JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Точная локализация Гольджи жителей имеет важное значение для понимания клеточных функций Гольджи. Однако не удалось разрешить суб Гольджи структуры обычных оптической микроскопии. Здесь мы описываем протокол для обычных микроскопии основанные метода суперразрешением количественно определить суб Гольджи локализация белка.

Аннотация

Комплекс Гольджи состоит из межклеточная серийно сложены мембраны, которые могут быть далее разделены на суб Гольджи регионы, включая СНГ-Гольджи, медиальной Гольджи, транс-Гольджи и транс-Гольджи сети. Клеточных функций Гольджи определяется характерное распределение его резидентов белков. Пространственное разрешение обычных световой микроскопии слишком мала, чтобы разрешить суб Гольджи структуры или межклеточная. Таким образом электронная микроскопия иммуно золото является методом выбора для локализации белков на уровне суб Гольджи. Однако техника и инструмент выходят за рамки возможностей большинства лаборатории биологии клетки. Здесь мы описываем наш недавно разработанных суперразрешением метод, вызываемый Гольджи белка локализации изображений центры масс (GLIM) систематически и количественно локализовать Гольджи белка. GLIM основана на стандартных флуоресценции маркировки протоколы и обычных-поля или конфокальные микроскопы. Она включает в себя калибровка хроматической сдвига аберрации микроскопические системы, загрузки изображений и анализа после приобретения. Суб Гольджи локализация белка тест количественно выражается как фактор локализации. Существует четыре основных преимущества GLIM; Это быстрый, основанные на традиционных методов и инструментов, в результате локализацией количественных, и он дает ~ 30 Нм практические резолюции вдоль оси Гольджи. Здесь мы описываем подробный протокол GLIM для локализации тест Гольджи белка.

Введение

Комплекс Гольджи играет существенную роль в секреторную/endocytic людьми из белков и липидов (далее грузов) в mammalian клетках1,2,3. В Гольджи грузов являются не только отсортированы по различным субклеточном отсеков, но также изменены различные виды гликозилирования. Млекопитающих Гольджи комплекс включает в себя многочисленные боково связанные стеки Гольджи, который обычно состоит из 4-11 плотно прилегающие и плоские мембраны мешков называемые межклеточная. Серийно сложены межклеточная Гольджи далее подразделяются, от одного конца до другого, как СНГ, медиальной и транс-межклеточная. На транс-боковые стека Гольджи, транс-большинство мембраны мешок превращается в трубчатых и ретикулум мембраны сеть под названием транс-Гольджи сети (TGN)4. В секреторную путь, грузов, полученных от эндоплазменный ретикулум (ER) введите Гольджи стека в СНГ-стороне и затем последовательно проходят через медиальной и транс-межклеточная. Грузов в конечном итоге выход Golgi в транс-Гольджи или TGN предназначения в плазматической мембране, endosomes или секреторных гранул.

Молекулярных и клеточных механизмов как грузов транзита Гольджи стека и как Гольджи сохраняет свою cisternal Организации остаются загадочными и в настоящее время все еще горячие дебаты1. Одна из трудностей в этой области является, что Гольджи межклеточная могут быть решены только при электронной микроскопии (EM) со времени принятия резолюции оптический микроскоп (~ 200 Нм) является недостаточным для решения индивидуальных Гольджи межклеточная (< 100 Нм в обоих cisternal толщины и расстояние). Таким образом суб Гольджи локализации-резидентов белков и транзитных грузов, условно определяются EM иммуно золото. Однако EM иммуно золото очень технически сложных и это выходит за рамки возможностей большинства лаборатории биологии клетки. Хотя резолюции EM может быть югу нанометров, резолюции, обеспечиваемой EM иммуно золото значительно затрудняется размер антител комплекса (основной плюс вторичное антитело) и золотые частицы, и он может быть хуже, чем 20 Нм. Кроме того EM изображения получаются из 2D тонких секций вместо 3D глобальное представление Гольджи, который может привести к ошибочным выводам в зависимости от относительной позиции и ориентации 2D раздела5. Например изучая EM односекционный способна надежно дифференцировать везикул от ортогональных мнению трубочку, так как оба может отображать одинаковых круглых мембраны профили. Недавнее появление суперразрешением микроскопии методы, такие как 3D-структурированных освещения микроскопии (3D-SIM), стимулировали выбросов истощения (интереса), photoactivated локализации микроскопии (PALM) и стохастические оптических реконструкции микроскопии ( Шторм), делает возможным решить суб Гольджи структуры под легкие Микроскопы6. Однако есть по крайней мере четыре недостатки, которые могут значительно ограничить их использование в изучении биологических клеток Гольджи. 1) текущего суперразрешением методы требуют дорогих и специальные аппаратной конфигурации, которая выходит за рамки большинства лаборатории биологии клетки. 2) специальные флуоресценции маркировки протоколы необходимы для некоторых методов суперразрешением. 3) хотя, в лучших условиях, эти методы утверждают 20-110 Нм в пространственным разрешением, практические резолюции, полученные в реальных образцов может быть гораздо хуже. 4) в сравнении с обычными микроскопии эти супер-резолюции методы по-прежнему испытывают трудности в проведении многоцветная, 3D или жить клеток изображений, поодиночке или в сочетании. Наверное самое главное, иммуно золото EM и методы микроскопии суперразрешением выход качественных вместо количественных локализации данных.

Попытке частично решить проблемы, упомянутые выше, мы недавно разработали обычной световой микроскопии основанные метод, который называется Гольджи белка локализации изображения центры масс (GLIM), систематически и количественно локализовать Golgi белка с разрешением эквивалентна иммуно золото EM7. В этом методе Гольджи культивируемых клеток млекопитающих рассеивается как Гольджи мини стеки, лечение Нокодазол, микротрубочки depolymerizing наркотиков. Обширные исследования показали, что Нокодазол индуцированной Гольджи мини стеки (далее мини стеки Гольджи) напоминают родной Гольджи стеки в Организации и клеточных функций8,9,10, 11. Локализации (LQ) частное от деления теста белка могут быть приобретены через GLIM и он обозначает количественные суб Гольджи локализации. Численные значения LQs можно сравнить и LQ базы данных более чем 25 Гольджи маркеров была доступна.

В GLIM Гольджи мини стеки, тройной меченых эндогенного или экзогенно выраженной GM130, Галт mCherry и тест белка (x). GM130 и Галт mCherry, СНГ- и транс-Гольджи маркеры соответственно12,13, предоставления ориентиры. Тройной флуоресценции, красный (R), зеленый (G) и far-red (B), искусственно отображаются как красный, зеленый и синий, соответственно. Центр флуоресценции массы (далее центр) принимается для достижения субпиксельной резолюции. Гольджи оси определяется как вектор от центра GM130, Галт mCherry. Мини-стек Гольджи моделируется как цилиндрические структуры с бесконечной вращательная симметрия вокруг оси Гольджи. Таким образом Гольджи мини-стек может моделироваться далее как одномерные структуры вдоль оси Гольджи. Альбумин белка тест x определяется как dx/d1, в котором dx — это расстояние от центра x, GM130, в то время как d1 представляет собой расстояние от центра Галт mCherry, GM130. Если центр x-оси, его осевое расстояние проекции используется для вычисления. Переменные, включая Гольджи оси, осевой угол, dx, д1, угол α и β угол, для GLIM схематически показан на рисунке 1. LQ независима от Golgi осевой угол хотя Гольджи мини стеки Ориент случайно в клетке.

Гольджи мини-стеки неоднородных в изображениях. Мы разработали три критерия для выбора анализируемые Гольджи мини стеки для GLIM. 1) отношение сигнал шум критерий, в котором отношение общей интенсивности Гольджи мини-стек стандартное отклонение (SD) фона составляет ≥ 30 в каждом канале. Этот критерий является обеспечить точность позиционирования центра масс, которая зависит от соотношения сигнал шум Гольджи мини-стеков. 2 осевой угол или расстояние критерий, который требует d1≥ 70 нм. d1 уменьшается с увеличением угла осевой Гольджи. При осевом угол приближается к 90° или вертикальные, Мини-стек становится неразрешимым как d1 приближается к 0. d1≥ 70 нм можно эффективно исключить вблизи вертикальных Гольджи мини стеки. 3) в которых либо co линейность критерий | загар α | или | загар β | Это ≤ 0,3. Этот критерий гарантирует, что трех центров мини-стек достаточно co линейная для нашего одномерной модели мини-стек Гольджи. Все легкие Микроскопы страдают от хроматические аберрации, которые могут серьезно исказить относительные позиции флуоресценции красного, зеленого и far-red центров. Хроматическая аберрация Микроскоп систем экспериментально Калибровка изображения 110 Нм бусы, которые обозначены тройной флуоресценции красного, зеленого и far-red. Для каждого изображения из бисера центр Красного определяется как истинное положение шарик и хроматические смены зеленого и far-red центры оснащены первого порядка полиномиальных функций. Центры Гольджи мини стеки подвергаются полиномиальных функций исправить хроматические сдвиги в зеленых и far-red каналы.

Через GLIM мы можем достичь урегулирования ~ 30 Нм вдоль оси Golgi в стандартных условиях. Важно то, что он предоставляет системный метод количественно сопоставить любой белок Гольджи. GLIM могут выполняться с обычными Микроскопы, например поля или конфокальные микроскопы, используя общие протоколы Маркировка флуоресцирования. Визуализация и обработка данных может занять как час короче. Через GLIM, мы непосредственно продемонстрировали прогрессивного перехода секреторной грузов из стран СНГ- транс-стороне Гольджи7.

протокол

Примечание: Ниже приводится пошаговое протокол GLIM для определения отмеченных LQ EGFP tyrosylprotein sulfotransferase 1 (TPST1), Golgi-резидентов фермента, в клетки HeLa.

1. Подготовка флуоресцировани обозначенного Гольджи мини стеки

  1. Подготовка стекла coverslips
    1. Аликвота 0,3 мл стерильного Дульбекко изменение орла среднего (DMEM) хорошо 24-ну плиты в культуре ткани капюшоном.
    2. Протрите кусочком Φ 12 мм No.1.5 стеклянные coverslip использованием мягкой оберточной бумаги вонзилась с 70% этанол, чтобы удалить мусор на поверхности стекла coverslip. Используйте пинцет острый кратко замочить coverslip в 70% этиловом спирте, передать его в пластину 24-Ну и затопить его к нижней части хорошо содержащие стерильные DMEM.
      Примечание: Условно стекла coverslips стерилизуются, пылающий. Однако coverslips под такое лечение легко трещины во время впоследствии обработки. 70% этанол замачивания является эффективным в стерилизации coverslips стекла без их повреждения.
    3. С крышкой охватывает оставьте 24-ну пластины в 37 ° C CO2 инкубатора до использования.
  2. Клетки семян
    1. Культура НеЬа клетки (далее) в T-25 колбу в DMEM дополнена 10% плода Bovine сыворотки (FBS) (далее полного среднего) в инкубатор 37 ° C CO2 поставляется с 5% CO2. Здесь не нужны антибиотики.
    2. Когда клетки достигает ~ 80% confluency, аспирационная питательной среды. Добавить 1 мл 0,25% трипсина-ЭДТА в колбу и инкубации клеток в 37 ° C CO2 инкубатора для полного среднего 2 мин добавить 1 мл в колбу и осторожно промойте клетки от стены колбу, закупорить.
    3. Отдельные клетки перехода к стерильной центрифугирования трубки и спина на 500 x g за 2 мин до Пелле клетки. Аспирационная супернатант и приостановить Пелле клеток в 1 мл полного среднего.
    4. Аспирационная среднего в хорошо 24-ну пластины, содержащий стерилизованные стеклянные coverslip и семян ~ 1 x 105 клеток в колодец. Пополните объем колодец с полным средне-0,5 мл. Инкубируйте в 37 ° C CO2 инкубатора поставляется с 5% CO2. Культура клетки ~ 80% confluency.
  3. Transfect клетки
    Примечание: Хорошо распространение клетки являются выгодными для визуализации дисперсной Гольджи мини стеки.
    1. Transfect ~ 80% вырожденная клетки с 80 ng Галт mCherry7 и 320 нг TPST1-EGFP (см. Таблицу материалы) ДНК плазмиды с помощью трансфекции реагент согласно протоколу, предоставляемых производителем. Инкубируйте в инкубатор 37 ° C CO2 . Изменения среды после 4-6 ч инкубации. Клетки готовы ~ 12 h позже.
  4. Лечение Нокодазол для создания Гольджи мини стеки
    1. Подготовьте раствор Нокодазол (33 мм) путем растворения порошка Нокодазол 10 мг в 1 мл диметилсульфоксида. Алиготе Стоковый раствор и хранить при-20 ° C для длительного хранения.
    2. Разбавьте 1 мкл Нокодазол раствор (33 мм) в 1 мл 37 ° C полного среднего (конечная концентрация 33 мкм). Центрифуга для удаления твердых частиц с максимальной скоростью.
    3. Аспирационная среднего в хорошо и добавить 0,5 мл 33 Нокодазол мкм, содержащие полного среднего. Инкубируйте клетки в 37 ° C CO2 инкубатора для 3 h. приступить к иммунофлюоресценции маркировки (раздел 1.5).
  5. Этикетировочный иммунофлуоресценции
    Примечание: Держать клетки в темноте, чтобы избежать Фотообесцвечивание Галт mCherry и TPST1-EGFP.
    1. Подготовка реагентов для Этикетировочный иммунофлуоресценции
      1. Подготовить раствор параформальдегида 4%, растворить порошок параформальдегида 4% (w/v) в горячей 1 X-фосфатный буфер (PBS) и фильтра решение через 0.45 мкм фильтром. Раствор можно хранить при температуре от-20 ° C.
        Предупреждение: Параформальдегида токсичных и канцерогенных и это может вызвать раздражение кожи. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ).
      2. Чтобы подготовить буфером для разбавления проб флуоресцирования (FDB), смешайте 5% (v/v) FBS и 2% (w/v) бычьим сывороточным альбумином (БСА) в однократном ПБС. Фильтр решение через 0.45 мкм фильтром и сохранить решение при-20 ° C.
      3. Растворите 5.35 g NH4Cl порошка в 1 Л воды 100 мм NH4Cl подготовить и сохранить решение при комнатной температуре.
      4. Растворите порошок сапонин 10% (w/v) в воде для подготовки 10% сапонинов, аликвота и сохранить решение при-20 ° C.
    2. Фиксация
      1. Промыть хорошо раз с 0,5 мл 1 x PBS раствор и добавить 0,5 мл 4% раствора параформальдегида. Проинкубируйте втечение 20 мин при комнатной температуре. Промыть скважину дважды с PBS 1 x 0,5 мл и дважды с 0,5 мл 100 мм NH4Cl. промыть скважину дважды с PBS 1 x 0.5 мл. Клетки могут храниться в однократном ПБС на 4 ° C на ночь в темноте.
    3. Маркировка флуоресцирования
      1. Разбавьте 1 мкл мыши анти GM130 основное антитело в 500 мкл FDB содержащий 0.1% сапонинов. Обратный крышка плиты 24-Ну и применять 10 мкл основное антитело смесь на крышке.
      2. Используйте пинцет острый для извлечения и передачи coverslip стекла на падение обеспечения смесь антител, которое стороны ячейки находится в контакте с смеси. Инкубируйте клетки с основное антитело смеси за 1 ч при комнатной температуре.
        Примечание: Крышка с coverslip могут помещаться в увлажненные пластиковый мешок в темноте.
      3. Используйте острые пинцет для извлечения и передачи coverslip колодец с ячейки стороной вверх и промойте его в PBS 1 x 0.5 мл три раза в ≥ 30 мин встряхивания нет необходимости.
      4. Разбавьте 1 мкл far-red Флюорофор конъюгированных коза анти мыши IgG (вторичное антитело) в 500 мкл FDB содержащий 0.1% сапонинов.
      5. Вымыть и очистить обратную поверхность крышки 24-ну пластины. Примените 10 мкл far-red вторичное антитело смесь на крышке. Повторите шаги 1.5.3.2 - 1.5.3.3.
    4. Монтаж
      1. Подготовка монтажа средних путем смешивания 1 г глицерина, 2,2 g poly(vinyl alcohol) (МВт ~ 31000 Da), 1,2 мл 1 М трис (рН 8) и 8,8 мл H2O. Растворение смеси в ванну воды 60 ° C с иногда vortexing. Хранят раствор при температуре-20 ° C.
      2. Оттепель монтажа средних и передачи 10 мкл на стеклянное скольжение. Наложение coverslip (клеток стороной вниз) на падение среднего монтажа. Инкубируйте стеклянное скольжение при 37 ° C за 30 мин или комнатной температуре в течение 1 ч для упрочнения монтажа средних. Уплотнение coverslip с бесцветным лаком и хранить стеклянное скольжение при-20 ° C.

2. Подготовка флуоресцентные бусы для коррекции хроматической сдвига

  1. Coverslip очистка
    1. Осторожно поместите кусок 25 мм No.1.5 стеклянные coverslip на пластиковую решетку.
    2. Передача стойку с coverslip 400 мл стакан наполнен 300 мл 1 M NaOH и sonicate в sonicator баня (35 Вт) для 15 минут кратко ополосните шкаф в 400 мл стакан заполнены с 300 мл деионизированной водой. Передача стойки для 400 мл стакан, наполненный 300 мл 99% этанола и sonicate в sonicator баня на 15 мин кратко ополосните шкаф в 400 мл стакан заполнены с 300 мл деионизированной водой.
    3. Повторите шаг 2.1.2 еще два раза.
    4. Промывайте стойку с coverslip в 300 мл деионизированной воды в стакан 400 мл на 10 мин повторить шаг еще два раза. Передача стойки до 60 ° C духовку и сухой coverslip за 1 ч. хранить сушеные coverslip в чашке Петри пыли.
  2. Иммобилизация флуоресцентные бусы на стекло coverslip
    1. Разбавьте 110 Нм бусины многоцветные флуоресцентный 80-fold в 1 x PBS содержащих 0,1 мкг/мкл рабочего раствора БСА. Кратко вихревой трубе разогнать шарик агрегатов. Распространение 60 мкл разбавленный бусы на очищенный Φ 25 мм No.1.5 стекло coverslip (см. раздел 2.1) с помощью кончика пипетки. Сухой coverslip в эксикатор, подключенных к вакуумного насоса в темноте и смонтировать coverslip на стекло слайд в 50 мкл монтажа среде (см. шаг 1.5.4.2).

3. изображение приобретение

Примечание: GLIM требует изображений высокое соотношение сигнал шум (SNR) для высокой точности расчета центра масс. Изображение может быть приобретена обычных Микроскопы, таких как лазерное сканирование конфокальный, вращающийся диск конфокальный или поля микроскопа. Микроскоп поля с план apochromatic объективов и низкий уровень шума изображения датчик, например зарядовой (связью ПЗС) и научных взаимодополняющих металло оксидных полупроводников (sCMOS) может быть использован. Параметры датчика изображения корректируются для обеспечения низкого чтения шум и высокий динамический диапазон. Микроскоп должны быть оборудованы оптимальной конфигурации флуоресценции фильтры для зеленого, mCherry и far-red Флюорофор, и он должен иметь незначительное флуоресценции кросс talk. В идеале, система электронного фотографирования достигает Найквиста дискретизации в x, y и z ось, которая обычно требует x, y и z размер voxel будет меньше, чем 100, 100 и 200 Нм, соответственно. X и y размер voxel всегда равны и называются pixel_size. Pixel_size можно рассчитать путем деления размера сенсора камеры системы масштаба.

  1. Бисер многоцветные изображения
    1. Бисер многоцветные изображения в зеленый, красный и far-red каналы в начале и в конце каждой сессии изображений.
      Примечание: Здесь, изображения были приобретены через обычные epi поля флуоресценции микроскоп (перевернутый) оснащен 100 X NA 1.4 план apochromatic цель, моторизованного столика, 200 Вт источник света-металлогалогенные и 16-разрядных sCMOS камеры. Длин волн для возбуждения фильтр (band pass), дихроичное зеркало (длинный пас) и фильтр (band pass) выбросов Куба фильтр зеленого канала являются 465-495, 505 и 515-555 Нм; те, для красного канала фильтр Куба, 528-553, 565 и 578-633 нм; и те для куба фильтр far-red канала 590-650, 660 и 663-738 Нм. Во время приобретения, размер voxel вдоль x, y и z оси — 64, 64 и 200 Нм, соответственно.
    2. Найдите поле зрения с хорошим шарик плотности.
    3. Приобрести стеки 3D изображений в зеленый, красный и far-red каналов (каналG, каналR, каналB, соответственно). Возьмите 3 секции выше и ниже лучших фокальной плоскости (7 секций в стек). Сохраните три стеки как три TIFF-файлы.
      Примечание: Время экспозиции для каждого канала определяется эмпирически увеличить динамический диапазон, избежать насыщения пикселей и свести к минимуму Фотообесцвечивание. Другие параметры, такие как фильтры и x, y и z размер voxel, выбираются, как описано выше.
  2. Гольджи мини стеки изображений
    1. Использование TPST1-EGFP Галт mCherry transfected и дневно помечены слайды (раздел 1.5), чтобы найти ячейки, что Экспресс TPST1-EGFP и низким или средним уровнем Галт mCherry. Приобрести стеки 3D изображений, как описано в пункте 3.1.3.

4. анализ

  1. Приобрести центры флуоресцентные бусины
    1. В ImageJ, откройте набор изображений из бисера, состоящий из трех файлов TIFF (файл > изображения > Открыть).
    2. Средняя 3 последовательных секции вокруг лучших целенаправленного секции в каналеR изображение > стеки > Z проекта. Введите номер раздела «Начало фрагмента» и «Остановить срез» и среди вариантов «проекции типа», выберите «Средней интенсивности».
    3. Нарисуйте регионах, представляющих интерес (ROI), которые содержат не бисер в изображения с помощью «Многоугольник выбора». В «анализ > набор измерений», только «Среднее значение серого» и «Отклонение». Затем выполнить «анализ > мера» для получения среднего и SD ROI.
    4. Рассчитать интенсивность фона как «средний + 6 × SD». Вычесть изображение с соответствующими значениями интенсивности фон, «процесс > математика > вычесть», введите значение интенсивности фона, соответствующий этому каналу.
    5. Повторите шаги 4.1.2 для 4.1.4 для каналаG и каналB стеки изображений с помощью же начать и остановить срез и тот же фон ROI. Обратите внимание, что ROI используется в шаге 4.1.3 могут быть скопированы в каналG и каналB образы.
    6. Слияние трех вычитается фонового изображения (изображение > Цвет > объединить каналы), выбрав каналR как красный, каналG как Грин и каналB как синий. Будет получен один составное изображение, состоящее из трех каналов.
    7. Запустите Менеджер ROI (анализ > Инструменты > Менеджер ROI). Рисование квадратного ROI вокруг единого бусы, обеспечение того, что существует только один шарик внутри каждой ROI. Добавьте ROI рентабельность менеджер, нажав «t» на клавиатуре. Повторите этот процесс и добавить столько ROIs как можно скорее.
    8. В «анализ > набор измерений», проверить только «центр масс».
    9. Выберите каналR, в диспетчере ROI, нажмите кнопку «Измерение» для получения центры; две колонки соответствующий x и y координаты центров ROI будет отображаться в окне «Результат». Скопируйте и вставьте два столбца в таблицу.
    10. Повторите шаг 4.1.9 дляG и каналB.
    11. Организовать координаты центров в одну таблицу в следующем порядке: xR,R, y xG, yG,B, x и yB. Сохраните эту таблицу в формате «CSV» как «beads.csv». Не оставляют места в имени файла.
  2. Выберите и измерить Гольджи мини стеки
    1. Установите два макроса (см. Дополнительные материалы) в ImageJ, «Макро-Гольджи ROI инспекция» и «Макро-выпуск 3 канала данных» плагины > установить». Четкие ROI менеджер и результат окна.
    2. Откройте набор мини-стек изображений Гольджи, состоящий из трех файлов TIFF (файл > изображения > Open).
    3. Повторите шаги 4.1.2 - 4.1.5 и сохранить три вычитается фонового изображения для последующего использования. Запись фон SDs для каналаR, каналG и каналB как SDRиG SD SDB, соответственно, позднее использовать.
    4. Дублировать три вычитается фон изображения, сгенерированные из шага 4.2.3 (Ctrl + Shift + D).
    5. В «процесс > изображения калькулятор», сначала необходимо добавить фон вычитается каналG каналR изображений. Добавьте полученное изображение изображение вычитается фон каналаB . На результирующее изображение в «изображение > Настройка > порог», выберите «установить» для ввода «1» как «Низкий пороговый уровень». После нажатия кнопки «Применить», приводится чёрно-белое изображение двоичные.
    6. В «анализ > анализ частиц», диапазон размера для «размер (пиксель ^ 2)». Ввод «50-бесконечности». Проверить «Исключая на краях» и «Менеджер». Трансформирования, содержащие Гольджи мини стеки теперь добавляются к диспетчеру ROI.
      Примечание: Диапазон размеров должны быть эмпирически решимости исключить звуки, которые обычно малы.
    7. Слияние трех вычитается фонового изображения (изображение > Цвет > объединить каналы) из шага 4.2.3, выбрав каналR как красный, каналG как Грин и каналB как синий. Генерируется один составное изображение, состоящее из трех каналов.
    8. Запустите макрос «Макро-Гольджи ROI инспекция», выбрав «плагины > макро-Гольджи ROI инспекции». В диалоговом окне Интерактивные визуально проверьте каждый ROI, чтобы сохранить или отклонить его. Выберите трансформирования, которые содержат один объект во всех трех каналах.
      Примечание: После запуска этого инструмента, отклоненные трансформирования, исключаются из диспетчера ROI.
    9. Проверить только «Район», «Среднее значение серого» и «Центр масс» «анализ > набор измерений». Приобретение данных путем запуска макрос инструмент «Макро-выпуск 3 канала данных» (плагины > макро-выпуск 3 каналы данных).
      Примечание: Районы, средней интенсивности и центры трансформирования в каналR,G канал и каналB (x и y) отображаются в окне «Результат».
    10. Копия x и y координаты центров в электронную таблицу и расположить их в следующем порядке: xR,R, y xG, yG,B, x и yB. Сохраните электронную таблицу как файл «CSV» (ministacks.csv). Не оставляют места в имени файла. Перейти к коррекции хроматической сдвиг центров (раздел 4.3) и LQ вычисления (статья 4.4).
  3. Коррекции хроматических сдвиг центров
    1. Установите время выполнения компилятор Matlab (мкр).
    2. Установить следующие файлы в выделенный рабочую папку: my_train.exe и my_test.exe. Скопируйте и вставьте «beads.csv» и «ministacks.csv» файлы в той же папке.
    3. Запуск «Команднойстроки» Windows и перейдите в рабочую папку, введя следующую команду « cd path_of_working_folder».
    4. Создайте файл хроматической сдвига калибровки с помощью центров бисера. Введите следующую команду «my_train.exe бусы.csv калибровки.mat 1». В рабочей папке создается файл с именем «калибровка.mat». Игнорируйте другие файлы, которые создаются.
    5. Исправьте хроматические смещение центров Гольджи мини стеки, введя следующую команду «my_test.exe ministacks.csv corrected_ministacks.csv калибровки.mat 1».
      Примечание: Файл с именем «corrected_ministacks.csv» создается в рабочей папке. Он содержит хроматические сдвиг скорректированные координаты центров, которые расположены в порядке xG, yG, x yBиB . Игнорируйте другие файлы, которые создаются. Принять к сведению, что красный канал определяется как свободный хроматических аберраций и, следовательно, xR и yR такие же, как необработанные данные.
  4. Расчет LQs
    1. Запуск программного обеспечения для анализа данных и копирования и вставки, в ниже последовательности, значит, серые значения, районы, фон SDs, полученные из шага 4.2.3 (место их в строке 1) и исправить хроматические сдвига x и y координаты Гольджи мини-стеков в каналеR в лист как столбцы A-е. Аналогичным образом передать соответствующие данные дляG и каналB столбцы F, J и K-O, соответственно.
    2. Добавьте восемь новых столбцов P W, под названием «Комплексная интенсивность канала R», «комплексной интенсивность канала G», «комплексной интенсивность канала B», d1, dx, ABS(tan a), ABS (загар b) и LQ.
      1. Щелкните правой кнопкой мыши в верхней части соответствующих столбцов и выберите пункт «Установка значений столбцов» для вычисления значения каждого столбца. Для столбца P, ввод «Col(A)Col(B)»; для столбца Q, ввод «Col(F)Col(G)»; для столбца R, ввод «Col(K)Col(L)»; для столбца S, ввод «pixel_size*Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))» «pixel_size», где размер пикселя в Нм; для столбца T, ввод «pixel_size*((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2)/(2Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O)))»; для столбца U, ввод «Abs(Tan(Acos((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2) / (2 Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) «; для столбца V, ввод «Abs(Tan(Acos((Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2) / (2 Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) «; для столбца W, ввод «Коль (T) / Col (S)».
    3. Фильтр по трем критериям, описанным в ВведениеГольджи мини стеки.
      1. В программное обеспечение анализа данных, перейдите к «лист > лист запроса» и выберите столбец переменные для теста «Если». Назначить следующие псевдонимы I1, I2, I3, d1, A и B для столбцов «комплексной интенсивность канала R», «комплексной интенсивность канала G», «комплексной интенсивность канала B», d1, ABS(tan a) и ABS (загар b), соответственно. В «если условие» поле ввода «I1 > =30*cell(1,3) и I2 > =30*cell(1,8) и I3 > =30*cell(1,13) и d1 > = 70 и (A < = 0,3 или B < = 0,3)».
      2. Выберите «Извлечь новый лист», нажмите «Применить». Столбцы A-W анализируемые Гольджи мини-стеков извлекаются на новый лист.
    4. В новый лист, щелкните правой кнопкой мыши в верхней части колонки W, выберите «статистические данные о столбце > открыть диалоговое окно». Флажок «N всего», «Среднее», «SE среднее», «Гистограммы». Статистический анализ LQs затем отображается.

Результаты

Современные исследования класс световой микроскоп с объективом apochromatic план, как он используется в нашей лаборатории, показывает минимальный хроматические аберрации (рисA). Однако тщательного изучения флуоресцентные шарик многоцветные изобр...

Обсуждение

Ранее локализация белка Гольджи под световой микроскопии главным образом была количественно оценена степень корреляции или дублирование изображения белка с изображением Гольджи маркер известных локализации15,16, 17. Результате коррел...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить D. Стивенс (Бристольский университет, Бристоль, Соединенное Королевство) за TPST1-EGFP ДНК плазмиды, а также Лакшми Нарасимхан ГОВИНДАРАДЖАН за помощь в оптимизации программного обеспечения. Эта работа была поддержана субсидии от национального совета медицинских исследований (NMRC/CBRG/007/2012), министерства образования (AcRF Tier1 RG 18/11, RG 48/13 и RG132/15 и AcRF Tier2 MOE2015-T2-2-073) л.л.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beadsInvitrogenT7279As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope
Glass coverslip Φ 12 mm (No. 1.5)MenzelCB00120RAC
Glass coverslip Φ 25 mm (No. 1.5)Menzel
DMEMCapriconDMEM-HPA-P50
Trypsin-EDTA
FBSGE HycloneSV30160.03
NocodazoleMerck487928
transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019
transfection medium. Commercial name: OptiMEMInvitrogen31985070
TPST1-EGFPAddgene66617A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom)
GalT-mCherryMade in our lab
paraformaldehydeMerck1.04005.1000
saponinSigma-Aldrich47036
poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488CALBIOCHEM475904
BSASigma-AldrichA9647
Mouse anti-GM130BD Biosciences610823Primary antibody for human GM130
far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgGInvitrogenA-21235Far red fluorescence conjugated secondary antibody

Ссылки

  1. Glick, B. S., Luini, A. Models for Golgi traffic: a critical assessment. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005215 (2011).
  2. Klumperman, J. Architecture of the mammalian Golgi. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).
  3. Lu, L., Hong, W. From endosomes to the trans-Golgi network. Semin Cell Dev Biol. , (2014).
  4. De Matteis, M. A., Luini, A. Exiting the Golgi complex. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 273-284 (2008).
  5. Lu, L., Ladinsky, M. S., Kirchhausen, T. Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis. Mol Biol Cell. 20 (15), 3471-3480 (2009).
  6. Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol. 190 (2), 165-175 (2010).
  7. Tie, H. C., et al. A novel imaging method for quantitative Golgi localization reveals differential intra-Golgi trafficking of secretory cargoes. Mol Biol Cell. 27 (5), 848-861 (2016).
  8. Trucco, A., et al. Secretory traffic triggers the formation of tubular continuities across Golgi sub-compartments. Nat Cell Biol. 6 (11), 1071-1081 (2004).
  9. Cole, N. B., Sciaky, N., Marotta, A., Song, J., Lippincott-Schwartz, J. Golgi dispersal during microtubule disruption: regeneration of Golgi stacks at peripheral endoplasmic reticulum exit sites. Mol Biol Cell. 7 (4), 631-650 (1996).
  10. Rogalski, A. A., Bergmann, J. E., Singer, S. J. Effect of microtubule assembly status on the intracellular processing and surface expression of an integral protein of the plasma membrane. J Cell Biol. 99 (3), 1101-1109 (1984).
  11. Van De Moortele, S., Picart, R., Tixier-Vidal, A., Tougard, C. Nocodazole and taxol affect subcellular compartments but not secretory activity of GH3B6 prolactin cells. Eur J Cell Biol. 60 (2), 217-227 (1993).
  12. Nakamura, N., et al. Characterization of a cis-Golgi matrix protein, GM130. J Cell Biol. 131, 1715-1726 (1995).
  13. Roth, J., Berger, E. G. Immunocytochemical localization of galactosyltransferase in HeLa cells: codistribution with thiamine pyrophosphatase in trans-Golgi cisternae. J Cell Biol. 93 (1), 223-229 (1982).
  14. Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. J Cell Biol. 105 (6), 2655-2664 (1987).
  15. Honda, A., Al-Awar, O. S., Hay, J. C., Donaldson, J. G. Targeting of Arf-1 to the early Golgi by membrin, an ER-Golgi SNARE. J Cell Biol. 168 (7), 1039-1051 (2005).
  16. Lavieu, G., Zheng, H., Rothman, J. E. Stapled Golgi cisternae remain in place as cargo passes through the stack. Elife. 2, 00558 (2013).
  17. Zhao, X., Lasell, T. K., Melancon, P. Localization of large ADP-ribosylation factor-guanine nucleotide exchange factors to different Golgi compartments: evidence for distinct functions in protein traffic. Mol Biol Cell. 13 (1), 119-133 (2002).
  18. Dejgaard, S. Y., Murshid, A., Dee, K. M., Presley, J. F. Confocal microscopy-based linescan methodologies for intra-Golgi localization of proteins. J Histochem Cytochem. 55 (7), 709-719 (2007).
  19. Fourriere, L., Divoux, S., Roceri, M., Perez, F., Boncompain, G. Microtubule-independent secretion requires functional maturation of Golgi elements. J Cell Sci. 129 (17), 3238-3250 (2016).
  20. Volchuk, A., et al. Countercurrent distribution of two distinct SNARE complexes mediating transport within the Golgi stack. Mol Biol Cell. 15 (4), 1506-1518 (2004).
  21. Popoff, V., Adolf, F., Brugger, B., Wieland, F. COPI budding within the Golgi stack. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005231 (2011).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

126

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены