > = 70 und (A < = 0,3 oder B < = 0,3)".
      2. Wählen Sie "Extrahieren, neues Arbeitsblatt", klicken Sie auf "Übernehmen". Spalten A-W analysierbar Golgi Mini-Stacks sind in ein neues Arbeitsblatt extrahiert.
   4. In das neue Arbeitsblatt Rechtsklick oben in der Spalte W, wählen Sie "Statistiken über Spalte > Dialogfeld" öffnen "". Check "N Total", "Mittel", "SE bedeuten", "Histogramme". Die statistische Auswertung der LQs wird dann angezeigt.

Ergebnisse

Die moderne Forschung Grade Lichtmikroskop ausgestattet mit einem Plan apochromatische Objektiv, wie verwendet in unserem Labor zeigt minimale chromatische Aberration (Abbildung 2A). Eine sorgfältige Prüfung der fluoreszierenden Perlen Multi-Color-Bild zeigen jedoch die Verlagerung der verschiedenen farbige Bilder von der gleichen Wulst (Abbildung 2B). Wir definieren, dass der rote Kanal frei v...

Diskussion

Die Lokalisation eines Proteins Golgi unter der Lichtmikroskopie war bisher vor allem durch den Grad der Korrelation oder Überlappung des Bildes des Proteins mit dem Bild einer Golgi-Markierung von bekannten Lokalisierung^{15,16quantifiziert, 17}. Resultierende Korrelation oder überlappende Koeffizient spiegelt wider, wie nah das Test-Protein die Golgi-Marker räumlich ist. Es gibt mindestens drei Einschränkungen für diesen An...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads	Invitrogen	T7279	As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope.
Glass coverslip Φ 12 mm (No. 1.5)	Menzel	CB00120RAC
Glass coverslip Φ 25 mm (No. 1.5)	Menzel
DMEM	Capricon	DMEM-HPA-P50
Trypsin-EDTA
FBS	GE Hyclone	SV30160.03
Nocodazole	Merck	487928
transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019
transfection medium. Commercial name: OptiMEM	Invitrogen	31985070
TPST1-EGFP	Addgene	66617	A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom)
GalT-mCherry			Made in our lab.
paraformaldehyde	Merck	1.04005.1000
saponin	Sigma-Aldrich	47036
poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488	CALBIOCHEM	475904
BSA	Sigma-Aldrich	A9647
Mouse anti-GM130	BD Biosciences	610823	Primary antibody for human GM130
far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG	Invitrogen	A-21235	Far red fluorescence conjugated secondary antibody